ГОСТ 29185-91. Государственный стандарт Союза ССР. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества сульфитредуцирующих клостридий

(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 23.12.1991 № 2050)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["ГОСТ 29185-91"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/gost-29185-91" "ГОСТ 29185-91. Государственный стандарт Союза ССР. Продукты пищевые. Методы выявления и определения количества сульфитредуцирующих клостридий (утв. и введен в действие Постановлени"
  n1["ГОСТ 29185-2014"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/gost-29185-2014" "ГОСТ 29185-2014. Межгосударственный стандарт. Микробиология пищевых продуктов и кормов для животных. Методы выявления и подсчета сульфитредуцирующих бактерий, растущих в анаэробных"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

от 23 декабря 1991 г. № 2050

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР

ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ

МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ И ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОЛИЧЕСТВА СУЛЬФИТРЕДУЦИРУЮЩИХ КЛОСТРИДИЙ

Food products. Methods for detection and quantity determination of sulphite-reducing clostridium

ГОСТ 29185-91

Группа Н09

ИНФОРМАЦИОННЫЕ ДАННЫЕ

1. Разработан и внесен Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности (ВНИИКОП), ТК 93 «Продукты переработки плодов и овощей».

2. Утвержден и введен в действие Постановлением Комитета стандартизации и метрологии СССР от 23.12.91 № 2050.

3. Срок проверки — 1977 г.; периодичность проверки — 5 лет.

4. Настоящий стандарт соответствует ИСО 7937-85 в части выявления колоний, характерных для сульфитредуцирующих микроорганизмов.

5. Введен впервые.

6. Ссылочные нормативно-технические документы

Метод определения НВЧ предназначен для пищевых продуктов, содержащих в 1 г менее 150, но в 10 г более 3 или в 1 см3 менее 15, но в 100 см3 более 3 сульфитредуцирующих клостридий.

Требования настоящего стандарта являются обязательными.

1. ОТБОР И ПОДГОТОВКА ПРОБ

Отбор и подготовка проб пищевых продуктов — по ГОСТ 26668, ГОСТ 26669.

2. АППАРАТУРА, МАТЕРИАЛЫ И РЕАКТИВЫ

Для проведения испытания применяют аппаратуру, материалы и реактивы по ГОСТ 10444.1 со следующими дополнениями:

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 200 г и пределом допускаемой погрешности +/- 2 мг (для взвешивания реактивов);

весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 с наибольшим пределом взвешивания до 1 кг и пределом допускаемой погрешности +/- 10 мг (для взвешивания продукта);

микроскоп световой биологический, обеспечивающий увеличение 900 - 1000^{\text{х}} :

стекла предметные по ГОСТ 9284;

стекла покровные по ГОСТ 6672;

железа (III) аммония цитрат C_{6}H_{5}O_{7}Fe \cdot C_{6}H_{6}O_{7}(NH_{4})_{2} или C_{6}H_{5}O_{7}Fe \cdot C_{6}H_{7}O_{7}NH_{4} ;

железо треххлористое 6-водное (FeCl_{3} \cdot 6H_{2}O) .

3. ПОДГОТОВКА К ИСПЫТАНИЮ

3.1. Приготовление растворов и реактивов

3.1.1. Раствор сульфата железа (FeSO_{4}) концентрацией 80 г/дм3: 8,0 г сульфата железа переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки. При использовании соли в виде кристаллогидратов проводят соответствующий пересчет на безводную соль.

3.1.2. Раствор аммония железа (III) сульфата Fe(NH_{4})(SO_{4})_{2} \times 12H_{2}O концентрацией 50 г/дм3: 5,0 г аммония железа (III) сульфата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.3. Раствор железа (III) аммония цитрата концентрацией 50 г/дм3: 5,0 г железа (III) аммония цитрата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.4. Раствор железа треххлористого (FeCl_{3} \cdot 6H_{2}O) концентрацией 80 г/дм3: 8,0 г железа треххлористого гексагидрата переносят в колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.5. Раствор сульфита натрия (натрия сернистокислого) концентрацией 100 г/дм3: 10,0 г натрия сернистокислого переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки.

