ГОСТ 31644-2012. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение 5-гидроксиметилфурфурола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

(введен в действие Приказом Росстандарта от 26.09.2012 № 438-ст)

(ред. от 30.08.2016)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ Р 53694-2009"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-r-53694-2009" "ГОСТ Р 53694-2009. Национальный стандарт Российской Федерации. Продукция соковая. Определение 5-гидроксиметилфурфурола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (утв. и вв"
  n1["ГОСТ 31644-2012"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-31644-2012" "ГОСТ 31644-2012. Межгосударственный стандарт. Продукция соковая. Определение 5-гидроксиметилфурфурола методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (введен в действие Приказом"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

Введен в действие Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 сентября 2012 г. № 438-ст

МЕЖГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ

ПРОДУКЦИЯ СОКОВАЯ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ 5-ГИДРОКСИМЕТИЛФУРФУРОЛА МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

Juice products. Determination of 5-Hydroxymethylfurfural (HMF) by High Performance Liquid Chromatography (HPLC) method

ГОСТ 31644-2012

Группа Н59

МКС 67.080

67.050

Дата введения 1 июля 2013 года

Предисловие

Цели, основные принципы и основной порядок проведения работ по межгосударственной стандартизации установлены ГОСТ 1.0-92 «Межгосударственная система стандартизации. Основные положения» и ГОСТ 1.2-2009 «Межгосударственная система стандартизации. Стандарты межгосударственные, правила и рекомендации по межгосударственной стандартизации. Правила разработки, принятия, применения, обновления и отмены».

Сведения о стандарте

1. Разработан Некоммерческой организацией «Российский союз производителей соков» (НО «РСПС») при участии Государственного научного учреждения «НИИ питания» Российской академии медицинских наук (ГНУ «НИИ питания» РАМН), ЗАО «Мултон» и Государственного научного учреждения «ВНИИ консервной и овощесушильной промышленности» (ГНУ «ВНИИКОП»).

2. Внесен Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии.

3. Принят Межгосударственным советом по стандартизации, метрологии и сертификации (Протокол № 50 от 20 июля 2012 г.).

За принятие проголосовали:

4. Приказом Федерального агентства по техническому регулированию и метрологии от 26 сентября 2012 г. № 438-ст межгосударственный стандарт ГОСТ 31644-2012 введен в действие в качестве национального стандарта Российской Федерации с 1 июля 2013 г.

5. Настоящий стандарт подготовлен на основе применения ГОСТ Р 53694-2009.

6. Введен впервые.

Информация о введении в действие (прекращении действия) настоящего стандарта публикуется в указателе «Национальные стандарты».

Информация об изменениях к настоящему стандарту публикуется в указателе «Национальные стандарты», а текст изменений — в информационных указателях «Национальные стандарты». В случае пересмотра или отмены настоящего стандарта соответствующая информация будет опубликована в информационном указателе «Национальные стандарты».

1. Область применения

Настоящий стандарт распространяется на фруктовые и овощные соки и нектары, концентрированные соки, пюре и концентрированные пюре, морсы и концентрированные морсы, сокосодержащие напитки, соковую продукцию из фруктов и овощей обогащенную и для детского питания (далее — соковая продукция) и устанавливает метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) для определения массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола (5-ГМФ).

Нижний предел измерений массовой концентрации (массовой доли) 5-гидроксиметилфурфурола составляет 1\text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) . Верхний предел измерений массовой концентрации (массовой доли) 50\text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) .

2. Нормативные ссылки

В настоящем стандарте использованы ссылки на межгосударственные стандарты:

ГОСТ ISO 3696-2013 <*> Вода для лабораторного анализа. Технические требования и методы контроля

(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 52501-2005 (ИСО 3696:1987) «Вода для лабораторного анализа. Технические условия».

(сноска введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ ИСО 5725-1-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 1. Основные положения и определения

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-1-2002.

(сноска введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Ссылка исключена с 1 января 2017 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст.

ГОСТ ИСО 5725-6-2003 <*> Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений. Часть 6. Использование значений точности на практике

(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р ИСО 5725-6-2002.

