ГОСТ 32113-2013. Межгосударственный стандарт. Продукция винодельческая. Метод определения массовой концентрации лимонной кислоты
(введен в действие Приказом Росстандарта от 05.06.2013 № 145-ст)
Примечание
Документ введен в действие с 1 января 2014 года.
Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 июня 2013 г. № 145-ст
МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ЛИМОННОЙ КИСЛОТЫ
Wine production. Method for determination of citric acid mass concentration
Дата введения 1 января 2014 года
Предисловие
Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».
Сведения о стандарте
1. Подготовлен Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт пивоваренной, безалкогольной и винодельческой промышленности» Российской академии сельскохозяйственных наук (ГНУ ВНИИПБиВП Россельхозакадемии).
2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (Росстандарт).
3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (протокол от 25 марта 2013 г. № 55-П).
4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 5 июня 2013 г. № 145-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 32113-2013 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 января 2014 г.
5. Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52391-2005.
Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в ежегодном информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.
1. Область применения
Настоящий стандарт распространяется на винодельческую продукцию и устанавливает метод определения массовой концентрации лимонной кислоты в диапазоне от 3 до 2000 мг/дм3.
Метод основан на спектрофотометрическом/фотометрическом определении количества окисленного в ходе ферментативных реакций никотинамид-адениндинуклеотида (НАД+), эквивалентного массовой концентрации лимонной кислоты.
Оптическую плотность измеряют в кювете номинальной толщиной 10 мм при длине волны \lambda = 340\text{нм} (максимум поглощения NADH) либо 334 или 365 нм — при использовании фотометра с прерывистым спектром.
2. Нормативные ссылки
В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие стандарты:
ГОСТ 12.1.004-91 Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования
ГОСТ 12.2.007.0-75 Система стандартов безопасности труда. Изделия электротехнические. Общие требования безопасности
ГОСТ 12.4.009-83 Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание
ГОСТ 12.4.103-83 Система стандартов безопасности труда. Одежда специальная защитная, средства индивидуальной защиты ног и рук. Классификация
ГОСТ 908-2004 Кислота лимонная моногидрат пищевая. Технические условия
ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия
ГОСТ 3769-78 Реактивы. Аммоний сернокислый. Технические условия
ГОСТ 4201-79 Реактивы. Натрий углекислый кислый. Технические условия
ГОСТ 4328-77 Реактивы. Натрия гидроокись. Технические условия
ГОСТ 4517-87 Реактивы. Методы приготовления вспомогательных реактивов и растворов, применяемых при анализе
ГОСТ 4529-78 Реактивы. Цинк хлористый. Технические условия
ГОСТ ИСО 5725-6-2003 Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике
ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия
ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия
ГОСТ 17299-78 Спирт этиловый технический. Технические условия
ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования
ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры
ГОСТ 28498-90 Термометры жидкостные стеклянные. Общие технические требования. Методы испытаний
ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой
ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования
ГОСТ 31730-2012 Продукция винодельческая. Правила приемки и методы отбора проб.
Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодно издаваемому информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по соответствующим выпускам ежемесячно издаваемого информационного указателя за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.
3. Требования безопасности
3.1. Требования электробезопасности при работе с приборами — по ГОСТ 12.2.007.0.
3.2. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009.
3.3. При выполнении анализов необходимо выполнять требования безопасности при работе с химическими реактивами согласно ГОСТ 12.4.103.
4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, реактивы и материалы
Спектрофотометр, позволяющий проводить измерения при длине волны 340 нм, шириной полосы пропускания не более 5 нм; основная погрешность измерения коэффициента светопропускания не более +/- 0,1%; кварцевые или стеклянные кюветы номинальной толщиной 10 мм. При отсутствии спектрофотометра можно пользоваться фотометром с прерывистым спектром, позволяющим проводить измерения при длине волны \lambda , равной 334 нм или 365 нм.
Весы лабораторные по ГОСТ 24104 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,05 мг.
pH-метр с диапазоном измерения от 1 до 10 ед. pH; погрешность измерения — не более +/- 0,05 ед. pH.
Секундомер с диапазоном измерения от 60 с до 30 мин; погрешность измерения — не более +/- 0,5 мин.
Пипетки по ГОСТ 29169 вместимостью 1, 2, 5, 10 и 25 см3, 1-го или 2-го класса.
Пипетки по ГОСТ 29227 вместимостью от 0,5 до 2 см3, 1-го или 2-го класса.
Микропипетки вместимостью 5 — 50, 100 — 1000 мкл.
Колбы мерные по ГОСТ 1770 вместимостью 100, 500 см3, 1-го или 2-го класса.
Термометр жидкостный стеклянный по ГОСТ 28498 с диапазоном измерения от 10 °C до 50 °C, цена деления 1 °C.
