ГОСТ 32150-2013. Межгосударственный стандарт. Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Метод определения жирно-кислотного состава
(введен в действие Приказом Росстандарта от 08.11.2013 № 1520-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 1 июля 2015 года.
ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ
flowchart LR n0["ГОСТ Р 54055-2010"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-54055-2010" "ГОСТ Р 54055-2010. Национальный стандарт Российской Федерации. Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Метод определения жирно-кислотного состава (утв. и введе" n1["ГОСТ 32150-2013"]:::doc click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-32150-2013" "ГОСТ 32150-2013. Межгосударственный стандарт. Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Метод определения жирно-кислотного состава (введен в действие Приказом Ро" n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 ноября 2013 г. № 1520-ст
ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ ПЕРЕРАБОТКИ ЯИЦ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПТИЦЫ
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЖИРНО-КИСЛОТНОГО СОСТАВА
Food eggs and foodstuffs of processed poultry eggs. Method for determination of fatty acid composition
Дата введения 1 июля 2015 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1. Подготовлен Государственным научным учреждением Всероссийским научно-исследовательским институтом птицеперерабатывающей промышленности Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПП Россельхозакадемии).
2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 116).
3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 25 марта 2013 г. № 55-П).
4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 8 ноября 2013 г. № 1520-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32150-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2015 г.
5. Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 54055-2010.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на пищевые яйца и пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы (жидкие, концентрированные и сухие — яичная масса, яичный меланж, яичный желток) (далее — продукты) и устанавливает газохроматографический метод определения жирно-кислотного состава — массовой доли индивидуальных жирных кислот.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:
ГОСТ ИСО 5725-1-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности
ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования
ГОСТ 12.1.019-79 Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3022-80 Водород технический. Технические условия
ГОСТ 3118-77 Реактивы. Кислота соляная. Технические условия
ГОСТ 3956-76 Силикагель технический. Технические условия
ГОСТ 4166-76 Реактивы. Натрий сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4233-77 Реактивы. Натрий хлористый. Технические условия
ГОСТ 5829-71 Реактивы. Ацетил хлористый. Технические условия
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 6995-77 Реактивы. Метанол-яд. Технические условия
ГОСТ 9147-80 Посуда и оборудование лабораторные фарфоровые. Технические условия
ГОСТ 9293-74 Азот газообразный и жидкий. Технические условия
ГОСТ 11109-90 Марля бытовая хлопчатобумажная. Общие технические условия
ГОСТ 14919-83 Электроплиты, электроплитки и жарочные электрошкафы бытовые. Общие технические условия
ГОСТ 17433-80 Промышленная чистота. Сжатый воздух. Классы загрязненности
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 26703-93 Хроматографы аналитические газовые. Общие технические условия и методы испытаний
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 31469-2012 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы физико-химического анализа
ГОСТ 31654-2012 Яйца куриные пищевые. Технические условия
ГОСТ 31655-2012 Яйца пищевые (индюшиные, цесариные, перепелиные, страусиные). Технические условия
ГОСТ 31663-2012 Масла растительные и жиры животные. Определение методом газовой хроматографии массовой доли метиловых эфиров жирных кислот
ГОСТ 31720-2012 Пищевые продукты переработки яиц сельскохозяйственной птицы. Методы отбора проб и органолептического анализа.
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Термины и определения
В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:
3.1. Пищевые яйца (сельскохозяйственной птицы): яйца в скорлупе, произведенные сельскохозяйственной птицей, пригодные для непосредственного потребления человеком и переработки с целью получения продуктов питания.
Примечание. Пищевые яйца в зависимости от вида птицы могут подразделять, например, на куриное, перепелиное, индюшиное.
3.2. Пищевой продукт переработки яиц (сельскохозяйственной птицы): пищевой продукт, полученный в промышленных условиях в результате проведения комплекса технологических процессов и/или операций, изменяющих начальные свойства пищевого яйца сельскохозяйственной птицы.
3.3. Яичный меланж: пищевой продукт переработки яиц сельскохозяйственной птицы, полученный из яичной массы, прошедшей фильтрацию, гомогенизацию и пастеризацию.
3.4. Купажированный яичный меланж: яичный меланж заданного состава, полученный из яичной массы с добавлением яичного белка или яичного желтка.
3.5. Яичный желток [белок]: пищевой продукт переработки яиц сельскохозяйственной птицы, полученный из желточной [белковой] массы, прошедшей фильтрацию, гомогенизацию и пастеризацию.