(сноска введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ 12.1.005-88 Система стандартов безопасности труда. Общие санитарно-гигиенические требования к воздуху рабочей зоны

ГОСТ 12.1.007-76 Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности

ГОСТ 12.1.010-76 Система стандартов безопасности труда. Взрывобезопасность. Общие требования

ГОСТ 12.1.018-93 Система стандартов безопасности труда. Пожаровзрывобезопасность статического электричества. Общие требования

ГОСТ 12.1.019-79 <*> Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

<*> В Российской Федерации действует ГОСТ Р 12.1.019-2009.

(сноска введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ 1770-74 (ИСО 1042-83, ИСО 4788-80) Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия

Ссылка исключена с 1 января 2017 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст.

ГОСТ 4198-75 Реактивы. Калий фосфорнокислый однозамещенный. Технические условия

(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ 6552-80 Реактивы. Кислота ортофосфорная. Технические условия

(ссылка введена Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ 12026-76 Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия

ГОСТ 18270-72 Кислота уксусная особой чистоты. Технические условия

ГОСТ 22967-90 (СТ СЭВ 2486-80, СТ СЭВ 3399-81) Шприцы медицинские инъекционные многократного применения. Общие технические требования и методы испытаний

Ссылка исключена с 1 января 2017 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст.

ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры

ГОСТ 26313-2014 Продукты переработки фруктов и овощей. Правила приемки и методы отбора проб

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ 26671-2014 Продукты переработки фруктов и овощей, консервы мясные и мясорастительные. Подготовка проб для лабораторных анализов

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

ГОСТ 29169-91 (ИСО 648-77) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой

ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81) Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.

Примечание. При пользовании настоящим стандартом целесообразно проверить действие ссылочных стандартов по указателю «Национальные стандарты», составленному по состоянию на 1 января текущего года, а также по соответствующим, ежемесячно издаваемым, информационным указателям, опубликованным в текущем году. Если ссылочный стандарт заменен (изменен), то при пользовании настоящим стандартом следует руководствоваться заменяющим (измененным) стандартом. Если ссылочный стандарт отменен без замены, то положение, в котором дана ссылка на него, применяется в части, не затрагивающей эту ссылку.

3. Сущность метода

(раздел 3 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Метод основан на количественном определении 5-гидроксиметилфурфурола с помощью обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и спектрофотометрическим детектированием в ультрафиолетовой области спектра при длине волны 284 нм.

4. Средства измерений, вспомогательное оборудование, посуда, материалы, реактивы

4.1. Хроматограф жидкостный высокоэффективный со спектрофотометрическим детектором (рабочий диапазон длин волн поглощения от 200 до 600 нм) и программно-аппаратным комплексом сбора и обработки результатов типа «Millenium 2000».

4.2 Спектрофотометр со значениями характеристик не ниже следующих:

спектральный рабочий диапазон — 200 — 800 нм;

пределы допускаемой абсолютной погрешности измерений по шкале длин волн +/- 0,1 нм;

пределы допускаемой воспроизводимости измерений по шкале длин волн +/- 0,08 нм;

пределы допускаемой абсолютной погрешности измерений спектрофотометра +/- 0,5%.

(п. 4.2 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

4.3. Колонка хроматографическая длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная октадецилсиликагелем, размером частиц 5 мкм <1>, и обеспечивающая требуемую эффективность разделения.

<1> Например, колонка хроматографическая «BDS Hypersil C18» (250 x 4,6 мм) компании Thermo; материал — силикагель с привитыми группами C18; колонка хроматографическая «AQUASIL C18» (250 x 4,6 мм) компании Thermo; материал — силикагель с привитыми группами C18. Данная информация является рекомендуемой, приведена для удобства пользователей настоящего стандарта и не исключает возможность использования других хроматографических колонок.

(п. 4.3 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

4.4 Микрошприцы для ВЭЖХ вместимостью 25, 100 и 250 мкл.

4.5. Весы неавтоматического действия по ГОСТ OIML R 76-1 с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания +/- 0,1 мг.

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

4.6 Мини-насос лабораторный (к установке для дегазации элюента).

4.7. Центрифуга лабораторная с величиной фактора разделения (g-фактор) 800 — 1000.

4.8. Фильтры мембранные с диаметром пор 0,20 и 0,45 мкм для фильтрования подвижной фазы и проб.

4.9. Пипетки 1-2-1, 1-2-5, 1-2-10 2-го класса точности по ГОСТ 29169.