Колба коническая по ГОСТ 25336 вместимостью 50 см3.
Воронка химическая по ГОСТ 25336.
Стаканы химические по ГОСТ 25336 вместимостью 10 и 25 см3.
Цилиндры по ГОСТ 1770 вместимостью 50, 100, 250 см3.
Палочка стеклянная или пластмассовая.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328, х.ч.
Кислота лимонная пищевая по ГОСТ 908, экстра.
Цинк хлористый по ГОСТ 4529, х.ч.
Никотинамид-аденин-динуклеотид.
Малат-дегидрогеназа (МДГГ), раствор массовой концентрацией 5 мг/см3, активность 136 U (ЕС 1.1.1.37).
Лактат-дегидрогеназа (ЛДГГ), раствор массовой концентрацией 5 мг/см3, активность 280 U (ЕС 1.1.1.27).
Цитрат-лиаза (ЦЛ), раствор массовой концентрацией 5 мг/см3, активность 12 U (ЕС 4.1.3.6).
Аммоний сернокислый по ГОСТ 3769, х.ч.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.
Вода бидистиллированная по ГОСТ 4517.
Натрий углекислый кислый по ГОСТ 4201, х.ч.
Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.
Спирт этиловый технический по ГОСТ 17299.
Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также реактивов по качеству не хуже вышеуказанных.
5. Отбор проб
Отбор проб — по ГОСТ 31730.
6. Подготовка к выполнению измерений
6.1. Условия выполнения измерений
При выполнении измерений необходимо соблюдать следующие условия: - температура окружающей среды . . . . . . . . . . . от 20 °C до 30 °C; - относительная влажность воздуха, не более . . . . . . . . . . . 90%; - атмосферное давление . . . . . . . . . . . . . . 630 — 800 мм рт. ст.
6.2. Подготовка и отбор кювет
Кюветы, предназначенные для определения, моют 10%-ным раствором соляной кислоты; затем трижды промывают дистиллированной водой и один раз этиловым спиртом. Не допускаются применение растворов щелочей, концентрированных кислот и механическая чистка кювет с помощью абразивных средств. Затем кюветы высушивают на фильтровальной бумаге под стеклянным стаканом при комнатной температуре.
Выполняют три параллельных измерения оптической плотности на спектрофотометре/фотометре при длине волны 340 нм (334 нм или 365 нм). Для выполнения измерения используют только те кюветы, для которых выполняется условие \Delta_{Ki} \leq 0,005 .
Для выполнения измерений на однокюветных спектрофотометрах/фотометрах используют одну и ту же кювету.
6.3. Приготовление рабочих растворов
6.3.1 Приготовление раствора хлористого цинка (ZnCl2) массовой концентрацией 80 мг/100 см3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 переносят 80 мг хлористого цинка, добавляют 10 см3 бидистиллированной воды, перемешивают до полного растворения. Затем объем доводят до метки бидистиллированной водой.
6.3.2 Приготовление раствора натрия гидроокиси молярной концентрацией c (NaOH) = 5 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 500 см3 наливают 200 — 250 см3 бидистиллированной воды. Затем постепенно, не допуская разогрева свыше 50 °C, вносят 100 г натрия гидроокиси. Закрывают колбу пробкой и перемешивают круговыми движениями до полного растворения щелочи. Раствор охлаждают до температуры 20 °C — 25 °C, доводят до метки бидистиллированной водой и тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 3 мес.
6.3.3. Приготовление раствора сернокислого аммония молярной концентрацией c[(NH)2SO4] = 3,2 моль/дм3
В мерную колбу вместимостью 100 см3 переносят 42,28 г сернокислого аммония, добавляют 60 см3 бидистиллированной воды и перемешивают круговыми вращениями. Затем объем доводят до метки бидистиллированной водой.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 3 мес.
6.3.4 Приготовление буферного раствора с pH = 7,8 ед. pH
В мерную колбу вместимостью 500 см3 переносят 7,13 г глицилглицина, добавляют 70 см3 бидистиллированной воды и перемешивают. Затем добавляют 13 см3 раствора натрия гидроокиси молярной концентрацией 5 моль/дм3, приготовленного по 6.3.2, 10 см3 раствора хлористого цинка, приготовленного по 6.3.1, и доводят объем до метки бидистиллированной водой.
Срок хранения раствора при температуре 4 °C — не более четырех недель. Еженедельно проверяют значение pH.
6.3.5. Приготовление раствора восстановленного никотинамид-аденин-динуклеотида молярной концентрацией c(NADH) = 6·10-3 моль/дм3
В стакан вместимостью 25 см3 вносят 30 мг NADH, растворяют в 6 см3 бидистиллированной воды. Затем добавляют 60 мг углекислого кислого натрия и перемешивают.