3.6. Жидкий яичный меланж [белок, желток]: яичный меланж [белок, желток], выработанный без добавления или удаления воды.
3.7. Концентрированный яичный меланж [белок]: жидкий яичный меланж [белок], из которого частично удалена вода до достижения в нем установленной для данного продукта значения массовой доли сухих веществ, занимающей промежуточное положение между значениями данного показателя жидкого и сухого продуктов.
3.8. Охлажденный яичный меланж [белок, желток]: жидкий яичный меланж [белок, желток] или концентрированный яичный меланж [белок], подвергнутый охлаждению, с температурой в толще продукта от 0 °C до 4 °C.
3.9. Замороженный яичный меланж [белок, желток] (нрк. мороженый яичный продукт): жидкий яичный меланж [белок, желток] или концентрированный яичный меланж [белок], подвергнутый замораживанию, с температурой в толще продукта не выше минус 12 °C.
3.10. Глубокозамороженный яичный меланж [белок, желток]: жидкий яичный меланж [белок, желток] или концентрированный яичный меланж [белок], подвергнутый замораживанию, с температурой в толще продукта не выше минус 18 °C.
3.11. Сухой яичный меланж [белок, желток] (нрк. сухой порошок): жидкий яичный меланж [белок, желток] или концентрированный яичный меланж [белок], из которого удалена вода до достижения в нем значения массовой доли сухих веществ 95% и более.
3.12. Ферментированный яичный меланж [белок, желток]: яичный меланж [белок, желток], полученный в результате воздействия ферментов с целью изменения его функциональных свойств.
3.13. Обессахаренный яичный меланж [белок, желток]: яичный меланж [белок, желток], полученный в результате применения технологических операций по удалению содержащихся в нем сахаров.
3.14. Подкисленный яичный меланж [белок, желток]: яичный меланж [белок, желток], полученный в результате применения технологических операций по введению в его состав регуляторов кислотности.
3.15. Полуфабрикат из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы: пищевой продукт, изготовленный в промышленных условиях непосредственно из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы в скорлупе или без нее, подготовленный к дальнейшей кулинарной обработке.
1. Полуфабрикат из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы может быть изготовлен с добавлением определенных рецептурой ингредиентов, например, животного и/или растительного происхождения.
2. В зависимости от термической обработки полуфабрикат из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы может быть охлажденным, замороженным, глубокозамороженным.
3.16. Полуфабрикат из яичного меланжа [белка, желтка]: пищевой продукт, изготовленный в промышленных условиях из яичного меланжа [белка, желтка], подготовленный к дальнейшей кулинарной обработке.
1. Полуфабрикат из яичного меланжа [белка, желтка] может быть изготовлен с добавлением определенных рецептурой ингредиентов, например, животного и/или растительного происхождения.
2. В зависимости от термической обработки полуфабрикат из яичного меланжа [белка, желтка] может быть охлажденным, замороженным, глубокозамороженным.
3.17. Кулинарное изделие из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы: пищевой продукт, изготовленный в промышленных условиях непосредственно из яиц сельскохозяйственной птицы в скорлупе или без нее, подвергнутый кулинарной обработке и готовый к употреблению.
1. В зависимости от кулинарной обработки кулинарное изделие из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы может быть, например, вареным, жареным.
2. В зависимости от термической обработки кулинарное изделие из пищевых яиц сельскохозяйственной птицы может быть охлажденным, замороженным, глубокозамороженным.
3.18. Кулинарное изделие из яичного меланжа [белка, желтка]: пищевой продукт, изготовленный в промышленных условиях из яичного меланжа [белка, желтка], подвергнутый кулинарной обработке и готовый к употреблению.
1. В зависимости от кулинарной обработки кулинарное изделие из яичного меланжа [белка, желтка] может быть, например, вареным, жареным.
2. В зависимости от термической обработки кулинарное изделие из яичного меланжа [белка, желтка] может быть охлажденным, замороженным, глубокозамороженным.
4. Метрологические характеристики метода
4.1. Измерение массовой доли индивидуальных жирных кислот по отношению к сумме всех жирных кислот (метод внутренней нормализации)
Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 1.
4.2. Измерение массовой доли индивидуальных жирных кислот в липидах из экстрагированных продуктов (метод внутреннего стандарта)
Метрологические характеристики метода при доверительной вероятности 0,95 приведены в таблице 2.
