ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002). Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella

(введен в действие Приказом Росстандарта от 09.11.2012 № 715-ст)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ 30519-97"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-30519-97" "ГОСТ 30519-97. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella (введен в действие Постановлением Госстандарта России от 16.04.1998 N 122)"
  n1["ГОСТ Р 52814-2007"]:::rst
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-r-52814-2007" "ГОСТ Р 52814-2007. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella (утв. и введен в действие Приказом Ростехрегулирования от "
  n2["ГОСТ 31659-2012"]:::rst
  click n2 "https://bukva.ai/docs/gost-31659-2012" "ГОСТ 31659-2012. Межгосударственный стандарт. Продукты пищевые. Метод выявления бактерий рода Salmonella (введен в действие Приказом Росстандарта от 09.11.2012 N 715-ст)"
  n3["ГОСТ 31659-2024"]:::doc
  click n3 "https://bukva.ai/docs/standart-gost-31659-2024" "ГОСТ 31659-2024. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевой цепи. Горизонтальный метод обнаружения, подсчета и серотипирования бактерий рода Salmonella. Часть 1. Обнаружени"
  n2 --> n3
  n1 --> n2
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. № 715-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОД ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA

Food products. Method for the detection of Salmonella spp.

(ISO 6579:2002, MOD)

ГОСТ 31659-2012 (ISO 6579:2002)

МКС 07.100.30

Дата введения 1 июля 2013 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1. Подготовлен Государственным научным учреждением «Всероссийский научно-исследовательский институт консервной и овощесушильной промышленности» (ГНУ ВНИИКОП) на основе аутентичного перевода стандарта, указанного в пункте 4.

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии (ТК 335).

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол от 20 июля 2012 № 50).

За принятие проголосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 9 ноября 2012 г. № 715-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31659-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5. Настоящий стандарт является модифицированным по отношению к международному стандарту ISO 6579:2002 Microbiology of food and animal feeding staffs — Horizontal method for the detection of Salmonella spp. (Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Горизонтальный метод выявления Salmonella spp.) в части пищевых продуктов. При этом дополнительные положения и требования, включенные в текст стандарта для учета потребности экономики указанных выше государств и особенностей межгосударственной стандартизации, выделены в тексте стандарта курсивом.

Степень соответствия — модифицированная (MOD).

Наименование настоящего стандарта изменено относительно наименования указанного международного стандарта для приведения в соответствие с ГОСТ 1.5-2001 (подраздел 3.6).

При применении настоящего стандарта рекомендуется использовать сведения о соответствии ссылочных международных стандартов межгосударственным стандартам, использованным в настоящем стандарте в качестве нормативных ссылок, указанные в Приложении ДА.

Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 52814-2007 (ИСО 6579:2002).

6. Введен впервые.

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в информационном указателе «Национальные стандарты», а текст изменений и поправок — в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». В случае пересмотра (замены) или отмены настоящего стандарта соответствующее уведомление будет опубликовано в ежемесячном информационном указателе «Национальные стандарты». Соответствующая информация, уведомление и тексты размещаются также в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет.

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на пищевые продукты и устанавливает метод выявления в определенной массе или объеме продукта бактерий рода Salmonella, включая Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.

Допускается использование хромогенных сред для предварительного выявления бактерий рода Salmonella.

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы нормативные ссылки на следующие межгосударственные стандарты:

ГОСТ 4209-77 Реактивы. Магний хлористый 6-водный. Технические условия

ГОСТ 6672-75 Стекла покровные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 6691-77 Реактивы. Карбамид. Технические условия

ГОСТ 6709-72 Вода дистиллированная. Технические условия

ГОСТ ISO 7218-2011 Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Общие требования и рекомендации по микробиологическим исследованиям

ГОСТ 9284-75 Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия

ГОСТ 9536-79 Спирт изобутиловый технический. Технические условия

ГОСТ 10444.1-84 Консервы. Приготовление растворов реактивов, красок, индикаторов и питательных сред, применяемых в микробиологическом анализе

ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные. Общие технические требования

ГОСТ 24363-80 Реактивы. Калия гидроокись. Технические условия

ГОСТ 26668-85 Продукты пищевые и вкусовые. Методы отбора проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26669-85 Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов

ГОСТ 26670-91 Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов

ГОСТ 30425-97 Консервы. Метод определения промышленной стерильности.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов в информационной системе общего пользования — на официальном сайте Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии в сети Интернет или по ежегодному информационному указателю «Национальные стандарты», который опубликован по состоянию на 1 января текущего года, и по выпускам ежемесячного информационного указателя «Национальные стандарты» за текущий год. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Термины и определения

В настоящем стандарте применены следующие термины с соответствующими определениями:

3.1. Бактерии рода Salmonella: микроорганизмы, которые на агаризованных селективно-диагностических средах образуют типичные или не совсем типичные колонии.

Примечание. Описание и методы определения биохимических и серологических характеристик этих микроорганизмов приведены в настоящем стандарте.

3.2. Выявление бактерий рода Salmonella: определение присутствия или отсутствия бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта в соответствии с настоящим стандартом.

4. Сущность метода

4.1 Общие положения

Метод выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта состоит из четырех этапов (см. 4.2; 4.3; 4.4; 4.5 и Приложение А).

4.2 Предварительное обогащение в неселективной жидкой среде

Бактерии рода Salmonella могут присутствовать в продукте в небольшом количестве вместе с большим количеством других бактерий из семейства Enterobacteriaceae или других семейств. Поэтому предварительное обогащение необходимо для выявления небольшого числа бактерий рода Salmonella или сублетально поврежденных бактерий рода Salmonella.

Навеску массой 25 г вносят в забуференную пептонную воду, затем инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч.

Для некоторых пищевых продуктов используют другое предварительное обогащение (см. 8.1.2).

Для большего эффекта перед внесением навески продукта забуференную пептонную воду нагревают до температуры (37 +/- 1) °C.

4.3 Обогащение в селективной жидкой среде

Среду Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) и одну из двух сред: Мюллер-Кауфман тетратионатный бульон (МКТ-бульон) или селенитовую среду — инокулируют культурой, полученной по 4.2. После посева RVS-бульон инкубируют при температуре (41,5 +/- 1,0) °C в течение (24 +/- 3) ч, а МКТ-бульон и селенитовую среду — при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

4.4 Пересев на чашки для идентификации

Культуры, полученные по 4.3, пересевают на две селективные агаризованные среды:

• ксилоза-лизин-дезоксихолатный агар (XLD-агар) и
• на одну из следующих агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

Посевы на агаризованных средах инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

4.5 Проведение идентификации

Колонии, предположительно относящиеся к бактериям рода Salmonella, полученные на чашках по 4.4, идентифицируют с помощью биохимических и серологических тестов.

