ГОСТ 25011-81 (СТ СЭВ 2787-80). Государственный стандарт Союза ССР. Мясо и мясные продукты. Методы определения белка
(утв. и введен в действие Постановлением Госстандарта СССР от 27.11.1981 № 5145)
Примечание
Документ утрачивает силу с 1 июля 2018 года в связи с изданием Приказа Росстандарта от 06.09.2017 № 1017-ст. Взамен вводится в действие ГОСТ 25011-2017.
от 27 ноября 1981 г. № 5145
ГОСУДАРСТВЕННЫЙ СТАНДАРТ СОЮЗА ССР
Meat and meat products. Methods of protein determination
Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 27 ноября 1981 г. № 5145 срок действия установлен
до 1 января 1988 года
Разработан Министерством мясной и молочной промышленности СССР.
Исполнители: А.Ф. Савченко, Г.Л. Солнцева, Р.И. Хламова, Л.И. Изотова.
Внесен Министерством мясной и молочной промышленности СССР.
Утвержден и введен в действие Постановлением Государственного комитета СССР по стандартам от 27 ноября 1981 г. № 5145.
Настоящий стандарт распространяется на мясо и мясные продукты и устанавливает фотометрический метод определения белка и метод определения содержания белков по Кьельдалю.
Настоящий стандарт полностью соответствует СТ СЭВ 2787-80.
1.1 Сущность метода
Метод основан на минерализации пробы по Кьельдалю и фотометрическом измерении интенсивности окраски индофенолового синего, которая пропорциональна количеству аммиака в минерализате.
1.2 Методы отбора и подготовки проб
1.2.1. Отбор проб мяса — по ГОСТ 7269-79, отбор проб мясных продуктов — по ГОСТ 9792-73. Отобранные пробы мяса и мясных продуктов дважды измельчают на бытовой или электрической мясорубке с отверстиями решетки диаметром 3 мм и тщательно перемешивают.
1.2.2. Подготовленную для анализа пробу помещают в стеклянную банку вместимостью 200 — 400 см3, заполнив ее полностью, и закрывают крышкой.
Пробу хранят при температуре от 3 до 5 °C до окончания анализа.
1.3 Аппаратура, реактивы и материалы
Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24.104-80 1 и 2 классов точности, с наибольшим пределом взвешивания в интервале 1 \cdot 10^{- 3} - 200\text{г} .
Спектрофотометр марки СФ-4, СФ-26 или фотоэлектроколориметр марки 56 ПМ или других аналогичных марок.
Мясорубка бытовая по ГОСТ 4025-78 или электромясорубка по ГОСТ 20469-75.
Промывалка стеклянная лабораторная.
Пробирки стеклянные вместимостью 20 — 25 см3 по ГОСТ 10515-75.
Колбы стеклянные вместимостью 20 — 25 см3 по ГОСТ 10394-72.
Пипетки вместимостью 1 см3 и 5 см3 по ГОСТ 20292-74.
Колбы мерные вместимостью 100, 250, 1000 см3 по ГОСТ 1770-74.
Воронки стеклянные по ГОСТ 8613-75.
Кислота серная по ГОСТ 4204-77, плотностью 1,84 г/см3.
Кислота соляная по ГОСТ 3118-77.
Водорода перекись по ГОСТ 109029-76.
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72.
Аммоний сернокислый, х.ч., по ГОСТ 3769-78.
Известь хлорная по ГОСТ 1692-58.
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77.
Натрий серноватистокислый (тиосульфат натрия) по СТ СЭВ 223-75 или по ГОСТ 244-76.
Натрия гипохлорит или натрия дихлоризоцианурат.
Калий йодистый по ГОСТ 4232-74.
Натрий углекислый безводный, х.ч. или ч.д.а., по ГОСТ 83-79.
1.4 Подготовка к испытанию
1.4.1 Приготовление реактива 1
10 г фенола и 0,05 г нитропруссида натрия растворяют в мерной колбе вместимостью 1000 см3 дистиллированной водой, объем колбы доводят до метки.