6.3.6 Приготовление раствора малат-дегидрогеназы/лактат-дегидрогеназы (МДГГ/ЛДГГ)
В стакан вместимостью 10 см3 вносят микропипеткой 1 см3 раствора МДГГ массовой концентрацией 5 мг/см3, 0,4 см3 раствора сернокислого аммония молярной концентрацией 3,2 моль/дм3 (приготовленного по 6.3.3), 0,5 см3 раствора ЛДГГ массовой концентрацией ферментного препарата 5 мг/см3 и перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре минус 20 °C — не более четырех недель.
6.3.7 Приготовление раствора цитрат-лиазы молярной концентрацией c (ЦЛ) = 5 мг/см3
В стакан вместимостью 10 см3 вносят 168 мг ЦЛ. Затем добавляют 1 см3 ледяной бидистиллированной воды и перемешивают.
Срок хранения раствора при температуре минус 20 °C — не более четырех недель.
6.3.8 Приготовление суспензии поливинилполипирролидона (ПВПП)
В стакан вместимостью 25 см3 переносят 0,2 г ПВПП, добавляют 10 — 15 см3 дистиллированной воды и перемешивают. Затем отстаивают в течение 15 мин и фильтруют через складчатый фильтр. Осадок, оставшийся на фильтре, используют для обесцвечивания красных вин.
Примечание. Вместо приготовления рабочих растворов по 6.3.1 - 6.3.7 допускается использование готовых импортных растворов по качеству не хуже предусмотренных по 6.3.1 - 6.3.7.
6.4. Подготовка приборов
Подготовку спектрофотометра/фотометра и pH-метра к измерениям осуществляют в соответствии с руководствами по эксплуатации этих приборов.
Нулевое показание по шкале оптической плотности устанавливают по воздуху.
7. Выполнение измерений
7.1. Подготовка пробы
7.1.1 Удаление двуокиси углерода, содержащейся в вине и винном коктейле
Избыток двуокиси углерода удаляют в соответствии с порядком, установленным нормативными документами, действующими на территории государств, принявших стандарт.
7.1.2 Обесцвечивание красного вина
При анализе интенсивно окрашенных красных вин проводят обесцвечивание пробы. К 10 см3 вина, помещенного в коническую колбу вместимостью 50 см3, добавляют ПВПП, приготовленный по 6.3.8, смесь перемешивают в течение 2 — 3 мин, а затем фильтруют через складчатый бумажный фильтр. Для измерения используют прозрачный или слегка окрашенный фильтрат.
7.1.3 Разбавление пробы
В зависимости от проведенной оценки значения массовой концентрации лимонной кислоты пробу разбавляют дистиллированной водой в соответствии с таблицей 1.
| Диапазон измерений массовой концентрации лимонной кислоты, мг/дм3 | Коэффициент разбавления K |
|---|---|
| От 3 до 240 включ. | 1 |
| Св. 240 « 850 » | 4 |
| « 850 » 1250 «» | 5 |
| « 1250 » 2000 «» | 10 |
7.2. Измерение оптической плотности
В кюветы с помощью пипетки и микропипетки дозируют растворы реактивов и пробу в количествах и в порядке, указанном в таблице 2.
| Наименование растворов | Объем, см3 | |
| Контрольный раствор (A1К) | Испытуемый раствор (A1ПР) | |
| Буферный раствор по 6.3.4 | 1,00 | 1,00 |
| Раствор NADH по 6.3.5 | 0,10 | 0,10 |
| Проба | - | 0,20 |
| Бидистиллированная вода | 2,00 | 1,80 |
| Раствор МДГГ/ЛДГГ по 6.3.6 | 0,02 | 0,02 |
Растворы в кювете осторожно перемешивают стеклянной или пластмассовой палочкой и выдерживают в течение (5,0 +/- 0,5) мин.
Проводят измерение оптической плотности относительно воздуха контрольного (A1К) и испытуемого (A1ПР) растворов с записью результата измерения до третьего знака после запятой.
Затем в растворы добавляют по 0,02 см3 раствора цитрат-лиазы, приготовленного по 6.3.7, перемешивают и выдерживают в течение (5,0 +/- 0,5) мин. Повторно проводят измерение оптической плотности относительно воздуха контрольного (A2К) и испытуемого (A2ПР) растворов с записью результата измерения до третьего десятичного знака.