5. Сущность метода
Сущность метода состоит в экстракции липидов из продуктов, получении метиловых эфиров жирных кислот переэтерификацией экстрагированных липидов с помощью кислотного катализатора (хлористый водород) в присутствии избытка метилового спирта, разделении смеси полученных метиловых эфиров методом капиллярной газовой хроматографии и измерении площадей хроматографических пиков.
Массовую долю индивидуальной жирной кислоты относительно суммы масс всех жирных кислот определяют отношением площади пика метилового эфира кислоты к сумме площадей идентифицированных хроматографических пиков всех метиловых эфиров жирных кислот (метод внутренней нормализации), массовую долю содержания индивидуальной жирной кислоты в липидах яичных продуктов определяют отношением площади пика метилового эфира кислоты к площади пика внутреннего стандарта (метод внутреннего стандарта).
6. Средства измерений, оборудование, материалы и реактивы
Газовый хроматограф с пламенно-ионизационным детектором (ПИД), пределом детектирования не более 5·10-12 г/с по ГОСТ 26703, оснащенный инжектором для капиллярных колонок с делением потока и управляющим вычислительным комплексом с программным обеспечением, позволяющим проводить разметку и определение площадей хроматографических пиков.
Капиллярная хроматографическая колонка с неподвижной фазой из сшитого полиэтиленгликоля длиной 30 м, с внутренним диаметром 0,32 мм и толщиной фазы 0,25 мкм или аналогичная колонка, обеспечивающая разделение пиков и продолжительность хроматографирования в соответствии с рисунком 1. Условия хроматографирования — в соответствии с 7.4.
1 — бутилокситолуол; 2 — C14:0; 3 — C14:1n5; 4 — C16:0; 5 — C16:1n7; 6 — C17:0; 7 — C17:1; 8 — C18:0; 9 — C18:1n9; 10 — C18:1n7; 11 — C18:2n6; 12 — C18:3n3; 13 — C20:0; 14 — C20:1n9; 15 — C20:3n6; 16 — C20:4n6; 17 — C20:5n3; 18 — C23:0 (внутренний стандарт); 19 — C22:5n3; 20 — C22:6n3
Рисунок 1. Хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот липидов куриного яйца (колонка Omegawax 320 (Supelco))
Микрошприцы МШ-1 вместимостью 1 мм3 или аналогичные.
Ротационный испаритель типа ИР-2.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой погрешности взвешивания не более +/- 0,0002 г.
Плитка электрическая по ГОСТ 14919.
Термостат суховоздушный типа ТС-80М или жидкостной термостат, обеспечивающий поддержание заданной температуры при (60 +/- 1) °C.
Термометр ртутный с диапазоном измерения температуры 0 °C — 100 °C и ценой деления шкалы 1 °C по ГОСТ 28498.
Автоклав с фторопластовой реакционной камерой рабочим объемом 25 — 30 см3 (например, аналитический автоклав — модель Т11 НПО «Анкон-АТ») или стеклянная виала вместимостью 25 — 35 см3 с завинчивающейся крышкой и фторопластовой прокладкой.
Колбы конические Кн-1-150-29/32 ТХС по ГОСТ 25336.
Колбы грушевидные Гр-100-14/23 ТХС по ГОСТ 25336.
Колбы мерные 2-25-1 и 2-100-1 по ГОСТ 1770.
Воронки В-36-50 ХС и В-56-80 ХС по ГОСТ 25336.
Воронки делительные ВД-1-250 ХС или ВД-3-250 ХС по ГОСТ 25336.
Пипетки 2-2-5, 2-2-25 или 2-2-20 по ГОСТ 29169.
Пипетки 1-1-1(2)-1 по ГОСТ 29227.
Пробирки П-2-5-14/23 ХС, П-2-25-14/23 ХС по ГОСТ 1770 или П4-5-14/23, П4-25-14/23 по ГОСТ 25336.
Стаканы В-1-50 ХС и В-1-100 ХС по ГОСТ 25336.
Холодильник XIII-1-300-29/32 по ГОСТ 25336.
Цилиндры мерные 1-10-2, 1-50-1 и 2-100-1 по ГОСТ 1770.
Ступка фарфоровая с пестиком по ГОСТ 9147.
Марля по ГОСТ 11109.
Воздух класса «0» по ГОСТ 17433. Допускается использовать компрессоры, обеспечивающие необходимые давление и чистоту воздуха согласно инструкции по эксплуатации хроматографа.