1.4.2 Приготовление реактива 2
5 г гидроокиси натрия растворяют в дистиллированной воде в мерной колбе вместимостью 1000 см3, после охлаждения добавляют количество исходного раствора гипохлорита натрия из расчета его содержания 0,42 г/дм3 или 0,2 г дихлоризоцианурата натрия и доводят объем колбы дистиллированной водой до метки.
1.4.3. Приготовленные реактивы хранят в темной посуде в холодильнике не более 2 мес.
1.4.4 Приготовление исходного гипохлорита натрия.
В стакане вместимостью 500 см3 перемешивают 150 г хлорной извести с 250 см3 дистиллированной воды; в другом стакане в 250 см3 дистиллированной воды растворяют 105 г углекислого натрия, затем сливают оба раствора при постоянном перемешивании. Масса сначала густеет, затем разжижается. Полученную суспензию оставляют на 1 — 2 сут. для отстаивания, затем надосадочную жидкость сливают и отфильтровывают.
Полученный реактив имеет концентрацию активного хлора около 6 — 10% и может храниться в склянке из темного стекла до 1 года. В полученном реактиве определяют концентрацию активного хлора. Для этого 1 см3 прозрачного фильтрата разбавляют в конической колбе вместимостью 100 см3 дистиллированной водой до 40 — 50 см3, прибавляют 2 г калия йодистого и 10 см3 соляной кислоты 1 моль/дм3 (1 н). Образовавшийся йод оттитровывают 0,1 моль/дм3 (0,1 н) раствором серноватистокислого натрия, приготовленного из фиксанала, до исчезновения вишневой окраски (1 мл 0,1 моль/дм3 (0,1 н) раствора серноватистокислого натрия соответствует 0,00355 г хлора).
1.4.5 Определение количества гипохлорита натрия в исходном растворе.
Перед приготовлением реактива 2 необходимо определить содержание гипохлорита натрия в исходном растворе, учитывая неустойчивость его при хранении.
По количеству израсходованного на титрование тиосульфата натрия определяют количество раствора гипохлорита натрия, необходимого для приготовления реактива 2.
Количество раствора тиосульфата натрия концентрации 0,1 моль/дм3 (0,1 н), израсходованного на титрование 1 см3 исходного раствора гипохлорита натрия, составляет, например, 12,09 см3.
Эквивалентная масса гипохлорита натрия равна половине молекулярной массы гипохлорита натрия и составляет 74,4 : 2 = 37,2 г. Следовательно, количество гипохлорита натрия в исходном растворе гипохлорита натрия составляет 1,209 x 37,2 = 44,97 г.
Учитывая, что реактив 2 должен содержать 0,42 г гипохлорита натрия, из пропорции определяем:
в 1000 см3 исходного раствора — 44,97 г
X = \frac{1000 \cdot 0,42}{44,97} = 9,4\text{см}^{3} .
Следовательно, для приготовления 1 дм3 реактива 2 требуется 9,4 см3 исходного раствора гипохлорита натрия.
1.4.6 Приготовление стандартного раствора сернокислого аммония для построения градуировочной кривой
0,236 г сернокислого аммония, предварительно высушенного до постоянной массы при температуре 60 °C, вносят в мерную колбу вместимостью 500 см3, растворяют в дистиллированной воде и доводят объем до метки.
Этот раствор является стандартным и содержит 0,1 мг азота в 1 см3.
1.4.7 Проведение цветной реакции
В мерные колбы вместимостью по 100 см3 вносят следующие количества стандартного раствора в см3: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0. После доведения объемов колб дистиллированной водой до метки получают серию рабочих растворов концентрации: 1,0; 1,5; 2,0; 2,5; 3,0; 3,5; 4,0; 4,5; 5,0 мкг азота в 1 см3.
Для проведения цветной реакции в пробирки берут по 1 см3 рабочего раствора, добавляют 5 см3 реактива 1 и 5 см3 реактива 2, перемешивают и через 30 мин измеряют величину оптической плотности на спектрофотометре при длине волны 625 нм или на фотоэлектроколориметре с красным светофильтром в кювете с толщиной поглощающего свет слоя 1 см в отношении контрольного опыта.