4.10. Пипетки градуированные 1-2-25 по ГОСТ 29227 вместимостью 25 см3 или дозаторы пипеточные с аналогичным или изменяемым объемом доз с относительной погрешностью дозирования +/- 1%.

4.11. Колбы мерные с одной отметкой вместимостью 25, 50, 100, 500, 1000 см3 по ГОСТ 1770.

4.12 Цилиндр мерный вместимостью 1000 см3 по ГОСТ 1770.

4.13 Посуда лабораторная стеклянная по ГОСТ 25336:

колбы круглодонные вместимостью 1000 см3;

воронка лабораторная;

стаканы вместимостью 50, 100, 250, 500, 1000 см3.

4.14 Емкости для проб (виалы) вместимостью 2 — 6 см3.

4.15. Кюветы кварцевые для спектрофотометрии с длиной оптического пути 10 мм.

4.16 Установка для дегазации элюента.

4.17 Бумага фильтровальная по ГОСТ 12026.

4.18. Исключен с 1 января 2017 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст.

4.19. Вода для лабораторного анализа 1-й степени чистоты по ГОСТ ISO 3696.

(п. 4.19 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

4.20 Ацетонитрил для ВЭЖХ.

4.21. Калий фосфорнокислый однозамещенный (дигидрофосфат) (KH₂PO₄) по ГОСТ 4198, ч.д.а.

(п. 4.21 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

4.22. 5-гидроксиметилфурфурол особой чистоты с массовой долей основного вещества не менее 97% или 5-гидроксиметилфурфурол с массовой долей основного вещества не менее 99%.

4.23 Шприц медицинский 5 см3 по ГОСТ 22967.

4.24 Стаканчики для взвешивания СВ-24/10 (30 x 50).

4.25 Фильтры обеззоленные.

Допускается применение других средств измерений, вспомогательного оборудования, не уступающих вышеуказанным по метрологическим и техническим характеристикам и обеспечивающим необходимую точность измерения, а также реактивов и материалов по качеству не хуже вышеуказанных.

4.26. Кислота ортофосфорная с массовой долей основного вещества не менее 98% по ГОСТ 6552, ч.д.а.

(п. 4.26 введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

4.27 Иономер (pH-метр) с погрешностью измерения +/- 0,05 ед. pH.

(п. 4.27 введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

5. Отбор и подготовка проб

Отбор проб — по ГОСТ 26313, подготовка проб — по ГОСТ 26671.

6. Подготовка к проведению определения

6.1 Приготовление подвижных фаз (элюентов) для жидкостной хроматографии

6.1.1 Подвижная фаза А

В мерной колбе по ГОСТ 1770 вместимостью 1000 см3 последовательно смешивают 840 см3 воды для лабораторного анализа 1-й степени чистоты по ГОСТ ISO 3696, 150 см3 ацетонитрила (см. 4.20) и 10 см3 уксусной кислоты особой чистоты по ГОСТ 18270. Раствор переносят в емкость для элюента (см. 4.16) с завинчивающейся крышкой и перемешивают. Полученный раствор дегазируют на установке для дегазации элюента (см. 4.16) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок хранения раствора при условии визуального отсутствия нерастворимых веществ при комнатной температуре без воздействия света — одна неделя.

6.1.2 Подвижная фаза Б

6.1.2.1 Приготовление раствора дигидрофосфата калия (pH = 3,0) молярной концентрации 50 ммоль/дм3

6,8 г дигидрофосфата калия взвешивают в стакане вместимостью 100 см3 с точностью до третьего десятичного знака, растворяют в приблизительно 80 см3 воды для лабораторного анализа, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 1000 см3, доводят водой для лабораторного анализа по ГОСТ ISO 3696 до метки и перемешивают. Раствор переносят в мерный стакан вместимостью 1000 см3 и доводят pH до значения 3,0 ед. pH фосфорной кислотой, регистрируя показания иономером. Полученный раствор дегазируют на установке для дегазации элюента (см. 4.16) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

6.1.2.2 Приготовление подвижной фазы (элюента)

В мерный цилиндр вместимостью 1000 см3 приливают 950 см3 раствора дигидрофосфата калия (pH = 3), приготовленного по 6.1.2, 50 см3 ацетонитрила (см. 4.20) и перемешивают. Полученный раствор дегазируют на установке для дегазации элюента (см. 4.16) под вакуумом в течение 15 мин с одновременной фильтрацией через мембранный фильтр с диаметром пор 0,45 мкм.