5. Питательные среды, реактивы и сыворотки

5.1 Общие положения

Химические вещества, используемые для приготовления питательных сред и реактивов, должны быть аналитического качества (не ниже ч.д.а. или х.ч.).

5.2 Питательные среды и реактивы

Состав и приготовление питательных сред и реактивов указаны в Приложении В.

5.2.1. Среда для неселективного предварительного обогащения: забуференная пептонная вода по В.1.

5.2.2. Первая селективная обогатительная среда: среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон) по В.2.

5.2.3. Вторая селективная обогатительная среда: селенитовая среда по В.3.

5.2.4. Третья селективная обогатительная среда: тетратионатный бульон Мюллер-Кауфмана (МКТ-бульон) по В.4.

5.2.5 Агаризованные селективные среды для чашек

5.2.5.1. Первая среда: ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-агар) по В.5.

5.2.5.2 Вторая среда по В.6.

5.2.6 Питательный агар по В.7.

5.2.7. Мясо-пептонный агар или ГРМ-агар (питательный агар для культивирования микроорганизмов на основе гидролизата рыбной муки) по В.8.

5.2.8 Мясо-пептонный бульон с глюкозой по В.9.

5.2.9 Среды с углеводами (среды Гисса) по В.10.

5.2.10. Трехсахарный железистый агар (TSI-агар) или агар Клиглера, или агар Олькеницкого по В.11.

5.2.11 Агар с мочевиной (Кристенсена) по В.12.

5.2.12 L-Лизин-декарбоксилазная среда по В.13.

5.2.13. Реактив для определения \beta - \text{галактозидазы} (или используются в соответствии с инструкцией изготовителя готовые бумажные диски) по В.14.

5.2.14 Реактив для реакции Фогес-Проскауера (VP) по В.15.

5.2.15 Реактивы для индольной реакции по В.16.

5.2.16 Триптон/триптофановая среда по В.17.

5.2.17 Бульон Хоттингера по В.18.

5.2.18. Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана по В.19.

5.2.19 Полужидкий питательный агар по В.20.

5.2.20 Полужидкий мясо-пептонный агар по В.21.

5.2.21 Физиологический раствор по В.22.

5.3 Сыворотки

Имеется несколько типов агглютинирующих сывороток, содержащих антитела для одного или нескольких O-антигенов, т.е. антисыворотки, содержащие одну или более «O» групп (моновалентные или поливалентные анти-O-сыворотки), анти-Vi-сыворотки и антисыворотки, содержащие антитела для одного или нескольких H-факторов (моновалентные или поливалентные анти-H-сыворотки).

Каждое опытное определение должно давать гарантию, что используемая антисыворотка пригодна для выделения всех серотипов бактерий рода Salmonella.

Сухие агглютинирующие адсорбированные O-, Vi-, H-сальмонеллезные сыворотки промышленного производства готовят перед употреблением по прилагаемой к ним инструкции.

6. Аппаратура, материалы и реактивы

Приемлемой альтернативой посуде многоразового применения является одноразовая посуда, если она отвечает соответствующим требованиям.

Обычное лабораторное оборудование и реактивы для микробиологических исследований по ГОСТ ISO 7218, ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

Аппарат для сухой стерилизации (стерилизационный сушильный шкаф) или влажной стерилизации (автоклав) по ГОСТ ISO 7218 (подразделы 4.5 и 4.10).

Термостат, поддерживающий температуру (37 +/- 1) °C по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.6).

Водяная баня, поддерживающая температуру (41,5 +/- 1,0) °C, или термостат, поддерживающий температуру (41,5 +/- 1,0) °C по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Водяная баня, поддерживающая температуру 44 °C — 47 °C и (37 +/- 1) °C, по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.9).

Прибор для мембранной фильтрации.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 200 г (для взвешивания реактивов) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,01 мг.

Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания 1 кг (для взвешивания продукта) с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 20,0 мг.

Микроскоп биологический, обеспечивающий просмотр в проходящем свете, с увеличением 900^{\times} - 1000^{\times} .

Бактериологическая петля диаметром около 3 мм.

pH-метр с точностью калибровки +/- 0,1 pH при температуре 20 °C — 25 °C по ГОСТ ISO 7218 (подраздел 4.4).

Стекла предметные по ГОСТ 9284.

Стекла покровные по ГОСТ 6672.

Пробирки или флаконы соответствующей вместимости.

Могут быть использованы бутылки или флаконы с нетоксичными металлическими или пластиковыми завинчивающимися крышками.

Градуированные или автоматические пипетки вместимостью 10, 2 и 1 см3 с градуировкой на 0,5 и 0,1 см3.

Чашки Петри среднего размера (диаметр 90 или 100 мм) и/или большие (диаметр 140 мм).

Спирт изобутиловый по ГОСТ 9536.

Бриллиантовый зеленый.

Вода дистиллированная по ГОСТ 6709.

Желчь бычья сухая или натуральная.

Железо (III) аммоний цитрат.

Железо (III) цитрат.

Калия гидроокись по ГОСТ 24363.

Карбамид (мочевина) по ГОСТ 6691.

Контрольный штамм бактерий рода Salmonella, не относящихся к тифозной группе.

Креатин моногидрат.

Ксилоза.

L-Лизин гидрохлорид.

4-Диметиламинобензальдегид.

Магний хлористый по ГОСТ 4209.

Натрий кислый селенистокислый (NaHSeO3).

Натрий гипосульфит (Na2S2O3·5H2O).

Натрий деоксихолат.

o - \text{Нитрофенил} - \beta - D - \text{галактопиранозид} (ONPG).

Новобиоцин натриевая соль.

Сухие агглютинирующие адсорбированные поливалентные сальмонеллезные O-сыворотки основных групп A, B, C, Д, E и редких групп.

Vi- и H-агглютинирующие сыворотки.

Толуол.

Феноловый красный.

Ферментативный гидролизат сои.

Экстракт мясной.

Допускается применение средств измерений, вспомогательного оборудования с аналогичными метрологическими и техническими характеристиками, а также материалов и реактивов по качеству не хуже указанных.

7. Отбор и подготовка проб

Отбор и подготовка проб — по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

Важно, чтобы для испытания поступила представительная проба, не поврежденная и не измененная в ходе транспортирования или хранения.

8. Проведение испытания

Схема проведения испытания приведена в Приложении Б.

8.1 Навеска и исходное разведение

8.1.1 Общие положения

Для приготовления исходной суспензии используют как разбавитель неселективную среду, указанную в 5.2.1 и 4.2 (забуференную пептонную воду).

Если масса пробы иная, чем 25 г, используют необходимое количество неселективной среды, исходя из соотношения 1:10.