Повторность проведения цветной реакции трехкратная. Для каждого определения готовят новый стандартный раствор.
1.4.8 Построение градуировочного графика
По полученным средним из трех стандартных растворов строят на миллиметровой бумаге размером 20 x 20 см градуировочный график.
На оси абсцисс откладывают величину концентрации азота (мкг/см3), на оси ординат — соответствующую ей оптическую плотность. Градуировочный график должен проходить через начало координат.
1.5 Проведение испытания
Навеску продукта рассчитывают по разности, для этого часть измельченной средней пробы помещают в бюксу, закрывают крышкой и взвешивают с допустимой погрешностью не более 0,0002 г. Затем из бюксы скальпелем отбирают 0,4 — 0,5 г продукта на листок беззольного фильтра и вместе с ним осторожно опускают в колбу Кьельдаля. Бюксу закрывают, взвешивают и рассчитывают точную массу продукта, взятого для анализа.
Такой же листок беззольного фильтра помещают в контрольную колбу Кьельдаля. Затем в обе колбы добавляют 10 см3 концентрированной серной кислоты, 1 — 2 г сернокислого калия и проводят минерализацию, периодически добавляя для интенсивности процесса в охлажденную пробу перекись водорода (5 — 7 см3 в течение всей минерализации). Допускается применение других катализаторов, обеспечивающих точность определения.
После минерализации колбы охлаждают и содержимое количественно переносят в мерные колбы вместимостью 250 см3, после охлаждения объем доводят до метки и содержимое перемешивают.
5 см3 полученного минерализата переносят в мерную колбу вместимостью 100 см3 и доводят до метки дистиллированной водой, получая вторично разбавленный минерализат. Для проведения цветной реакции 1 см3 вторично разбавленного минерализата вносят в пробирку, затем последовательно добавляют 5 см3 реактива 1 и 5 см3 реактива 2, перемешивают содержимое пробирки. Через 30 мин определяют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 625 нм или на фотоэлектроколориметре с применением красного светофильтра. Измерение ведется в сравнении с контрольным раствором.
Контрольный раствор готовят одновременно, используя для этой цели контрольный минерализат.
Стабильность окраски растворов сохраняется в течение одного часа.
Температура реактивов при проведении цветной реакции должна быть не ниже 20 °C.
По полученному значению оптической плотности с помощью калибровочного графика находят концентрацию азота.
1.6 Обработка результатов
Массовую долю белка (X), в процентах, вычисляют по формуле
X = \frac{C \cdot 250 \cdot 100}{m \cdot 5 \cdot 1 \cdot 10^{6}} \cdot 100 \cdot 6,25 ,
C — концентрация азота, найденная по калибровочному графику в соответствии с полученной оптической плотностью, мкг/см3;
250 — объем минерализата после первого разведения, см3;
5 — объем разбавленного минерализата для вторичного разведения, см3;
100 — объем минерализата после вторичного разведения, см3;
1 — объем раствора, взятый для проведения цветной реакции, см3;
10^{6} — множитель для перевода г в мкг;
100 — множитель для перевода в проценты;
6,25 — коэффициент пересчета на белок.
За окончательный результат принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений.
Расхождение между параллельными определениями не должно превышать 0,1% по содержанию азота для мяса и мясопродуктов.
2. МЕТОД ОПРЕДЕЛЕНИЯ СОДЕРЖАНИЯ БЕЛКА ПО КЬЕЛЬДАЛЮ
2.1 Сущность метода
Метод основан на минерализации пробы по Кьельдалю, отгонки аммиака в раствор серной кислоты с последующим титрованием исследуемой пробы.
2.1.1. При проведении испытаний должны быть соблюдены требования СТ СЭВ 804-77 и СТ СЭВ 435-77.
2.1.2. Для проведения испытаний применяют реактивы квалификации «чистый для анализа» (ч.д.а.) и дистиллированную воду или воду эквивалентной чистоты.
2.1.3. Испытания следует проводить в помещениях, свободных от паров аммиака.
2.2 Метод отбора и подготовки проб
Отбор проб проводят по СТ СЭВ 2433-80.