Азот газообразный по ГОСТ 9293, ос.ч.
Водород технический марки А по ГОСТ 3022 или электролизный водород от генератора водорода.
Ацетил хлористый (ацетилхлорид) по ГОСТ 5829, ч.д.а.
Метанол по ГОСТ 6995, х.ч.
Бутилокситолуол (2,6-ди-трет-бутил-4-метоксифенол), массовая доля основного вещества не менее 95%.
Метиловый эфир трикозановой кислоты C23:0, массовая доля основного вещества не менее 99,0%.
Раствор в гексане смеси метиловых эфиров жирных кислот (от C10 до C24) для идентификации хроматографических пиков [1], [2].
Натрий сернокислый безводный по ГОСТ 4166, х.ч.
Натрий хлористый по ГОСТ 4233, х.ч., водный раствор массовой долей 10%.
Силикагель марки АСКГ по ГОСТ 3956.
Кислота соляная массовой долей не менее 35% по ГОСТ 3118, ос.ч.
Эфир диэтиловый (эфир этиловый), ос.ч., безводный, содержащий менее 0,05% этилового спирта.
Эфир петролейный перегнанный с температурой кипения не более 60 °C.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками и оборудования с техническими характеристиками не хуже, а также материалов и реактивов по качеству не ниже указанных.
7. Подготовка к проведению испытаний
7.1. Приготовление смеси для получения метиловых эфиров [раствор хлористого водорода (HCl) в метаноле массовой долей 5,6%]
В высокую пробирку с пришлифованной пробкой вместимостью 25 см3 вносят с помощью пипетки 5 см3 метанола. Осторожно по каплям добавляют с помощью пипетки 0,5 см3 ацетилхлорида с соблюдением мер предосторожности по 13.3 (при добавлении ацетилхлорида происходит бурная реакция с образованием брызг, поэтому необходимо использовать высокую пробирку). Перемешивают, закрывают пробкой и выдерживают перед использованием в течение 10 мин.
Смесь готовят непосредственно перед каждым испытанием.
7.2. Приготовление стандартного раствора метилового эфира трикозановой кислоты C23:0 массовой концентрацией 5 мг/см3 (метод внутреннего стандарта)
В стакане вместимостью 50 см3 взвешивают 250 мг метилового эфира трикозановой кислоты с записью результата взвешивания в миллиграммах до одного десятичного знака, добавляют 25 — 30 мг бутилокситолуола (антиокислитель) и растворяют метиловый эфир трикозановой кислоты и бутилокситолуол в 30 см3 толуола (кристаллы метилового эфира трикозановой кислоты должны полностью раствориться, при необходимости стаканчик с содержимым можно подогреть до температуры 30 °C — 40 °C). Содержимое стакана количественно переносят в мерную колбу вместимостью 50 см3. Стакан три раза ополаскивают толуолом порциями по 3 см3, которые добавляют в мерную колбу. Колбу выдерживают до достижения температуры раствора (20 +/- 1) °C, доводят объем толуолом до метки, закрывают пробкой и перемешивают.
Срок хранения стандартного раствора — 1 мес в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.
Перед использованием колбу выдерживают до достижения температуры раствора (20 +/- 1) °C.
7.3 Приготовление раствора бутилокситолуола в толуоле (метод внутренней нормализации)
В стакан вместимостью 100 см3 помещают 25 — 35 мг бутилокситолуола, добавляют с помощью мерного цилиндра 50 см3 толуола и перемешивают до полного растворения бутилокситолуола. Раствор хранят при комнатной температуре в плотно закрытой стеклянной емкости не более 5 мес.
7.4 Приготовление воронки для фильтрования раствора метиловых эфиров жирных кислот
В нижнюю часть носика воронки диаметром 36 мм и высотой 50 мм по ГОСТ Р 25336 вставляют тампон из кусочка обезжиренной стекловаты, насыпают силикагель АСКГ до образования слоя высотой примерно 15 — 20 мм, сверху насыпают слой безводного сернокислого натрия так, чтобы он полностью заполнил носик воронки и нижнюю часть сужения воронки слоем высотой примерно 5 мм.