Для уменьшения объема работы, когда испытывают больше одной пробы от определенного продукта и когда очевидно, что объединенная навеска не влияет на результат испытания, — навески объединяют.

Пример. Если необходимо исследовать 10 навесок по 25 г, их объединяют и к 250 г добавляют 2,25 дм3 неселективной среды.

8.1.2 Специфичность приготовления исходной суспензии для некоторых продуктов

Указанная специфичность приготовления может быть применена только для выявления бактерий рода Salmonella.

8.1.2.1 Какао и какаосодержащие продукты (массовая доля какао более 20%)

Добавляют в забуференную пептонную воду (см. 5.2.1) 50 г некислого казеина или 100 г/дм3 обезжиренного молочного порошка и, если пищевые продукты предположительно содержат большое количество грамположительных микроорганизмов, прибавляют после 2 ч инкубирования 0,018 г/дм3 бриллиантового зеленого (3,6 см3/дм3 раствора, приготовленного по В.4.4). Казеин и молочный порошок добавляют при приготовлении забуференной пептонной воды до стерилизации.

8.1.2.2 Кислые и кислотосодержащие пищевые продукты

При неселективном обогащении должна быть гарантия того, что pH не будет ниже 4,5.

pH кислых и кислотосодержащих продуктов стабилизируют путем использования забуференной пептонной воды двойной концентрации.

Допускается также при высеве жидких высококислотных продуктов для предотвращения снижения pH сред на 0,5 и более pH продукта перед посевом доводить до (7,0 +/- 0,2).

При высеве твердых высококислотных продуктов доводят pH до (7,0 +/- 0,2) в посевах.

Доведение pH проводят с соблюдением правил асептики с помощью стерильных растворов гидроокиси натрия и соляной кислоты, приготовленных по ГОСТ 10444.1. Количество добавляемых растворов устанавливают опытным путем.

8.2 Неселективное обогащение

Инкубируют исходную суспензию (см. 8.1.1) при температуре (37 +/- 1) °C в течение (18 +/- 2) ч.

8.3 Селективное обогащение

Культуры, полученные после инкубирования по 8.2, пересевают в среды для селективного обогащения. Для этого по 1 см3 культуры пересевают в 10 см3 RVS-бульона и в 10 см3 селенитовой среды или в 10 см3 тетратионатного бульона Мюллер-Кауфмана.

Посевы на RVS-бульоне инкубируют при температуре (41,5 +/- 1,0) °C в течение (24 +/- 3) ч (следят за тем, чтобы температура не превышала 42,5 °C), а на тетратионатном бульоне и селенитовой среде посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

Если из одного пищевого продукта проведен высев нескольких навесок (каждой отдельно) для выявления бактерий рода Salmonella, то допускается из каждого посева по 8.2 пересев проводить в один флакон с каждой селективной питательной средой (RVS-бульоном, тетратионатным бульоном Мюллер-Кауфмана, селенитовой средой). При этом количество селективной среды во флаконе должно быть увеличено по сравнению с 10 см3 во столько раз, из скольких посевов проводят пересев.

Свежие продукты, не содержащие поврежденных микроорганизмов, подвергнутые каким-либо воздействиям, например сушке, заморозке и другим, допускается высевать непосредственно в селективные среды, минуя этап неселективного обогащения. Соотношение между количеством высеваемого продукта и средой должно быть не менее 1:10.

8.4 Пересев на чашки и идентификация

8.4.1. Культуры через 24 ч инкубирования на селективных средах пересевают по ГОСТ 26670 так, чтобы получить хорошо изолированные колонии, на XLD-агар и на одну из агаризованных сред: висмут-сульфит агар, среду Плоскирева, среду Эндо, среду Левина или бриллиантовый зеленый агар.

При отсутствии больших чашек используют для посева петлей две средние чашки (одну за другой).

8.4.2. Чашки переворачивают (см. 8.4.1) вверх дном и помещают в термостат при температуре (37 +/- 1) °C.

8.4.3. После инкубирования в течение (24 +/- 3) ч, а на бриллиантовом зеленом агаре — 48 ч, просматривают чашки (см. 8.4.2) и отмечают присутствие типичных колоний бактерий рода Salmonella и не совсем типичных колоний, которые могут быть бактериями рода Salmonella. Отмечают их местоположение на дне чашки.

Типичные колонии бактерий рода Salmonella, вырастающие на XLD-агаре, имеют черный центр и слегка прозрачную зону красноватого цвета, что принадлежит цвету индикатора.

Бактерии рода Salmonella H2S-отрицательные варианты (например, S. Paratyphi A) образуют на XLD-агаре розовые колонии с темным розовым центром, лактозоположительные бактерии рода Salmonella на XLD-агаре — желтые колонии с почернением или без него.

На висмут-сульфит агаре бактерии рода Salmonella образуют черные колонии с характерным металлическим блеском, а также зеленоватые с темно-зеленым ободком и с пигментированием среды под колониями.

На среде Эндо бактерии рода Salmonella образуют круглые бесцветные или слегка розоватые, прозрачные колонии.

На среде Плоскирева бактерии рода Salmonella образуют бесцветные прозрачные, но более плотные, чем на среде Эндо, колонии.

На среде Левина бактерии рода Salmonella образуют прозрачные, слабо-розовые или розовато-фиолетовые колонии.

На бриллиантовом зеленом агаре бактерии рода Salmonella образуют красноватые или розовые, почти белые колонии (их цвет зависит от штамма и срока инкубирования). Лактозоположительные и сахарозоположительные микроорганизмы образуют зеленоватые колонии, окруженные яркой желто-зеленой зоной.

Агар с бриллиантовым зеленым применяют для выделения сальмонелл, кроме Salmonella Typhi и Salmonella Paratyphi.

Отсутствие в посевах на селективно-диагностических средах типичных или не совсем типичных колоний для бактерий рода Salmonella свидетельствует об отсутствии бактерий рода Salmonella в анализируемой навеске (объеме) продукта.

При наличии хотя бы на одной селективно-диагностической среде типичных или не совсем типичных колоний для бактерий рода Salmonella проводят их дальнейшую идентификацию.

8.5 Идентификация

8.5.1 Общие положения

Для определения биохимических признаков бактерий рода Salmonella допускается использование наборов тест-систем. Эти наборы используют в соответствии с инструкцией изготовителя.

Для биохимической идентификации допускается использование тест-систем промышленного производства, зарегистрированных в странах, присоединившихся к стандарту, например «API 20E», «Rapid 20E».

8.5.2 Выделение колоний для идентификации

Для идентификации берут с каждой чашки (две чашки среднего или одну большого размера) каждой селективной среды (см. 8.4.3) сначала одну колонию типичную или не совсем типичную, а затем четыре колонии, если первая окажется отрицательной.