Отобранную пробу двукратно измельчают в мясорубке, перемешивают и помещают, уплотняя, в банку с герметической крышкой.
2.2.3. Измельченную пробу хранят при температуре не выше 4 °C до окончания испытания.
Срок хранения пробы для испытаний не должен превышать 24 ч.
2.3 Аппаратура, реактивы и материалы
Весы аналитические по ГОСТ 24104-80, 1 и 2 классов точности, с наибольшим пределом взвешивания в интервале 1 \cdot 10^{- 3} - 200\text{г} .
Мясорубка лабораторная с отверстиями решетки диаметром не более 3 мм по ГОСТ 4025-78.
Колбы Кьельдаля из тугоплавкого, термостойкого стекла, вместимостью не более 750 см3 по ГОСТ 10394-72. Допускается применять стеклянные пробки (в форме стеклянных конусов), свободно закрывающие горло колбы.
Аппарат для перегонки с водяным паром (Парнаса-Вагнера) или обыкновенная установка для перегонки.
Установка электрическая или газовая для сжигания с регулируемой интенсивностью обогревания, позволяющая обогревать колбы Кьельдаля в наклонном положении, таким образом, чтобы зона нагрева находилась ниже уровня жидкости в колбе. Аппарат должен быть оснащен вытяжным устройством, позволяющим удалять испарения кислот во время обогревания.
Мешалка магнитная с регулируемым числом оборотов и штативом, а также захватом для бюретки вместимостью 50 см3.
Титратор автоматический потенциометрический или полуавтоматическая бюретка.
Бюретка вместимостью 50 см3 по ГОСТ 20292-74.
Дозаторы для жидкостей или цилиндры мерные вместимостью 25, 50, 100 см3 по ГОСТ 1770-74.
Мельница шаровая или ступка с пестиком по ГОСТ 9147-73.
Катализатор медный; готовят следующим образом: тщательно смешивают в весовом отношении 30:1 мелкорастертый безводный сульфат калия по ГОСТ 4145-74 с тонко растертым сульфатам меди по ГОСТ 4165-78. Компоненты смеси, взвешенные с погрешностью не более 0,1 г, растирают в шаровой мельнице или в ступке. Смесь хранят в герметически закрытой склянке и предохраняют от увлажнения. Допускается применение других катализаторов.
Кислота серная по ГОСТ 4204-77, 18,76 моль/дм3 (1,84 г/см3);
Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77, 8,25 моль/дм3 (330 г/дм3).
Раствор свободный от карбонатов; готовят следующим образом: растворяют 330 г гидроокиси натрия в воде и разбавляют до объема 1 дм3.
Кислота борная по ГОСТ 9656-75, 0,65 моль/дм3 (40 г/дм3); готовят следующим образом: растворяют 40 г борной кислоты в воде и разбавляют до объема 1 дм3.
Кислота соляная по ГОСТ 3118-77 или серная по ГОСТ 4204-77 0,1 моль/дм3 — 0,05 моль/дм3 (0,1 н — 0,1 н).
Индикатор Таширо — смесь: готовят растворением 2 г метилового красного по ГОСТ 5853-51 и 1 г метилового голубого в 1000 см3 этилового спирта по ГОСТ 5962-67 или по ГОСТ 18300-72, 16,28 моль/дм3 (96%-ного). Раствор хранят в склянках из темного стекла в холодном темном месте (индикатор изменяет цвет при pH = 5,4).
Бумага пергаментная размерами 60 x 80 мм по ГОСТ 1341-74.
Средства, предупреждающие перегревание во время минерализации: стеклянные или карборундовые бусы, или куски твердого фарфора.
Средства, предупреждающие перегревание жидкостей во время перегонки: карборундовые бусы или свежевыжженные куски пемзы.
Средства, предупреждающие пенообразование во время перегонки: парафиновое чистое масло.
Бумажки лакмусовые кислотные или универсальные индикаторы.
Сульфат аммония по ГОСТ 3769-78.
2.4 Проведение испытания
2.4.1. На пергаментной бумаге отвешивают около 2 г пробы с погрешностью не более 0,001 г.