Срок хранения раствора при условии визуального отсутствия нерастворимых веществ, при комнатной температуре без воздействия света — 5 сут.

Примечание. Подвижную фазу Б используют в случае, если подвижная фаза А не обеспечивает необходимую степень разделения пиков ГМФ и патулина на хроматограмме (коэффициент разрешения для хроматографических пиков Rs >= 1,0).

(подраздел 6.1 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

6.2 Подготовка проб для определения

6.2.1. Определение массовой концентрации 5-гидроксиметилфурфурола в осветленных соках и сокосодержащих напитках, не содержащих нерастворимые в воде вещества, проводят без предварительного разбавления пробы дистиллированной водой.

Определение 5-гидроксиметилфурфурола в соковой продукции (при его вероятно высокой массовой концентрации) проводят после предварительного разбавления пробы дистиллированной водой в соотношении: с осветленными соками или сокосодержащими напитками 1:3 — 1:10, с концентрированными соками 1:25 — 1:50.

Определение массовой концентрации 5-гидроксиметилфурфурола в осветленных соках и сокосодержащих напитках, содержащих нерастворимые в дистиллированной воде вещества, проводят после фильтрования пробы через обеззоленный фильтр «белая лента» или ее центрифугирования по 4.7 с фактором разделения не менее 990 g в течение 15 мин.

Затем 1 — 2 см3 пробы отбирают в медицинский шприц по 4.23 через иглу, после этого заменяют иглу на фильтр с диаметром пор 0,45 или 0,20 мкм и отфильтровывают в виалу по 4.14.

6.2.2. Определение массовой концентрации 5-гидроксиметилфурфурола в соках и сокосодержащих напитках с объемной долей мякоти до 10,0% включительно (соки и нектары из цитрусовых, ананаса, персика, абрикоса и др.) или содержащих нерастворимые в воде вещества, проводят после тщательного перемешивания пробы стеклянной палочкой, а затем центрифугирования с фактором разделения не менее 990 g в течение 15 мин.

Соки и сокосодержащие напитки с объемной долей мякоти свыше 10,0% (из манго, томата, банана и др.) предварительно разбавляют дистиллированной водой в соотношении 1:5 для осветления раствора. Для этого в мерную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 50 см3 мерным цилиндром по ГОСТ 1770 отбирают 10 см3 пробы и доводят дистиллированной водой до метки. После этого пробу гомогенизируют перемешиванием стеклянной палочкой и центрифугируют с фактором разделения не менее 990 g в течение 15 мин. В случае неполного осаждения нерастворимых в дистиллированной воде частиц с плотностью менее единицы пробу вновь фильтруют через обеззоленный фильтр «белая лента» или центрифугируют с фактором разделения не менее 990 g в течение 15 мин.

Затем 1 — 2 см3 пробы с осветленным раствором отбирают в медицинский шприц через иглу, заменяют иглу на фильтр с диаметром пор 0,45 или 0,20 мкм и отфильтровывают в виалу.

6.2.3. Определение массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в концентрированных соках проводят после предварительного разбавления пробы дистиллированной водой весовым методом в соотношении 1:5. Для этого на весах с пределом допускаемой абсолютной погрешности +0,2 мг в стакане вместимостью 50 см3 по 4.24 взвешивают 5 — 7 г концентрированного сока с записью результата до третьего знака после запятой, прибавляют дистиллированную воду до получения общей массы пробы 25 — 35 г с записью результата до третьего знака после запятой. Делением общей массы пробы на массу концентрированного сока до разбавления водой вычисляют величину разбавления (разведения), которую учитывают при обработке результатов. В случае, если концентрированный сок представляет собой пюре, при разбавлении которого образуются нерастворимые в дистиллированной воде вещества, пробу дополнительно центрифугируют в соответствии с аналогичными требованиями 6.2.2.

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Затем 1 — 2 см3 пробы с осветленным раствором отбирают в медицинский шприц через иглу, заменяют иглу на фильтр с диаметром пор 0,45 или 0,20 мкм и отфильтровывают в виалу.