3.1.6. Растворы, приготовленные по пп. 3.1.1 - 3.1.5, стерилизуют текучим паром в течение 1 ч.

3.1.7. Раствор железа (III) цитрата (C_{6}H_{5}O_{7}Fe \cdot 5H_{2}O) концентрацией 50 г/дм3: 5,0 г железа (III) цитрата пентогидрата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3, растворяют в дистиллированной воде. Раствор доводят до метки. Раствор стерилизуют методом мембранной фильтрации по ГОСТ 26670.

3.1.8. Растворы и реактивы для окраски по Граму готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.9. Растворы и реактивы для окраски бактериальных спор готовят по ГОСТ 10444.1.

3.1.10. Реактив для определения каталазы готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2. Приготовление питательных сред

3.2.1 Голодный агар готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.2 Мясную воду готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.3. Мясо-пептонный агар (бульон) с 0,1% глюкозы и дрожжевым экстрактом готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.4. Среду из сухого питательного агара с глюкозой готовят по ГОСТ 10444.1.

3.2.5. Железосульфитная среда: к 1 дм3 дистиллированной воды добавляют 10,0 г триптона, 0,5 г сульфита натрия, 0,5 г железа (III) цитрата, 15,0 г агара (при приготовлении агаризованной среды) или 1,5 г агара (при приготовлении вязкой среды). Растворяют компоненты при нагревании, после этого смесь охлаждают до (50 +/- 5) °C. Устанавливают pH среды таким образом, чтобы он составлял (7,1 +/- 0,1) (в пересчете на (25 +/- 1) °C). Среду разливают в пробирки по 10 — 12 см3 или колбы и стерилизуют при (121 +/- 1) °C в течение 15 мин.

Триптон может быть заменен на равноценную навеску сухого панкреатического гидролизата казеина или на десятикратный объем жидкого панкреатического гидролизата казеина, а триптон и 1 дм3 воды могут быть заменены на 1 дм3 мясной воды, приготовленной по п. 3.2.2.

3.2.6. Триптозо-сульфит-циклосериновый агар готовят по ГОСТ 10444.9.

3.2.7. Дифференциальная улучшенная клостридиальная среда: в 800 см3 воды вносят 10,0 г пептона, 1,5 г дрожжевого экстракта или 7,5 см3 дрожжевого экстракта, приготовленного по ГОСТ 10444.1, 5,0 г уксуснокислого натрия. Отдельно 1,0 г растворимого крахмала вносят в небольшую порцию воды и при непрерывном помешивании переносят в кипящую воду, доводя объем до 200 см3 и получая крахмальный клейстер. Полученный клейстер смешивают с 800 см3 смеси, содержащей остальные компоненты, добавляют 15,0 г агара при приготовлении плотной среды или 1,5 г агара при приготовлении вязкой среды и кипятят 30 мин. Доводят объем среды до 1 дм3, добавляют 1,0 г глюкозы и 0,5 г L-цистеина гидрохлорида, охлаждают среду до (50 +/- 5) °C. Устанавливают pH таким образом, чтобы он составлял (7,1 +/- 0,1) (в пересчете на (25 +/- 1) °C). Среду разливают мерно в колбы и стерилизуют при температуре (121 +/- 1) °C в течение 15 мин. Перед использованием к 100 см3 среды добавляют 0,4 см3 раствора сульфита натрия, приготовленного по п. 3.1.5, и 2 см3 раствора железа (III) цитрата, приготовленного по п. 3.1.7. При необходимости среду разливают в пробирки по 10 — 12 см3.

3.2.8. Среда Вильсон-Блера (агаризованная), измененная для анаэробов: к 1 дм3 стерильного, расплавленного и охлажденного до (80 +/- 1) °C мясо-пептонного агара, приготовленного по п. 3.2.3, или среды, приготовленной по п. 3.2.4, добавляют 10 см3 раствора сульфита натрия, приготовленного по п. 3.1.5, и 1 см3 раствора аммония железа (III) сульфата, приготовленного по п. 3.1.2. Среду хранят в защищенном от света месте при (6 +/- 2) °C не более 7 сут.