Рекомендуется брать сразу пять колоний для идентификации в случае эпидемиологической ситуации. Если на одной чашке менее пяти типичных или не совсем типичных колоний, то для идентификации берут все колонии.

Переносят отобранные колонии на поверхность предварительно подсушенного питательного агара (см. 5.2.6), или мясо-пептонного агара, или ГРМ-агара (см. 5.2.7) в чашках Петри или на скошенную поверхность среды в пробирках. Для подтверждения берут полностью изолированные колонии. Инкубируют инокулированные чашки или пробирки при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

Используют только чистые культуры для биохимической и серологической идентификации.

8.5.2.1 Окраска по Граму

Из отобранных для биохимической идентификации колоний готовят мазки и окрашивают по Граму по ГОСТ 30425.

Бактерии рода Salmonella являются грамотрицательными палочками с закругленными концами.

8.5.3 Биохимическая идентификация

У отобранных и предварительно пересеянных грамотрицательных культур изучают характер роста на трехсахарном железистом агаре (TSI-агаре), или агаре Клиглера, или среде Олькеницкого, возможность расщепления мочевины, образования ацетоина, индола, \beta - \text{галактозидазы} , L-лизиндекарбоксилазы, ферментации сахарозы и маннита, а также подвижность.

8.5.3.1 Общие положения

Петлей инокулируют специфические среды, указанные в 8.5.3.2 - 8.5.3.9, каждой культурой, полученной из колоний по 8.5.2.

8.5.3.2 TSI-агар (см. 5.2.10), среда Олькеницкого или агар Клиглера

Засевают штрихом скошенную поверхность агара (среды Олькеницкого) и уколом — столбик. Инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/-3) ч.

Интерпретируют изменения в среде следующим образом:

а) столбик агара (среды Олькеницкого)

• желтый — глюкоза положительная (глюкозу ферментирует);
• красный или неизменившийся — глюкоза отрицательная (глюкозу не ферментирует);
• черный — образование сероводорода;
• пузырьки или разрывы — образование газа из глюкозы;

б) скошенная поверхность агара (среды Олькеницкого)

• желтая — лактоза и/или сахароза положительные (лактозу и/или сахарозу ферментирует);
• красная или неизменившаяся — лактоза и сахароза отрицательные (ни лактозу, ни сахарозу не ферментирует).

Агар Клиглера содержит два сахара, поэтому по скошенной поверхности учитывают только ферментацию лактозы.

Типичные культуры бактерий рода Salmonella показывают щелочную (красную) поверхность и кислый (желтый) столбик с образованием газа (пузырьков) и примерно в 90% случаев образуется сероводород (черный агар).

Если изолированы лактозоположительные бактерии рода Salmonella, то поверхность TSI-агара желтая. Предварительное определение культур бактерий рода Salmonella не может основываться только на результатах теста на TSI-агаре.

Дальнейшему изучению подвергают также лактозоположительные бактерии или бактерии, не образующие сероводород, но обязательно ферментирующие глюкозу с образованием или без образования газа.

8.5.3.3 Агар с мочевиной (агар Кристенсена) (см. 5.2.11)

Культуры пересевают штрихом на поверхность агара Кристенсена с мочевиной. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч, наблюдая за посевами через определенные промежутки времени.

При положительной реакции — расщеплении мочевины с выделением аммония цвет фенолового красного меняется от розового до светло-вишневого.

Для уреазоположительных бактерий реакция часто становится видимой после 2 ч инкубирования.

Бактерии рода Salmonella не расщепляют мочевину.

8.5.3.4 L-Лизиндекарбоксилазная среда (см. 5.2.12)

Инокулируют снизу жидкую среду. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

Помутнение и пурпурный цвет среды после инкубирования указывают на положительную реакцию. Желтый цвет указывает на отрицательную реакцию.

Salmonella Paratyphi A не образует L-лизиндекарбоксилазу, остальные образуют.

8.5.3.5 Определение \beta - \text{галактозидазы} (5.2.13)

Суспендируют петлей культуру в 0,25 см3 физиологического раствора, прибавляют одну каплю толуола и встряхивают пробирку. Помещают пробирку в водяную баню при температуре 37 °C и оставляют примерно на 5 минут. Затем добавляют 0,25 см3 реактива для определения \beta - \text{галактозидазы} и перемешивают.

Оставляют пробирку в водяной бане при температуре 37 °C в течение (24 +/- 3) ч, наблюдая за изменением цвета через определенные промежутки времени.

Желтый цвет указывает на положительную реакцию. Изменение цвета обнаруживается примерно через 20 мин.

Бактерии рода Salmonella, кроме S. arizonae, не обладают \beta - \text{галактозидазой} .

Для определения \beta - \text{галактозидазной} активности допускается использование ONPG-дисков. Для этого испытуемые культуры высевают на среду, содержащую лактозу в концентрации 0,1%, или агар Клиглера, или трехсахарный агар, или агар Олькеницкого. Посевы инкубируют в течение (18 +/- 2) ч при температуре (37 +/- 1) °C. Петлей отбирают выросшую культуру и готовят из нее густую суспензию в 0,5 см3 стерильной дистиллированной воды. К полученной суспензии добавляют один ONPG-диск и помещают в водяную баню при температуре (37 +/- 1) °C. Желтое окрашивание, появившееся через 15 — 20 мин, указывает на положительную реакцию. Для окончательного учета отрицательного результата посевы продолжают инкубировать в течение 2, 4 и 24 ч.

8.5.3.6 Определение образования ацетоина (реакция Фогес-Проскауера) (5.2.14)

Суспендируют петлей испытуемую культуру в стерильной пробирке, содержащей 3 см3 VP среды или мясо-пептонного бульона с глюкозой.

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

После инкубации прибавляют две капли раствора креатина, три капли спиртового раствора 1-нафтола и две капли раствора гидроокиси калия, перемешивают содержимое пробирки после прибавления каждого реактива.

Появление через 15 мин от розового до светло-красного окрашивания указывает на положительную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют ацетоина (реакция Фогес-Проскауера отрицательная).

Допускается определение ацетоина проводить без применения раствора креатина. Для этого после инкубирования к 1 см3 отобранной культуральной жидкости прибавляют 0,6 см3 раствора 1-нафтола и 0,2 см3 раствора гидроокиси калия. После прибавления каждого реактива пробирку встряхивают. Появление розового окрашивания через 15 мин указывает на положительную реакцию.

8.5.3.7 Определение образования индола (см. 5.2.15)

Культуры пересевают в пробирку, содержащую 5 см3 триптон/триптофановой среды, или в бульон Хоттингера, или в мясо-пептонный бульон с L-триптофаном. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

После инкубирования к посевам прибавляют по каплям 1 см3 реактива Эрлиха или Ковача, содержимое пробирки перемешивают.