6.2.4. Для определения массовой концентрации 5-гидроксиметилфурфурола подготовку проб проводят по 6.2.1, 6.2.2, для определения массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола подготовку проб проводят по 6.2.3.

6.3 Приготовление стандартных растворов 5-гидроксиметилфурфурола

6.3.1 Приготовление основного стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола массовой концентрацией 1000 мг/дм3

В стакане вместимостью 50 см3 взвешивают 0,025 г 5-гидроксиметилфурфурола по 4.22 с точностью до третьего знака после запятой, растворяют ориентировочно в 15 см3 ацетонитрила по 4.20, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 25 см3, доводят ацетонитрилом до метки и перемешивают.

Срок хранения раствора при температуре 4 °C — 1 мес, при комнатной температуре — 1 нед.

6.3.2 Приготовление рабочего стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола массовой концентрацией 1 — 7 мг/дм3

Из основного стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола готовят рабочий стандартный раствор 5-гидроксиметилфурфурола для определения точной массовой концентрации основного стандартного раствора. Для этого в мерную колбу вместимостью 50 см3 приливают ориентировочно 20 см3 ацетонитрила, вносят пипеточным дозатором 50 — 350 мкл основного стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола, подготовленного по 6.3.1, доводят ацетонитрилом до метки и тщательно перемешивают.

Для определения точной массовой концентрации основного стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола регистрируют спектр поглощения рабочего раствора 5-гидроксиметилфурфурола относительно воды для лабораторного анализа по 4.19 в диапазоне длин волн 210 — 350 нм. Определяют значение абсорбции максимума (около 284 нм) и рассчитывают точную массовую концентрацию рабочего стандартного раствора по уравнению

C_{\text{раб}} = 1000 \cdot A \cdot M/\epsilon \cdot L = A \cdot 7,487 , (1)

где C_{\text{раб}} — массовая концентрация или массовая доля рабочего стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола, мг/дм3;

A — оптическая плотность раствора 5-гидроксиметилфурфурола в максимуме поглощения;

M — молекулярная масса 5-гидроксиметилфурфурола, равная 126 г/моль;

\epsilon — молярный коэффициент поглощения 5-гидроксиметилфурфурола, равный 16830[\text{моль} \times \text{см}/\text{дм}^{3}]^{- 1} ;

L — толщина слоя раствора в кювете, см.

По точной массовой концентрации рабочего стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола рассчитывают точную массовую концентрацию основного стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола по уравнению

C_{\text{осн}} = C_{\text{раб}} \cdot r , (2)

где C_{\text{осн}} — точная массовая концентрация рабочего стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола;

r — величина разбавления (разведения) основного стандартного раствора при приготовлении рабочего раствора.

Срок хранения раствора при комнатной температуре — не более 3 сут, при температуре 2 °C — 4 °C — 3 мес, при температуре минус 20 °C — 6 мес.

6.4 Приготовление градуировочных растворов 5-гидроксиметилфурфурола массовой концентрацией 1,0 — 32,0 мг/дм3

Из основного стандартного раствора 5-гидроксиметилфурфурола по 6.3.1 массовой концентрацией 1000 мг/дм3 готовят градуировочные растворы № 1 — 4.

Градуировочный раствор № 1 готовят из основного стандартного раствора в соответствии с таблицей 1. Для приготовления градуировочных растворов № 2 — 4 отбирают пипетками соответствующие аликвоты градуировочного раствора № 1, помещают их в мерные колбы и доводят дистиллированной водой до метки, тщательно перемешивая.

Стандартные градуировочные растворы 5-гидроксиметилфурфурола готовят для построения градуировочной зависимости по четырем точкам, от меньшей массовой концентрации или массовой доли к большей, в соответствии с таблицей 1.

Стандартные градуировочные растворы 5-гидроксиметилфурфурола готовят непосредственно перед проведением измерений.

Таблица 1

Приготовление стандартных градуировочных растворов 5-гидроксиметилфурфурола

7. Выполнение измерений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

7.1 Условия хроматографического анализа

Колонка аналитическая: длиной 250 мм и внутренним диаметром 4,6 мм, заполненная октадецилсиликагелем, с размером частиц 5 мкм по 4.3.