7.5 Подготовка газового хроматографа и капиллярной колонки
Подготовку хроматографа и капиллярной колонки (кондиционирование колонки) проводят в соответствии с инструкциями по эксплуатации. При работе с капиллярной колонкой Omegawax 320 устанавливают следующий режим работы хроматографа:
- температура детектора 260 °C;
- температура инжектора 250 °C;
- температура термостата колонки 200 °C;
- давление газа-носителя (азота) в испарителе 85 кПа;
- деление потока газа-носителя в испарителе 1:30;
- расходы водорода, воздуха и азота (поддув в детектор) устанавливают в соответствии с инструкцией к эксплуатации хроматографа или подбирают путем хроматографирования тестовых смесей метиловых эфиров для обеспечения максимальной чувствительности пламенно-ионизационного детектора.
Режимы хроматографа при работе с другими типами капиллярных колонок подбирают так, чтобы качество разделения и время регистрации хроматограмм было не хуже показанной на рисунке 1 хроматограммы.
Не реже одного раза в месяц, а также при замене реактивов проводят хроматографирование холостой пробы, приготовленной по 7.6, но без добавления липидов. На хроматограмме холостой пробы не должно быть посторонних пиков, кроме пиков бутилокситолуола и метилового эфира трикозановой кислоты (допускаются посторонние пики непосредственно рядом с пиком растворителя).
7.6 Отбор и подготовка проб
7.6.1. Отбор проб куриных яиц — по ГОСТ 31654, индюшиных, цесариных, перепелиных и страусиных — по ГОСТ 31655, яичных продуктов — по ГОСТ 31720.
7.6.2 Подготовка проб к испытанию
7.6.2.1 Яйца
В стакан вместимостью 500 см3 осторожно разбивают пять-семь куриных или индюшиных яиц, или 10 — 12 перепелиных или цесариных яиц, или два-три страусиных яйца, не допуская попадания в стакан частиц скорлупы. Стеклянной палочкой смешивают желтки с белками и полученную массу гомогенизируют с помощью гомогенизатора или миксера при средней скорости, не допуская вспенивания. Для удаления пленок и мембран гомогенат фильтруют через два слоя марли.
7.6.2.2 Яичные продукты
Подготовку лабораторных проб яичных продуктов проводят по ГОСТ 31720.
Подготовленные пробы хранят до окончания испытания в плотно закрытой стеклянной емкости в холодильнике при температуре от 4 °C до 8 °C.
7.6.3 Кислотный гидролиз пробы
Навеску подготовленной по 7.6.2 пробы массой:
- 5 г жидкого меланжа или перемешанного яйца (яичной массы);
- 3 г жидкого желтка;
- 2 г яичного сухого меланжа или сухого желтка взвешивают каждого продукта соответственно в конической колбе вместимостью 100 см3 с записью результата взвешивания в граммах до третьего десятичного знака и медленно добавляют с постоянным энергичным встряхиванием колбы 10 см3 неразбавленной (жидкие яичные продукты) или разбавленной (сухие яичные продукты) соляной кислоты (смешивают по объему четыре части концентрированной соляной кислоты и одну часть дистиллированной воды), смывая все частицы яичного продукта, приставшие к стенкам колбы, подсоединяют холодильник и помещают в водяную баню, нагретую до температуры (70 +/- 2) °C, доводят до кипения и продолжают кипятить 20 мин, встряхивая колбу через каждые 5 мин. В процессе гидролиза через верхнее отверстие холодильника подают внутрь колбы небольшой поток азота. После окончания гидролиза колбу снимают с водяной бани, добавляют 10 см3 дистиллированной воды и охлаждают до комнатной температуры.
Параллельно из подготовленной по 7.6.2 пробы отбирают навески для определения массовой доли жира по ГОСТ 31469.
7.6.4 Экстракция липидов
Содержимое колбы переносят в цилиндр вместимостью 100 см3, смывая остатки пробы с колбы в цилиндр с помощью 10 см3 дистиллированной воды. В колбу добавляют 25 см3 диэтилового эфира, встряхивают, промывая стенки колбы, и добавляют в цилиндр. Цилиндр с гидролизованной пробой закрывают стеклянной пробкой и энергично встряхивают с переворачиванием цилиндра в течение примерно 1 мин, периодически открывая пробку для сброса давления. Затем осторожно вынимают пробку и добавляют в цилиндр 25 см3 петролейного эфира, ополаскивая эфиром пробку и внутреннюю поверхность шлифа. Цилиндр закрывают пробкой и встряхивают с переворачиванием в течение примерно 30 с. Цилиндр оставляют в покое до полного разделения на водную и прозрачную эфирную фазы с четкой границей между ними. Осторожно вынимают пробку, ополаскивают ее и внутреннюю поверхность шлифа с помощью примерно 5 см3 петролейного эфира так, чтобы он стекал в цилиндр. Отбирают как можно больше верхнего эфирного слоя с помощью пипетки вместимостью 20 или 25 см3 и переносят через воронку с безводным сернокислым натрием в грушевидную колбу вместимостью 100 см3, в которую предварительно добавляют несколько кристаллов бутилокситолуола (используют воронку диаметром 56 мм и длиной 80 мм, в нижнюю часть носика которой помещают тампон из обезжиренной стекловаты и насыпают безводный сернокислый натрий слоем высотой примерно 30 мм).