Образование красного кольца указывает на положительную реакцию. Желто-коричневое кольцо указывает на отрицательную реакцию.

Бактерии рода Salmonella не образуют индол.

8.5.3.8 Определение ферментации маннита и сахарозы

Культуры пересевают в среды Гисса с маннитом или сахарозой. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

Бактерии рода Salmonella не ферментируют сахарозу, но ферментируют маннит. При сбраживании маннита цвет среды изменяется, образуется или не образуется газ.

8.5.3.9 Определение подвижности

Культуры пересевают уколом в полужидкий питательный агар или полужидкий мясо-пептонный агар.

Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 3) ч.

При росте подвижных культур отмечается диффузионный рост по всему столбику агара, при росте неподвижных культур — вокруг места укола.

Бактерии рода Salmonella подвижны, кроме S. gallinarum и S. pullorum.

8.5.3.10. Интерпретация биохимических тестов приведена в таблице А.1 (Приложение А).

8.5.4 Серологическая идентификация

8.5.4.1 Общие положения

Определение присутствия соматического O-антигена, антигена вирулентности Vi-, жгутикового H-антигена в изолированных колониях (см. 8.5.2) проводят с помощью реакции агглютинации на предметном стекле с соответствующими сыворотками после исключения самоагглютинирующих штаммов. Сыворотки используют в соответствии с инструкцией изготовителя, если есть отличие от описания, приведенного ниже.

Серологическую идентификацию для подтверждения принадлежности к бактериям рода Salmonella проводят с культурами, предварительно пересеянными на поверхность мясо-пептонного агара или ГРМ-агара.

8.5.4.2 Исключение самоагглютинирующих штаммов

Помещают каплю физиологического раствора на тщательно очищенное предметное стекло. Диспергируют в этой капле часть тестируемой колонии так, чтобы получилась гомогенная и густая суспензия.

Допускается размешивание части колонии в капле воды и перемешивание этого раствора с одной каплей физиологического раствора.

Покачивают осторожно стекло в течение 30 — 60 с. Отмечают результаты на темном фоне, лучше с помощью увеличительного стекла. Если наблюдается в разной степени склеивание бактерий, то есть образование осадка, то считают, что тестируемые штаммы обладают самоагглютинацией.

Штаммы бактерий, обладающие самоагглютинацией, не подвергают дальнейшей серологической идентификации.

8.5.4.3 Определение наличия O-антигенов

Штаммы, у которых не выявлено самоагглютинации, испытывают в реакции агглютинации с агглютинирующими адсорбированными поливалентными сальмонеллезными O-сыворотками основных групп A, B, C, D, E, а затем, если не выявлено O-антигенов с сыворотками основных групп, ставят реакцию с сыворотками редких групп.

Подготовка сывороток к постановке реакции агглютинации и методика ее проведения указаны в инструкции, прилагаемой к сывороткам.

Агглютинация (наличие O-антигенов) проявляется в виде склеивания бактериальной массы и полного или частичного просветления жидкости.

При отрицательной реакции агглютинации культура после тщательного смешивания с каплей сыворотки образует гомогенную смесь.

Используют поли- и моновалентные сыворотки, одну после другой.

8.5.4.4 Определение Vi- и H-антигенов

Наличие Vi- и H-антигенов определяют при необходимости по санитарно-эпидемиологическим показаниям.

Перед выявлением H-антигенов испытуемой культурой инокулируют полужидкий агар. Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (24 +/- 2) ч. Полученную культуру используют для выявления H-антигенов.

Наличие Vi- и H-антигенов определяют, пользуясь указаниями, приведенными в 8.5.4.3.

8.5.5 Интерпретация биохимических и серологических реакций

Интерпретация подтверждающих тестов (см. 8.5.3 и 8.5.4) для испытанных колоний (см. 8.5.2) приведена в таблице 1.

Таблица 1

Интерпретация подтверждающих тестов

При определении биохимических и серологических характеристик выделенных культур в качестве контроля используют типичный по этим показателям штамм бактерий рода Salmonella, указанный в разделе 6.

Культуры, предположительно отнесенные к бактериям рода Salmonella, передают в компетентные аккредитованные центры по изучению этих бактерий для окончательной идентификации. Культуру при этом сопровождают всей полученной информацией с указанием наименования продукта, из которого выделен штамм.

В этом случае результаты выявления бактерий рода Salmonella выдают после получения ответа по окончательной идентификации.

При выявлении бактерий рода Salmonella используют схему, указанную в Приложении Б.

9. Обработка результатов

9.1 Результаты оценивают по каждой пробе в отдельности.

9.2. Результаты выявления бактерий рода Salmonella в определенной массе или объеме продукта записывают: «бактерии рода Salmonella обнаружены или не обнаружены в X г (см3) продукта» (X — масса (объем) продукта, в котором выявляли бактерии рода Salmonella).

10. Протокол испытания

Протокол испытания должен содержать информацию:

• об используемом методе отбора проб;
• использовании каких-либо отклонений в методе обогащения или инкубирования;
• обо всех условиях испытания, не указанных в настоящем стандарте или считающихся необязательными, со всеми деталями, которые могли повлиять на результаты;
• о полученных результатах.

Протокол испытания включает также информацию о том, с использованием какой среды для чашек (см. 5.2.5) получен положительный результат.

Приложение А (обязательное)

ИНТЕРПРЕТАЦИЯ БИОХИМИЧЕСКИХ ТЕСТОВ

Таблица А.1

Количество положительных реакций для штаммов бактерий рода Salmonella

В процентах

Приложение Б (справочное)

СХЕМА ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ РОДА SALMONELLA

Приложение В (обязательное)

СОСТАВ И ПРИГОТОВЛЕНИЕ ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД И РЕАКТИВОВ

В.1. Забуференная пептонная вода

В.1.1. Состав:

• пептон — 10,0 г;
• хлористый натрий — 5,0 г;
• двузамещенный фосфорнокислый натрий 12-водный (Na2HPO4·12H2O) — 9,0 г;
• однозамещенный фосфорнокислый калий (KH₂PO₄) — 1,5 г;
• вода — 1000 см3.

В.1.2. Приготовление

При нагревании компоненты растворяют в воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Среду разливают во флаконы подходящей вместимости с учетом добавления необходимой навески продукта. Если навеска равна 25 г, то забуференную пептонную воду разливают по 225 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C.

В.2. Среда Раппапорта-Вассилиадиса с соей (RVS-бульон)

В.2.1. Раствор A

В.2.1.1. Состав:

• ферментативный гидролизат сои — 5,0 г;
• хлористый натрий — 8,0 г;
• фосфорнокислый однозамещенный калий (KH2PO4) — 1,4 г;
• фосфорнокислый двузамещенный калий (K2HPO4) — 0,2 г;
• вода — см3.