Элюент: подвижная фаза А по 6.1.1 или Б по 6.1.2.

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Температура колонки: комнатная.

Детектирование: УФ, 284 нм.

Скорость подачи элюента: 1,0 см3/мин.

Объем вводимой пробы: 10 — 20 мкл.

7.2 Условия проведения измерений

Измерения проводят в следующих лабораторных условиях:

температура окружающего воздуха . . . . . . . (25 +/- 5) °C;

атмосферное давление . . . . . . . . . . . . (97 +/- 10) кПа;

относительная влажность . . . . . . . . . . . (65 +/- 15)%;

частота переменного тока . . . . . . . . . . (50 +/- 5) Гц;

напряжение в сети . . . . . . . . . . . . . . (220 +/- 10) В.

7.3 Построение градуировочной зависимости

Проводят хроматографический анализ всех градуировочных растворов. Регистрируют площади пиков 5-гидроксиметилфурфурола и строят градуировочный график — зависимость площади пика от массовой концентрации (массовой доли) 5-гидроксиметилфурфурола в градуировочном растворе.

Процедуры построения градуировочной зависимости выполняют в соответствии с руководством по эксплуатации оборудования и руководством пользователя программным обеспечением. Градуировочную зависимость выражают линейным уравнением

y = k · x. (3)

Правильность построения градуировочной зависимости контролируется значением достоверности аппроксимации (R^{2}) :

R^{2} \geq 0,9997 .

Из уравнения (3) следует, что площадь пиков стандартных растворов 5-гидроксиметилфурфурола S(mAU·c или AU·c) и их массовая концентрация c (мг/дм3) или массовая доля c (\text{млн}^{- 1}) находятся в соответствующей функциональной зависимости

c = \frac{S}{k} , (4)

где k — градуировочный коэффициент, [\text{мг}/\text{дм}^{3}/mAU \cdot c]^{- 1}

k = \frac{\sum (S_{i} \cdot c_{i})}{\sum c_{i}^{2}} , (5)

где S_{i} — площадь пика 5-гидроксиметилфурфурола при анализе i-го стандартного раствора, mAU·c или AU·c;

c_{i} — массовая концентрация или массовая доля 5-гидроксиметилфурфурола при анализе i-го стандартного раствора, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) .

Градуировочную зависимость строят при замене оборудования, колонок, изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

7.4 Анализ проб

Измерения проводят не менее двух раз в условиях повторяемости в соответствии с требованиями ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.14).

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Регистрируют площадь пика 5-гидроксиметилфурфурола. В случае, если массовая концентрация или массовая доля 5-гидроксиметилфурфурола в пробе настолько максимальна, что площадь соответствующего пика выходит за верхнюю границу диапазона градуировки хроматографа, подготавливают новую пробу с большим разбавлением и измерение повторяют.

Примеры хроматограмм раствора 5-гидроксиметилфурфурола приведены в Приложении А.

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

8. Обработка и оформление результатов определения

Массовую концентрацию или массовую долю 5-гидроксиметилфурфурола рассчитывают по градуировочным зависимостям с учетом степени разведения пробы.

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Обработку хроматограмм и определение массовой концентрации (массовой доли) аскорбиновой кислоты c(X), \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) , проводят с помощью программно-аппаратного комплекса сбора и обработки данных, с использованием градуировочной зависимости

c(X) = \frac{S_{x} \cdot V_{2}}{k \cdot V_{1}} или c(X) = \frac{S_{x} \cdot m_{\text{общ}}}{k \cdot m(x)} , (6)

или по формулам с использованием стандартного раствора массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола, наиболее близкой к ожидаемой в анализируемой пробе

c(X) = \frac{c_{\text{ст}} \cdot S_{x} \cdot V_{2}}{S_{\text{ст}} \cdot V_{1}} или c(X) = \frac{c_{\text{ст}} \cdot S_{x} \cdot m_{\text{общ}}}{S_{\text{ст}} \cdot m(x)} , (7)

где k — градуировочный коэффициент, [\text{мг}/\text{дм}^{3}/mAU \cdot c]^{- 1} ;

c(X) — массовая концентрация или массовая доля 5-гидроксиметилфурфурола в анализируемой пробе, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) ;

c_{\text{ст}} — массовая концентрация или массовая доля 5-гидроксиметилфурфурола в стандартном растворе, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) ;