Допускается заменять раствор аммония железа (III) сульфата раствором железа (III) аммония цитрата или раствором сульфата железа (FeSO_{4} \cdot 5H_{2}O) , или раствором железа (III) цитрата, при этом также используют растворы концентрацией 50 г/дм3.

Если использовать раствор сульфата железа, приготовленного по п. 3.1.1, то на 1 дм3 среды его добавляют 0,4 см3.

3.2.8.2. При приготовлении среды Вильсон-Блера агаризованной или вязкой допускается вместо растворов, указанных в п. 3.2.7, использовать на 100 см3 среды для определения сульфитредуцирующей способности 4 см3 раствора сульфита натрия, приготовленного по п. 3.1.5, и 1 см3 раствора железа треххлористого, приготовленного по п. 3.1.4. В этом случае готовая среда не подлежит хранению.

3.2.9. Среду Китт-Тароцци без добавления агара, вазелинового масла готовят по ГОСТ 10444.1.

4. ПРОВЕДЕНИЕ ИСПЫТАНИЯ

4.1 Определение количества сульфитредуцирующих клостридий

4.1.1. Из навески продукта готовят исходное и ряд десятикратных разведений по ГОСТ 26669 так, чтобы можно было определить в 1 г (см3) предполагаемое количество сульфитредуцирующих клостридий или их количество, указанное в нормативно-технической документации на конкретный продукт.

4.1.2. При определении количества спор сульфитредуцирующих клостридий навеску продукта или его исходное разведение перед посевом или приготовлением десятикратных разведений прогревают при температуре (80 +/- 1) °C в течение 20 мин. Для прогрева 50 см3 исходного разведения или жидкого продукта помещают в стерильную колбу вместимостью 100 см3 таким образом, чтобы анализируемая проба не размазывалась по стенкам колбы.

Колбу с продуктом или его исходным разведением помещают в предварительно нагретую до (80 +/- 1) °C водяную баню. При этом уровень находящейся в колбе пробы должен быть на 2 — 3 см ниже, чем уровень воды в бане. Одновременно в водяную баню помещают контрольную колбу, содержащую 50 см3 исходного разведения или продукта, и термометр.

Время термообработки начинают отсчитывать с того момента, когда содержащееся в колбе исходное разведение или продукт достигнут указанной температуры. После термообработки колбу немедленно охлаждают под струей водопроводной воды.

4.1.3. При определении количества сульфитредуцирующих клостридий по методу НВЧ высевают три последовательных навески продукта и (или) его разведения, отличающиеся друг от друга по количеству высеваемого продукта в 10 раз. Каждую навеску продукта и (или) его разведение высевают в пробирки с одной из вязких питательных сред, приготовленных по п. 3.2.5 или 3.2.7, или 3.2.8.1, или 3.2.8.2. Соотношение количества высеваемого продукта или его разведения к питательной среде 1:9.

4.1.4. При определении количества сульфитредуцирующих клостридий методом посева в агаризованные среды по 1 см3 навески продукта или его разведения вносят в две чашки Петри. Посевы заливают по ГОСТ 26670 одной из агаризованных сред, приготовленных по п. 3.2.5 или 3.2.7, или 3.2.8, или 3.2.8.2, или 3.2.6.

После затвердения среды в чашки Петри для образования второго слоя вливают еще 10 см3 голодного агара.

4.2 Определение присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих клостридий

При определении присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих клостридий в определенной навеске продукта или его эквивалентном разведении эту навеску или разведение вносят в одну из вязких питательных сред, приготовленных по п. 3.2.5 или 3.2.7, или 3.2.8.1, или 3.2.8.2.

4.3. Посевы по пп. 4.1.3, 4.1.4 и 4.2 инкубируют при (37 +/- 1) °C не более 72 ч. Посевы на чашках Петри инкубируют в анаэробных условиях по ГОСТ 10444.4. Ежедневно посевы просматривают для обнаружения признаков роста сульфитредуцирующих микроорганизмов — почернения сульфитной среды.