В.2.1.2. Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании до температуры около 70 °C. Раствор готовят за день до приготовления RVS-бульона.

В.2.2. Раствор B

В.2.2.1. Состав:

• хлористый магний 6-водный (MgCl₂·6H₂O) — 400 г;
• вода — 1000 см3.

В.2.2.2. Приготовление

Хлористый магний растворяют в воде. Поскольку эта соль очень гигроскопична, рекомендуется из новой открытой упаковки растворять ее по определенной схеме. Например, к 250 г хлористого магния 6-водного добавляют 625 см3 воды, получая раствор объемом 788 см3 массовой концентрации 31,7 г/100 см3. Состав раствора соответствует В.2.2.1. Раствор переносят в бутылку из темного стекла с притертой пробкой и хранят при комнатной температуре не более двух лет.

В.2.3. Раствор C

В.2.3.1. Состав:

• малахитовый зеленый оксалат — 0,4 г;
• вода — 100 см3.

В.2.3.2. Приготовление

Малахитовый зеленый оксалат переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор переносят в бутылку из темного стекла, хранят при комнатной температуре не более 8 мес.

В.2.4. Готовая среда

В.2.4.1. Состав:

• раствор A (см. В.2.1) — 1000 см3;
• раствор B (см. В.2.2) — 100 см3;
• раствор C (см. В.2.3) — 10 см3.

В.2.4.2. Приготовление

Прибавляют к 1000 см3 раствора A, 100 см3 раствора B и 10 см3 раствора C. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (5,2 +/- 0,2). Перед использованием среду разливают по пробиркам по 10 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (115 +/- 1) °C. Рекомендуется использовать среду в день приготовления. При необходимости допускается готовую среду хранить по ГОСТ 10444.1.

Следует учитывать, что на этой среде не растет S. Typhi.

Примечание. Конечный состав среды: ферментативный гидролизат сои — 4,5 г/дм3; хлористый натрий — 7,2 г/дм3; фосфорнокислый однозамещенный калий — 1,26 г/дм3, фосфорнокислый двузамещенный калий — 0,18 г/дм3; хлористый магний безводный — 13,4 г/дм3 или хлористый магний 6-водный — 28,6 г/дм3; малахитовый зеленый оксалат — 0,036 г/дм3.

В.3. Селенитовая среда

Селенитовую среду готовят из двух растворов.

В.3.1. Раствор 1

В.3.1.1. Состав:

• пептон — 5,0 г;
• двузамещенный фосфорнокислый натрий безводный — 7,0 г;
• однозамещенный фосфорнокислый натрий — 3,0 г;
• лактоза — 4,0 г;
• вода — 1000 см3.

В.3.1.2. Приготовление

При нагревании растворяют компоненты в воде. Путем изменения соотношения фосфатных солей устанавливают pH (7,0 +/- 0,1). Среду разливают по 100 см3 в колбы или флаконы и стерилизуют текучим паром по 30 мин в течение двух дней или при температуре (112 +/- 1) °C в течение 30 мин.

В.3.2. Раствор 2

В.3.2.1. Состав:

• кислый селенистокислый натрий (NaHSeO3) — 10,0 г;
• вода — 100 см3.

Кислый селенистокислый натрий растворяют с соблюдением правил асептики в стерильной дистиллированной воде. Раствор готовят непосредственно перед употреблением.

В.3.3. Готовая среда

В.3.3.1. Состав:

• раствор 1 — 100 см3;
• раствор 2 — 4 см3.

В.3.3.2. Приготовление среды

К раствору 1 прибавляют раствор 2, среду разливают по 10 см3 в пробирки.

Стерилизация приготовленной среды не допускается, так как при этом происходит редукция кислого селенистокислого натрия, выпадает осадок красного цвета и среда становится непригодной для использования.

Селенитовую среду выпускают в сухом виде и готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.4. Тетратионатный бульон Мюллер-Кауфман

В.4.1. Основа среды

В.4.1.1. Состав:

• мясо-пептонный бульон — 100 см3;
• углекислый кальций — 4,5 г.

В.4.1.2. Приготовление среды

В мясо-пептонный бульон, приготовленный по ГОСТ 10444.1, помещают стерильный углекислый кальций. Углекислый кальций стерилизуют по ГОСТ 10444.1.

Приготовленную основу стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

В.4.2. Раствор 1

В.4.2.1. Состав:

• гипосульфит натрия (Na₂S₂O₃·5H₂O) — 50 г;
• вода — до 100 см3.

В.4.2.2. Приготовление

Гипосульфит натрия помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор переливают в колбу или флакон и стерилизуют текучим паром в течение 30 мин или при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре (3 +/- 2) °C.

В.4.3. Раствор 2

В.4.3.1. Состав:

• йодистый калий — 25 г;
• йод кристаллический — 20 г;
• вода — до 100 см3.

В.4.3.2. Приготовление

Йодистый калий помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в небольшом количестве дистиллированной воды, прибавляют кристаллический йод, растворяют его. Объем раствора доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят при комнатной температуре в плотно закрытом сосуде из темного стекла.

В.4.4. Раствор 3

В.4.4.1. Состав:

• бриллиантовый зеленый — 0,5 г;
• вода — 100 см3.

В.4.4.2. Приготовление

Бриллиантовый зеленый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

В.4.5. Раствор 4

В.4.5.1. Состав:

• сухая бычья желчь — 10 г;
• вода — до 100 см3.

В.4.5.2. Приготовление

Сухую желчь растворяют в 100 см3 дистиллированной воды или используют 100 см3 натуральной желчи. Раствор желчи или натуральную желчь стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин. Раствор хранят не более 1 мес при температуре (3 +/- 2) °C.

В.4.6. Готовая среда

В.4.6.1. Состав:

• основа среды по В.4.1 — 100 см3;
• раствор 1 — 10 см3;
• раствор 2 — 2 см3;
• раствор 3 — 0,2 см3;
• раствор 4 — 5 см3.

В.4.6.2. Приготовление

Указанные растворы прибавляют к основе среды в приведенном выше порядке, перемешивая смесь после каждого прибавления, среду разливают по 10 см3 в пробирки.

Среду используют в день приготовления.

Для повышения селективности среды допускается добавлять к среде раствор новобиоцина натриевой соли из расчета 0,5 см3 раствора новобиоцина натриевой соли на 100 см3 основы среды.

В.4.7. Раствор новобиоцина

В.4.7.1. Состав:

• новобиоцин натриевая соль — 0,04 г;
• вода — 5 см3.