Растворитель из грушевидной колбы отгоняют под вакуумом на ротационном испарителе (перед сбросом давления в кран впуска воздуха подают поток азота) и затем продувают потоком азота до полного исчезновения запаха растворителя. Экстрагированные липиды хранят в плотно закрытой колбе в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C не более 24 ч. При необходимости более длительного хранения колбу с экстрагированным жиром хранят в морозильной камере при температуре не выше минус 12 °C (срок хранения — не более одной недели).
На всех этапах подготовки пробы и экстракции жира необходимо предохранять пробу от прямого попадания солнечных и ультрафиолетовых лучей.
7.7 Получение метиловых эфиров жирных кислот (метод внутреннего стандарта)
7.7.1. С помощью стеклянной палочки отбирают из колбы экстрагированные липиды (см. 7.6.4), помещают их в предварительно взвешенную фторопластовую реакционную камеру автоклава или стеклянную виалу и взвешивают с записью результата взвешивания в миллиграммах до первого десятичного знака (масса жира должна быть в пределах 40 — 50 мг). В реакционную камеру автоклава или виалу с навеской липидов вносят 1 см3 раствора метилового эфира трикозановой кислоты и бутилокситолуола в толуоле (см. 7.2). Перемешивают для растворения липидов и добавляют смесь, приготовленную по 7.1. Реакционную камеру помещают в автоклав и закрывают крышкой (виалу плотно закрывают завинчивающейся крышкой с фторопластовой прокладкой). Перед закрыванием емкостей их внутренний объем продувают азотом. Автоклав (виалу) с пробой и смесью по 7.1 помещают в предварительно нагретый до (60 +/- 1) °C суховоздушный или жидкостной термостат и выдерживают при этой температуре в течение (80 +/- 2) мин, периодически перемешивая содержимое с интервалом примерно 15 мин.
7.7.2. После окончания термостатирования содержимое реакционной камеры или виалы переносят в пробирку вместимостью 25 см3 [можно использовать пробирку, в которой готовилась реакционная смесь (см. 7.1)]. В реакционную камеру или виалу вносят 3 см3 гексана, закрывают крышкой, энергично встряхивают и смыв добавляют в пробирку. В пробирку добавляют 7 см3 водного раствора хлорида натрия массовой долей 10%, закрывают пробкой, энергично встряхивают с переворачиванием в течение 10 с и оставляют до полного разделения фаз. Верхнюю органическую фазу осторожно отбирают с помощью пипетки вместимостью 5 см3 и пропускают через воронку с силикагелем и сернокислым натрием (см. 7.3), предварительно промытой 3 — 4 см3 гексана (слой силикагеля в воронке должен все время быть смоченным растворителем), собирая фильтрат в пробирку вместимостью 5 см3. После стекания раствора метиловых эфиров из воронки в нее добавляют 2 см3 гексана и фильтрат собирают в эту же пробирку. Окончательный объем раствора метиловых эфиров жирных кислот должен быть примерно 5 — 6 см3.
Срок хранения полученного раствора метиловых эфиров жирных кислот — 48 ч в холодильнике при температуре (6 +/- 2) °C.
7.8 Получение метиловых эфиров жирных кислот (метод внутренней нормализации)
Метиловые эфиры жирных кислот получают по 7.7 со следующим изменением в 7.7.1: в реакционную камеру автоклава или виалу с навеской липидов вместо раствора метилового эфира трикозановой кислоты и бутилокситолуола в толуоле вносят 1 см3 раствора бутилокситолуола в толуоле, приготовленного по 7.3.