S_{x} — площадь пика анализируемого 5-гидроксиметилфурфурола, mAU·c или AU·c;

V_{2} — вместимость мерной колбы, взятой для разбавления, см3;

S_{\text{ст}} — площадь пика анализируемого 5-гидроксиметилфурфурола в стандартном растворе, mAU·c или AU·c;

V_{1} — объем пробы, отобранный для анализа, см3;

m_{\text{общ}} — масса анализируемой пробы после разбавления, г;

m(x) — масса анализируемой пробы до разбавления, г.

Все результаты обработки (с помощью программно-аппаратного комплекса или расчетные) должны сходиться.

Расхождение между двумя параллельными определениями (в процентах от среднего значения), выполненными в условиях повторяемости, не должно превышать предела повторяемости (сходимости) r_{\text{отн}} , приведенного в таблице 2, при вероятности P = 0,95.

При соблюдении этого условия за окончательный результат определения принимают среднеарифметическое значение результатов двух параллельных определений X_{\text{ср}} .

(в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Расхождение между двумя результатами измерений, полученными в двух лабораториях при соблюдении условий воспроизводимости [ГОСТ ИСО 5725-1 (подраздел 3.18)] относительно их среднеарифметического значения не должно превышать предела воспроизводимости Rотн (см. таблицу 2). При превышении предела воспроизводимости выполняют процедуры в соответствии с ГОСТ ИСО 5725-6 (пункты 5.3.3, 5.3.4).

(абзац введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Границы относительной погрешности определения массовой концентрации (массовой доли) 5-гидроксиметилфурфурола \pm \delta , %, при соблюдении условий, регламентированных настоящим методом, при вероятности P = 0,95 не должны превышать значений, приведенных в таблице 2.

Таблица 2

Основные метрологические характеристики

(таблица 2 в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

Если массовая концентрация (массовая доля) 5-гидроксиметилфурфурола превышает 50\text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) , то определение массовой концентрации (массовой доли) 5-гидроксиметилфурфурола проводят после разбавления пробы по 6.2.1 - 6.2.3 с доведением массовой концентрации (массовой доли) 5-гидроксиметилфурфурола в пробе до диапазона \text{от }1\text{до }50\text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) .

Окончательный результат определения массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола представляют в следующем виде:

X_{\text{ср}} \pm \Delta , при P = 0,95, (8) (в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

где X_{\text{ср}} — среднее значение результатов двух параллельных определений массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) ;

\Delta — границы абсолютной погрешности определений массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) , рассчитанные по формуле

\Delta = \frac{\delta \cdot X_{\text{ср}}}{100} . (9)

Числовое значение окончательного результата измерений должно оканчиваться цифрой того же разряда, что и значение абсолютной погрешности, содержащее не более двух значащих цифр.

(абзац введен Изменением № 1, введенным в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

9. Контроль точности результатов определения

9.1 Оперативный контроль повторяемости результатов определения

Оперативный контроль повторяемости результатов определения массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола проводят при получении каждого результата определения путем сравнения расхождения между результатами двух параллельных определений (в процентах от среднего значения) с пределом повторяемости (сходимости), приведенным в таблице 2.

Повторяемость результатов признают удовлетворительной при условии

|X_{1} - X_{2}| \leq 0,01r_{\text{отн}}X_{\text{ср}} . (10)

При превышении предела повторяемости (сходимости) определение повторяют. При повторном превышении указанного предела выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, их устраняют и определение повторяют.

9.2 Оперативный контроль воспроизводимости результатов определения

Абсолютное расхождение между результатами двух независимых определений, которые получены в условиях воспроизводимости (одна и та же методика, идентичный объект определения, разные лаборатории, разные операторы, различное оборудование), не должно превышать предела воспроизводимости, приведенного в таблице 2. При превышении указанного предела воспроизводимости контрольное определение повторяют. При повторном превышении указанного предела воспроизводимости выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

9.3 Оперативный контроль погрешности (точности) результатов определения

Оперативный контроль погрешности (точности) результатов определения осуществляют методом добавок с использованием проб соковой продукции, объем или масса которых должны соответствовать удвоенному количеству, необходимому для проведения измерений. Пробу делят на две равные части. В одну из них добавляют стандарт 5-гидроксиметилфурфурола в таких количествах, чтобы добавка составляла 50% — 150% исходного содержания компонента в пробе, но не превышала верхней границы диапазона определения массовой концентрации или массовой доли компонента с учетом границ погрешности определения (см. таблицу 2). Обе части пробы подвергают измерениям в точном соответствии с требованиями настоящего стандарта.