В.4.7.2. Приготовление

Новобиоцин натриевую соль растворяют в дистиллированной воде. Раствор стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через мембранный фильтр размером пор 0,22 мкм, хранят при температуре (3 +/- 2) °C в течение четырех недель.

В.5. Ксилоза-лизин-деоксихолатный агар (XLD-агар)

В.5.1. Основа среды

В.5.1.1. Состав:

• дрожжевой экстракт (порошок) — 3,0 г;
• хлористый натрий (NaCl) — 5,0 г;
• ксилоза — 3,75 г;
• лактоза — 7,5 г;
• сахароза — 7,5 г;
• L-лизин гидрохлорид — 5,0 г;
• тиосульфат натрия — 6,8 г;
• железо III аммоний цитрат — 0,8 г;
• феноловый красный — 0,08 г (или 20 см3 раствора, приготовленного по 5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
• деоксихолат натрия — 1,0 г;
• агар — от 9 до 18 г <*>;
• вода — 1000 см3.

<*> Зависит от желирующих свойств.

В.5.1.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, но не кипятят, избегая перегрева.

Устанавливают pH так, чтобы после прогрева он составлял (7,4 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают основу в пробирки или флаконы подходящей вместимости. Затем прогревают на кипящей водяной бане около 5 мин.

В.5.2. Раствор фенолового красного

В.5.2.1. Состав:

• феноловый красный — 0,4 г;
• вода — 100 см3.

В.5.2.2. Приготовление

Феноловый красный переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в дистиллированной воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят дистиллированной водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре.

В.5.3. Приготовление чашек со средой

Среду после прогрева переносят в водяную баню при температуре от 44 °C до 47 °C, перемешивают и разливают в чашки, дают затвердеть. Перед использованием среду в чашках предпочтительно с открытой крышкой и поверхностью среды вниз подсушивают в шкафу с температурой от 37 °C до 55 °C до тех пор, пока поверхность среды не станет сухой. Допускается хранить чашки со средой при температуре (3 +/- 2) °C не более пяти дней.

В.6. Дифференциально-диагностические среды

В.6.1. Висмут-сульфит агар (агар Вильсон-Блера).

В.6.2. Среда Плоскирева.

В.6.3. Среда Эндо.

В.6.4. Среда Левина.

Среды готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.6.5. Бриллиантовый зеленый агар

В.6.5.1. Состав:

• дрожжевой экстракт — 3 г;
• пептон — 10 г;
• хлористый натрий — 5 г;
• лактоза — 10 г;
• сахароза — 10 г;
• феноловый красный — 0,08 г (или 20 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);
• агар — 20 г;
• бриллиантовый зеленый — 0,0125 г (или 2,5 см3 раствора, приготовленного по В.4.4);
• вода — 1000 см3.

В.6.5.2. Приготовление

При нагревании растворяют дегидратированные компоненты основы или дегидратированную основу в воде при частом помешивании. Доводят до кипения, кипятят 1 мин.

Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 +/- 0,1) при температуре 25 °C. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C. Охлаждают до температуры от 45 °C до 50 °C и разливают в чашки Петри.

В.7. Питательный агар

В.7.1. Состав:

• мясной экстракт — 3 г;
• пептон — 5 г;
• агар — от 9 до 18 г;
• вода — 1000 см3.

В.7.2. Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Переносят питательную среду в пробирки или флаконы, стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C.

В.7.3. Приготовление чашек с питательным агаром

Переносят приблизительно 15 см3 расплавленной среды в стерильные чашки Петри и поступают по В.5.3.

В.8. Мясо-пептонный агар

Мясо-пептонный агар готовят по ГОСТ 10444.₁ или используют ГРМ-агар.

ГРМ-агар готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.9. Мясо-пептонный бульон с глюкозой

Мясо-пептонный бульон с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6 — 7 см3.

В.10. Среды с углеводами (среды Гисса)

Среды с углеводами (среды Гисса) готовят по ГОСТ 10444.1 или используют сухие среды с углеводами, которые готовят по инструкции, указанной на этикетке.

В.11. Трехсахарный железистый агар (TSI-агар)

В.11.1. Состав:

• мясной экстракт — 3,0 г;
• дрожжевой экстракт — 3,0 г;
• пептон — 20,0 г;
• хлористый натрий (NaCl) — 5,0 г;
• лактоза — 10,0 г;
• сахароза — 10,0 г;
• глюкоза — 1,0 г;
• железо (III) цитрат — 0,3 г;
• тиосульфат натрия — 0,3 г;
• феноловый красный — 0,024 г (или 6 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);

агар — от 9 до 18 г;

вода — 1000 см3.

В.11.2. Приготовление

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (7,4 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Переносят среду в пробирки по 7 — 8 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при (121 +/- 1) °C. Затем пробирки оставляют в наклонном положении так, чтобы высота столбика среды составляла около 2,5 см, а скошенная поверхность над ним — 5 см.

Допускается использование агара Клиглера или среды Олькеницкого. Среды готовят по инструкциям, указанным на этикетках.

В.12. Агар с мочевиной (агар Кристенсена)

В.12.1. Основа среды

Состав:

пептон — 1,0 г;

глюкоза — 1,0 г;

хлористый натрий (NaCl) — 5,0 г;

однозамещенный фосфорнокислый калий (KH2PO4) — 2,0 г;

феноловый красный — 0,012 г (или 3 см3 раствора, приготовленного по В.5.2, если среда состоит из отдельных компонентов);

• агар — от 9 до 18 г;
• вода — 1000 см3.

В.12.1.2. Приготовление

При нагревании растворяют компоненты или дегидратированную основу среды в воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Основу среды в определенных объемах разливают в колбы или флаконы и стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

В.12.2. Раствор мочевины

В.12.2.1. Состав:

• мочевина — 40 г;
• вода до конечного объема — 100 см3.

В.12.2.2. Приготовление

Мочевину помещают в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в воде, объем раствора доводят водой до метки. Раствор мочевины стерилизуют фильтрацией по ГОСТ 26670 через фильтры с размером пор 0,22 мкм или текучим паром в течение 30 мин.

В.12.3. Раствор фенолового красного

В.12.3.1. Состав и приготовление — по В.5.2.

В.12.4. Готовая среда

В.12.4.1. Состав:

• основа (см. В.12.1) — 950 см3;
• раствор мочевины (см. В.12.2) — 50 см3.

В.12.4.2. Приготовление

Прибавляют с соблюдением правил асептики раствор мочевины к основе, предварительно расплавленной и охлажденной до температуры от 44 °C до 47 °C. Разливают готовую среду в стерильные пробирки 7 — 8 см3. После стерилизации среду скашивают по В.11.2.