8. Проведение измерений
8.1. В испаритель хроматографа вводят 1 мм3 раствора метиловых эфиров жирных кислот, приготовленных по 7.7 (метод внутреннего стандарта) или по 7.8 (метод внутренней нормализации). Хроматографирование проводят дважды. На полученной хроматограмме размечают все пики (кроме пика бутилокситолуола) и с помощью программного обеспечения определяют значения площадей пиков.
9. Обработка результатов
9.1 Идентификация хроматографических пиков
Идентификацию пиков проводят по времени удерживания хроматографических пиков по ГОСТ 31663 или путем сравнения хроматограммы пробы с хроматограммой тестовой смеси метиловых эфиров жирных кислот. На рисунке 1 показана хроматограмма метиловых эфиров жирных кислот, типичная для липидов куриных яиц.
Для интерпретации пиков можно воспользоваться Приложением Б, в котором приведен характерный для куриных яиц перечень жирных кислот, порядок их выхода на хроматограмме (колонка Omegawax 320) и диапазон значений площадей пиков в процентах по отношению к сумме площадей всех пиков метиловых эфиров жирных кислот.
Сумма относительных площадей неидентифицированных пиков не должна превышать 0,5%. Соответствующее значение должно быть указано в протоколе испытаний.
9.2. При определении жирно-кислотного состава методом внутренней нормализации массовую долю индивидуальной жирной кислоты Xk, %, по отношению к сумме масс всех жирных кислот вычисляют по формуле
X_{k} = 100 \cdot \frac{S_{k} \cdot K_{k}}{\sum_{i = 1}^{N} (S_{i} \cdot K_{i})} , (1)
где Sk — площадь хроматографического пика метилового эфира определяемой жирной кислоты;
\sum_{i = 1}^{N} (S_{i} \cdot K_{i}) — сумма площадей всех идентифицированных хроматографических пиков метиловых эфиров жирных кислот с учетом соответствующих поправочных коэффициентов Ki (см. Приложение А);
Kk — поправочные коэффициенты, учитывающие различия в чувствительности детектора ПИД к метиловым эфирам разных жирных кислот и отличия молекулярных масс жирных кислот и их метиловых эфиров (коэффициенты Kk приведены в Приложении А);
N — общее количество определяемых жирных кислот.
В качестве результата единичного измерения принимают среднеарифметические значения Xk, полученные для двух хроматографирований одной и той же смеси метиловых эфиров жирных кислот.
9.3. Массовую долю жирных кислот Yk, %, в экстрагированных из продуктов липидах вычисляют по методу внутреннего стандарта по формуле
Y_{k} = 100 \cdot \frac{0,962 \cdot S_{k} \cdot K_{k} \cdot C \cdot V}{S_{\text{вн}.\text{ст}} \cdot K_{\text{вн}.\text{ст}} \cdot m} , (2)
где Sk и Kk — соответственно абсолютные значения площадей пиков и поправочных коэффициентов для определяемых жирных кислот;
Sвн.ст и Kвн.ст — соответственно абсолютные значения площадей пиков и поправочных коэффициентов для внутреннего стандарта (метиловый эфир трикозановой кислоты C23:0);
C — массовая концентрация метилового эфира трикозановой кислоты в стандартном растворе в толуоле, мг/см3;
V — объем стандартного раствора метилового эфира трикозановой кислоты, вносимого в реакционную камеру автоклава или виалу, см3;
0,962 — отношение молекулярных масс трикозановой кислоты и ее метилового эфира;
m — масса навески экстрагированных липидов, использованной для получения метиловых эфиров жирных кислот, мг.
В качестве результата единичного измерения принимают среднеарифметические значения Yk, полученные для двух хроматографирований одной и той же смеси метиловых эфиров жирных кислот.
9.4. За окончательный результат принимают среднеарифметическое значение \overline{X_{k}} (метод внутренней нормализации) или \overline{Y_{k}} (метод внутреннего стандарта) результатов двух определений, выполненных в условиях повторяемости по ГОСТ ИСО 5725-1 для двух идентичных проб яиц или яичных продуктов, если выполняется условие приемлемости:
где Z1, Z2 — результаты единичных определений для двух идентичных проб массовых долей индивидуальных жирных кислот Xk (см. 9.2) или Yk (см. 9.3), %;
r — предел повторяемости при P = 0,95, % (таблицы 1 и 2).