8. Обработка результатов измерений
8.1 Массовую концентрацию лимонной кислоты C, мг/дм3, вычисляют по формуле
\text{С } = \alpha \cdot \Delta A \cdot K , (1)
где \alpha = 488\text{мг}/\text{дм}^{3} для измерений при \lambda = 334\text{нм} ;
\alpha = 479\text{мг}/\text{дм}^{3} для измерений при \lambda = 340\text{нм} ;
\alpha = 887\text{мг}/\text{дм}^{3} для измерений при \lambda = 365\text{нм} ;
\Delta A — разность оптических плотностей, вычисленная по формуле (2);
K — коэффициент разбавления по 7.1.3.
8.2 Разность значений оптических плотностей вычисляют по формуле
\Delta A = (A_{1\text{ПР}} - A_{2\text{ПР}}) - (A_{1K} - A_{2K}) , (2)
где A1ПР и A2ПР — значения оптической плотности испытуемого раствора до и после реакции с цитрат-лиазой по 7.2;
A1К и A2К — значения оптической плотности контрольного раствора до и после реакции с цитрат-лиазой по 7.2.
Примечание. Если (A1К — A2К) имеет отрицательное значение, то его суммируют с (A1ПР — A2ПР). Определенная по формуле (2) разность значений оптических плотностей \Delta A , как правило, составляет не менее 0,100 и не более 0,800. В противном случае изменяют коэффициент разбавления по 7.1.3.
Вычисления проводят до первого десятичного знака.
За результат анализа принимают среднеарифметическое значение двух результатов параллельных определений, округленное до целого числа, абсолютное расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (сходимости) r.
Значения предела повторяемости (сходимости) r приведены в таблице 4. Результаты измерений считают приемлемыми при условии
где X1, X2 - массовая концентрация лимонной кислоты в двух параллельных определениях.
Если условие (3) не выполняется, то проводят повторные измерения и проверку приемлемости результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (сходимости) в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (пункт 5.2.2).
9. Контроль точности результатов
9.1. Контроль повторяемости (сходимости)
При контроле повторяемости (сходимости) абсолютное значение разности двух результатов параллельных определений, полученных в условиях повторяемости (на одной и той же пробе, в одной и той же лаборатории, одним и тем же оператором, с использованием одного и того же оборудования, в пределах короткого промежутка времени), не должно превышать абсолютного предела повторяемости (сходимости) r, т.е. с вероятностью P = 0,95 должно выполняться условие (3).
9.2. Контроль воспроизводимости
При контроле воспроизводимости абсолютное значение разности двух результатов анализа одной и той же пробы, полученных в условиях воспроизводимости (в двух лабораториях, разными операторами, с использованием различного оборудования), не должно превышать предела воспроизводимости R. Значения R приведены в таблице 4. Результаты измерений считают приемлемыми при условии
9.3. Контроль погрешности
При проведении контроля погрешности метода используют стандартный раствор лимонной кислоты лабораторного приготовления. Схема дозирования представлена в таблице 3.
| Наименование раствора | Объем, см3 | |||
| Контрольный раствор | Испытуемый раствор | Стандартный раствор | Стандартный раствор + испытуемый раствор | |
| Буферный раствор по 6.3.4 | 1,00 | 1,00 | 1,00 | 1,00 |
| Раствор NADH по 6.3.5 | 0,10 | 0,10 | 0,10 | 0,10 |
| Проба | - | 0,20 | - | 0,10 |
| Стандартный раствор | - | - | 0,20 | 0,10 |
| Бидистиллированная вода | 2,00 | 1,80 | 1,80 | 1,80 |
| Раствор МДГГ/ЛДГГ по 6.3.6 | 0,02 | 0,02 | 0,02 | 0,02 |
Растворы в кюветах осторожно перемешивают стеклянной или пластмассовой палочкой и выдерживают в течение (5,0 +/- 0,5) мин. Проводят измерение оптической плотности A1 (для контрольного, испытуемого, стандартного и стандартного + испытуемого растворов). Далее процедуру анализа продолжают в соответствии с 7.2.
Разность значений оптических плотностей вычисляют по формуле (2) и формулам
\Delta A_{\text{пр} + \text{станд}} = (A_{1\text{ПР} + \text{станд}} - A_{2\text{ПР} + \text{станд}}) - (A_{1K} - A_{2K}) , (5)
\Delta A_{\text{станд}} = (A_{1\text{станд}} - A_{2\text{станд}}) - (A_{1K} - A_{2K}) . (6)
Вычисляют степень повторного нахождения стандарта, %, по формуле
\text{ПН } = \frac{2\Delta A_{\text{пр} + \text{станд}} - \Delta A}{\Delta A_{\text{станд}}} 100 . (7)
Степень повторного нахождения должна находиться в интервале:
Диапазоны измерения массовых концентраций лимонной кислоты и значения показателей точности метода измерений при P = 0,95 приведены в таблице 4.