В.13. L-Лизиндекарбоксилазная среда

В.13.1. Состав:

• L-лизин моногидрохлорид — 5,0 г;
• дрожжевой экстракт — 3,0 г;
• глюкоза — 1,0 г;
• бромкрезоловый пурпуровый — 0,015 г (или 5 см3 раствора, приготовленного по В.13.3);
• вода — 1000 см3.

В.13.2. Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании.

Устанавливают pH так, чтобы после стерилизации он составлял (6,8 +/- 0,2) при температуре 25 °C.

Переносят среду в пробирки по 2 — 5 см3.

Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C.

В.13.3. Раствор бромкрезолового пурпурового

В.13.3.1. Состав:

• бромкрезоловый пурпуровый — 0,3 г;
• вода — 100 см3.

В.13.3.2. Приготовление

Бромкрезоловый пурпуровый переносят в фарфоровую ступку и постепенно растворяют в воде. Раствор переливают в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят водой до метки. Раствор хранят в закрытом сосуде из темного стекла при комнатной температуре не более 3 мес.

В.14. \beta - \text{Галактозидазный} реактив

В.14.1. Буферный раствор

В.14.1.1. Состав:

• фосфорнокислый однозамещенный натрий (NaH₂PO₄) — 6,9 г;
• гидроксид натрия (NaOH) концентрации 10 моль/дм3 — около 3 см3;
• вода до конечного объема — 50 см3.

В.14.1.2. Приготовление

Растворяют фосфорнокислый однозамещенный натрий приблизительно в 45 см3 воды в мерном флаконе.

Устанавливают pH с помощью раствора гидроксида натрия (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Добавляют воду до объема 50 см3.

В.14.2. ONPG-раствор

В.14.2.1. Состав:

• o - \text{Нитрофенил} - \beta - D - \text{галактопиранозид} (ONPG) — 0,08 г;
• вода — 15 см3.

В.14.2.2. Приготовление

Растворяют ONPG в воде температурой около 50 °C. Раствор охлаждают.

В.14.3. Готовый реактив

В.14.3.1. Состав:

• буферный раствор (см. В.14.1) — 5 см3;
• ONPG-раствор (см. В.14.2) — 15 см3.

В.14.3.2. Приготовление

Готовят свежий раствор, прибавляя буферный раствор к ONPG-раствору.

В.15. Среда и реактивы для реакции Фогес-Проскауера (VP)

В.15.1. VP-среда

В.15.1.1. Состав:

• пептон — 7 г;
• глюкоза — 5 г;
• фосфорнокислый двузамещенный калий (K₂HPO₄) — 5 г;
• вода — 1000 см3.

В.15.1.2. Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (6,9 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Среду разливают в пробирки по 3 см3. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C.

В.15.2. Раствор креатина (N-амидиносаркозина)

В.15.2.1. Состав:

• креатин моногидрат — 0,5 г;
• вода — 100 см3.

В.15.2.2. Приготовление

Креатин моногидрат растворяют в воде.

В.15.3. 1-нафтол, спиртовой раствор

В.15.3.1. Состав:

• 1-нафтол — 6 г;
• спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья объемной долей 96% — 100 см3.

В.15.3.2. Приготовление

Растворяют 1-нафтол в этаноле.

В.15.4. Раствор гидроксида калия

В.15.4.1. Состав:

• гидроксид калия (KOH) — 40 г;
• вода — 100 см3.

В.15.4.2. Приготовление

Гидроксид калия растворяют в воде.

В.16. Реактивы для индольной реакции

В.16.1. Реактив Ковача

В.16.1.1. Состав:

• 4-диметиламинобензальдегид — 5 г;
• соляная кислота плотностью \rho = 1,18 г/см3 \div 1,19 г/см3 — 25 см3;
• 2-метилбутан-2-ол (изобутиловый спирт) — 75 см3.

В.16.1.2. Приготовление

Компоненты перемешивают.

В.16.2. Реактив Эрлиха

В.16.2.1. Состав:

• парадиметиламинобензальдегид — 1 г;
• этиловый спирт объемной долей 96% — 95 см3;
• соляная кислота плотностью \rho = 1,18 г/см3 \div 1,19 г/см3 — 80 см3.

В.16.2.2. Приготовление

Компоненты перемешивают.

В.17. Триптон/триптофановая среда

В.17.1. Состав:

• триптон — 10 г;
• хлористый натрий (NaCl) — 5 г;
• DL-триптофан — 1 г;
• вода — 1000 см3.

В.17.1.2. Приготовление

Компоненты растворяют в горячей воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (7,5 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают среду по 5 см3 в пробирки. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C.

В.18. Бульон Хоттингера

Бульон Хоттингера готовят по ГОСТ 10444.1. Для посевов используют среду, разлитую в пробирки по 6 — 7 см3.

В.19. Мясо-пептонный бульон с 0,05% L-триптофана

В.19.1. Состав:

• L-триптофан — 0,05 г;
• мясо-пептонный бульон — 100 см3.

В.19.2. Приготовление

L-триптофан растворяют в мясо-пептонном бульоне, приготовленном по ГОСТ 10444.1, разливают в пробирки по 6 — 7 см3 и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 20 мин.

В.20. Полужидкий питательный агар

В.20.1. Состав:

• мясной экстракт — 3,0 г;
• пептон — 5,0 г;
• агар — от 4 до 9 г <*>;
• вода — 1000 см3.

<*> Зависит от желирующих свойств.

В.20.2. Приготовление

Компоненты растворяют в воде при нагревании. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают среду во флаконы подходящей вместимости. Стерилизуют 15 мин в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C.

В.20.3. Приготовление пробирок с агаром

В стерильные пробирки наливают по 6 — 7 см3 свежеприготовленного агара.

В.21. Полужидкий мясо-пептонный агар

Готовят по ГОСТ 10444.1 так же, как мясо-пептонный агар, но при приготовлении добавляют 4,0 — 9,0 г агара на 1 дм3 мясо-пептонного бульона, перед стерилизацией среду разливают по 6 — 7 см3 в пробирки.

В.22. Физиологический раствор

В.22.1. Состав:

• хлористый натрий (NaCl) — 8,5 г;
• вода — 1000 см3.

В.22.2. Приготовление

Хлористый натрий растворяют в воде. Устанавливают такой pH, чтобы после стерилизации он составлял (7,0 +/- 0,2) при температуре 25 °C. Разливают во флаконы подходящей вместимости, стерилизуют в автоклаве при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

Допускается использование готовых и дегидратированных, в том числе хромогенных, питательных сред аналогичного состава и зарегистрированных на территории государств, принявших стандарт.

Приложение ДА (справочное)

СВЕДЕНИЯ О СООТВЕТСТВИИ ССЫЛОЧНЫХ МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫХ СТАНДАРТОВ МЕЖДУНАРОДНЫМ СТАНДАРТАМ

Таблица ДА.1