9.5. Расхождение между результатами двух независимых определений, полученными при использовании одного и того же метода, на одной и той же пробе, в разных лабораториях, разными операторами, с использованием различного оборудования, должно удовлетворять следующему условию приемлемости:
|\overline{Z_{1}} - \overline{Z_{2}}| \leq CD_{0,95}, (4)
где \overline{Z_{1}} , \overline{Z_{2}} — среднеарифметические значения результатов определения массовых долей индивидуальных жирных кислот \overline{X_{k}} (метод внутренней нормализации) или \overline{Y_{k}} (метод внутреннего стандарта), полученных в двух разных лабораториях, %;
CD0,95 — значение критической разности при P = 0,95 и двух параллельных определений в каждой лаборатории, % (таблицы 1 и 2).
10. Оформление результатов
10.1 Результат измерений представляют в виде
\overline{Z_{k}} \pm \Delta, (5)
где \overline{Z_{k}} — среднеарифметические значения результатов определения массовых долей индивидуальных жирных кислот \overline{X_{k}} или \overline{Y_{k}} , %, признанных приемлемыми по 9.4;
\pm \Delta — границы абсолютной погрешности, %, при P = 0,95 (таблицы 1 и 2).
Результат измерения округляют до первого десятичного знака.
10.2. Массовую долю индивидуальных жирных кислот Vk в пересчете на исходный продукт, мг/100 г продукта, вычисляют по формуле
V_{k} = \frac{1000 \cdot \overline{Y_{k}} \cdot F}{100} , (6)
где \overline{Y_{k}} — среднеарифметические значения результатов определений по методу внутреннего стандарта массовых долей индивидуальных жирных кислот в экстрагированных липидах (см. 9.3), %;
F — массовая доля жира в подготовленной лабораторной пробе продукта (см. 7.6.2), измеренная по ГОСТ 31469, %.
Результат вычислений округляют до целого числа.
11. Требования к условиям измерений
При выполнении измерений температура и относительная влажность в лабораторном помещении, напряжение и частота переменного тока питающей электросети не должны выходить за предельные значения, приведенные в технических инструкциях на средства измерений и оборудование, указанные в 6.
12. Требования к квалификации оператора
К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются специалисты, имеющие высшее или среднее специальное образование и опыт работы в химической лаборатории, изучившие инструкцию по эксплуатации газового хроматографа и прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие газохроматографический метод определения жирно-кислотного состава в процессе обучения и получившие удовлетворительные результаты при оперативном контроле процедуры измерения.
13. Требования безопасности
13.1. При подготовке и проведении испытаний необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами и горючими газами по ГОСТ 12.1.007, правила пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и правила взрывобезопасности по ГОСТ 12.1.010. При работе с электроприборами необходимо соблюдать требования безопасности по ГОСТ 12.1.019.
13.2. При работе со сжатыми газами следует соблюдать правила безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением. Запрещается работать с негерметичными газовыми линиями хроматографа.
13.3. Помещение, в котором проводят измерения, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с концентрированной соляной кислотой, метанолом, диэтиловым и петролейным эфиром необходимо проводить в вытяжном шкафу.
Ацетилхлорид вызывает раздражение кожи и слизистых оболочек, поражает дыхательные пути, поэтому работу с ацетилхлоридом следует проводить только в вытяжном шкафу с применением индивидуальных средств защиты.
ЗНАЧЕНИЯ ПОПРАВОЧНЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ Ki ДЛЯ ВЫЧИСЛЕНИЯ МАССОВЫХ ДОЛЕЙ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
А.1. Значения поправочных коэффициентов Ki для вычисления массовых долей жирных кислот приведены в таблице А.1.
НАИМЕНОВАНИЯ И ДИАПАЗОН ЗНАЧЕНИЙ ОТНОСИТЕЛЬНЫХ ПЛОЩАДЕЙ ХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ПИКОВ ЖИРНЫХ КИСЛОТ
Б.1. Названия и обозначения жирных кислот, а также диапазон значений относительных площадей хроматографических пиков к сумме площадей всех пиков, характерных для липидов куриных яиц (жирные кислоты перечисляются в порядке выхода соответствующих хроматографических пиков при использовании капиллярной колонки Omegawax 320) приведены в таблице Б.1.
БИБЛИОГРАФИЯ
| [1] | Omegawax Column Test Mix. Фирма Supelco, США, кат. № 48476 |
|---|---|
| [2] | PUFA-2, Animal Source. Фирма Supelco, США, кат. N. 47015-U. |