4.4. Из посевов в вязкие среды отбирают пробирки с признаками роста — отдельными черными колониями или полностью почерневшей питательной средой на глубине свыше 1 см. Из отобранных пробирок проводят пересевы петлей в чашки Петри на поверхность одной из агаризованных сред, приготовленных по п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.7, или 3.2.8, или 3.2.8.2, так, чтобы получить рост изолированных колоний. Посевы инкубируют в анаэробных условиях при (37 +/- 1) °C в течение 24 — 48 ч.

4.5. Из посевов на агаризованные среды (см. п. 4.1.4) отбирают чашки, на которых выросло от 15 до 150 характерных колоний.

4.6. Не менее 5 овальных черных или окруженных черным или серым ореолом колоний диаметром 4 — 5 мм, отобранных по п. 4.4 или 4.5, высевают раздельно в свежерегенерированную по ГОСТ 10444.4 среду, приготовленную по п. 3.2.9.

Посевы инкубируют при (37 +/- 1) °C не более 48 ч.

4.7 Подтверждение принадлежности выделенных сульфитредуцирующих микроорганизмов к роду Clostridium

4.7.1 Микроскопирование

Из культур, выросших, как указано в п. 4.6, готовят два препарата и окрашивают по ГОСТ 10444.3, первый — по Граму, второй — для выявления бактериальных спор.

Сульфитредуцирующие клостридии представляют собой грамположительные палочки, располагающиеся в одиночку, попарно, в виде цепочек или скоплений параллельных клеток. При спорообразовании споры сульфитредуцирующих клостридий овальные или сферические, субтерминальные или терминальные.

4.7.2 Определение отсутствия каталазы

Отсутствие каталазы в культурах, выросших, как указано в п. 4.6, определяют по ГОСТ 10444.3.

Сульфитредуцирующие клостридии каталазу не образуют.

4.7.3 Подтверждение анаэробного роста

Подтверждение анаэробного роста проводят посевом по ГОСТ 10444.4 культур, выросших, как указано в п. 4.6, в чашки Петри под стекло или в трубки Вейона. Для посева используют одну из агаризованных питательных сред, приготовленных по п. 3.2.5 или 3.2.6, или 3.2.7, или 3.2.8, или 3.2.8.2. Посевы инкубируют в аэробных условиях при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 72 ч.

Допускается взамен подтверждения анаэробного роста проводить определение отсутствия роста в аэробных условиях. При этом культуры высевают в чашки Петри на поверхность агаризованной среды.

Посевы инкубируют в аэробных условиях при (37 +/- 1) °C в течение 18 — 72 ч.

5. ОЦЕНКА РЕЗУЛЬТАТОВ

5.1 Результаты испытания оценивают по каждой пробе отдельно.

5.2. Если при изучении культуральных, морфологических и биохимических свойств обнаружены сульфитредуцирующие грамположительные, каталазоотрицательные, способные расти в анаэробных условиях микроорганизмы, то дают заключение о том, что эти микроорганизмы относятся к сульфитредуцирующим клостридиям.

5.3. Если при подтверждении характерных колоний в 80% случаев, то есть не менее чем в 4 из 5 колоний, подтвержден рост сульфитредуцирующих клостридий, то считают, что все характерные колонии, выросшие на чашке Петри (см. п. 4.5), принадлежат к этой группе. В остальных случаях количество сульфитредуцирующих клостридий определяют исходя из процентного отношения подтвержденных колоний к общему количеству характерных колоний, взятых для подтверждения.

5.4. При определении НВЧ или при определении присутствия (отсутствия) сульфитредуцирующих клостридий в определенной навеске продукта посевы в вязкие среды считают положительными, если при последующем пересеве и подтверждении характерных колоний хотя бы в одной колонии будут обнаружены сульфитредуцирующие клостридии.

5.5. Пересчет количества сульфитредуцирующих клостридий на 1 г (см3) продукта проводят по ГОСТ 26670.

5.6. НВЧ сульфитредуцирующих клостридий в 1 г (см3) продукта определяют по количеству положительных пробирок, пользуясь таблицей, приведенной в ГОСТ 29184.