Результаты контрольных определений признают удовлетворительными, если погрешность определения массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в добавке не превышает норматива оперативного контроля погрешности (точности), то есть выполняется условие

|X_{\text{доб}} - X_{\text{ср}} - c_{\text{доб}}| \leq K_{\text{доб}} , (11)

где X_{\text{доб}} — среднее значение двух определений массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в пробе с добавкой, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) ;

X_{\text{ср}} — среднее значение двух определений массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола в пробе без внесения добавки, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) ;

c_{\text{доб}} — значение добавки 5-гидроксиметилфурфурола, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) ;

K_{\text{доб}} — норматив оперативного контроля погрешности, \text{мг}/\text{дм}^{3}(\text{млн}^{- 1}) .

При проведении внутрилабораторного контроля (P = 0,90) значение K_{\text{доб}} рассчитывают по формуле

K_{\text{доб}} = 0,84 \cdot \frac{\delta}{100} \cdot \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} . (12)

При проведении внешнего контроля (P = 0,95) значение K_{\text{доб}} рассчитывают по формуле

K_{\text{доб}} = \frac{\delta}{100} \cdot \sqrt{X_{\text{доб}}^{2} + X_{\text{ср}}^{2}} , (13)

где \delta — границы относительной погрешности определения массовой концентрации или массовой доли 5-гидроксиметилфурфурола, указанные в таблице 2.

При превышении норматива оперативного контроля погрешности проводят повторные контрольные измерения. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их.

Периодичность контроля погрешности (точности) устанавливается самой лабораторией с учетом фактического состояния работ. При замене оборудования, колонок, реактивов, изменении условий хроматографического анализа или при выявлении несоответствия метрологическим требованиям результатов оперативного контроля или внутреннего аудита.

10. Требования безопасности

10.1 Условия безопасного проведения работ

При работе с химическими реактивами следует соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005 и ГОСТ 12.1.007.

Требования взрывобезопасности — в соответствии с ГОСТ 12.1.010.

При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила пожаровзрывобезопасности по ГОСТ 12.1.018, по электробезопасности — по ГОСТ 12.1.019 и инструкции по эксплуатации прибора.

10.2 Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений, обработке и оформлению результатов допускаются инженер-химик, техник или лаборант, имеющие высшее или среднее специальное образование, опыт работы в химической лаборатории и изучившие инструкцию по эксплуатации метода высокоэффективной жидкостной хроматографии. Первое применение метода высокоэффективной жидкостной хроматографии в лаборатории следует проводить под руководством специалиста, владеющего теорией метода высокоэффективной жидкостной хроматографии и имеющего практические навыки в этой области.

Приложение А (справочное)

ПРИМЕРЫ ХРОМАТОГРАММ

(Приложение А в ред. Изменения № 1, введенного в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст)

А.1. Примеры хроматограмм приведены на рисунках А.1 - А.4.

Рисунок А.1 — Хроматограмма концентрированного яблочного сока с концентрацией 5-гидроксиметилфурфурола 28,0 мг/дм3 (подвижная фаза А)

Рисунок А.2 — Хроматограмма концентрированного яблочного сока с концентрацией 5-гидроксиметилфурфурола 28,0 мг/дм3 (подвижная фаза Б)

Рисунок А.3 — Хроматограмма концентрированного сока манго с концентрацией 5-гидроксиметилфурфурола 60,9 мг/дм3 (подвижная фаза Б)

Рисунок А.4 — Хроматограмма концентрированного сока из белого винограда с концентрацией 5-гидроксиметилфурфурола 70,7 мг/дм3 (подвижная фаза Б)

Библиография

Раздел исключен с 1 января 2017 года. - Изменение № 1, введенное в действие Приказом Росстандарта от 30.08.2016 № 966-ст.