Для проб с большим содержанием жира, масса навески не должна превышать 1,5 г.
2.4.2. Навеску помещают в колбу Кьельдаля, добавляя несколько стеклянных или карборундовых бус или несколько кусочков фарфора, 15,5 г медного катализатора, взвешенного с погрешностью не более 0,1 г, и не более 25 см3 серной кислоты. Содержимое колбы осторожно перемешивают и колбу укрепляют под углом около 40° относительно вертикали на установке для сжигания. Содержимое колбы обогревают осторожно, до появления пенообразования и полного растворения пробы.
Затем обогревают интенсивно и выдерживают в состоянии кипения, вращая периодически колбу вокруг ее оси. После полного осветления содержимое колбы продолжают обогрев в течение 90 мин. Общая продолжительность минерализации должна быть не менее 120 мин. Затем содержимое колбы охлаждают до температуры около 40 °C, осторожно добавляют 50 см3 воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры.
Во избежание потерь во время минерализации пробы следует избегать проникновения пены в горло колбы, испытание проводить в условиях, не удлиняющих чрезмерно его продолжительность, но гарантирующих полную минерализацию пробы.
2.4.3. Содержимое колбы Кьельдаля подвергают перегонке с водяным паром или простой перегонки, для чего монтируют соответствующую установку.
В стадии перегонки следует соблюдать плотность установки для перегонки, добавлять раствор гидроокиси натрия по стенке колбы Кьельдаля и смешивать оба слоя только после подключения колбы к установке.
В качестве приемника применяют коническую колбу вместимостью 500 см3 (при применении титратора химический стакан вместимостью 500 см3), в которую наливают 50 см3 раствора борной кислоты и 4 капли индикатора Таширо. Колбу помещают под холодильник установки для перегонки таким образом, чтобы нижний конец холодильника был полностью погружен в жидкость.
Для перегонки с водяным паром содержимое колбы Кьельдаля количественно переносят в колбу для перегонки, споласкивая колбу Кьельдаля 50 см3 воды. Затем добавляют 3 капли парафинового масла с целью уменьшения пенообразования, осторожно добавляют 100 см3 раствора гидроокиси натрия таким образом, чтобы в колбе перегонки образовались два слоя жидкости. Немедленно герметизируют аппарат и пропускают водяной пар через содержимое колбы для перегонки. С момента кипения содержимого колбы продолжают обогрев в течение 20 мин. Заканчивают перегонку после получения не менее 150 см3 дистиллята.
Для простой перегонки осторожно разбавляют содержимое колбы Кьельдаля, добавляя 300 см3 воды, перемешивают и охлаждают до комнатной температуры, добавляют несколько карборундовых бус или кусков пемзы и 3 капли парафинового масла. Затем добавляют 100 см3 раствора гидроокиси натрия таким образом, чтобы он образовал отдельный слой на дне колбы Кьельдаля, и немедленно подключают колбы к установке для перегонки. Перегонку заканчивают после получения не менее 150 см3 дистиллята.
2.4.4. После сбора не менее 150 см3 дистиллята, полученного после перегонки согласно п. 2.4.3, коническую колбу (приемник) опускают таким образом, чтобы нижний конец холодильника находился над уровнем дистиллята, споласкивают конец холодильника водой и проверяют при помощи лакмусовой бумажки или универсального индикатора изменение окраски конденсата, стекающего из холодильника. При отсутствии изменений окраски перегонку заканчивают.
2.4.5. Содержимое конической колбы (приемника) титруют раствором соляной или серной кислоты (0,1 моль/дм3 — 0,05 моль/дм3), применяя бюретку, и отмечают с погрешностью не более 0,02 см3 количество израсходованной кислоты.
2.4.6. При употреблении титратора вместо конических колб, как приемника, применяют химические стаканы и после окончания перегонки помещают их в титраторе, поступая согласно инструкции по обслуживанию аппарата.
2.4.7. Полученные результаты титрования используют для вычисления содержания общего азота и последующего пересчета на белок.
2.4.8. Из каждой пробы проводят, по крайней мере, два параллельных определения.
2.4.9. Контрольную пробу следует проводить так же, как и опытную. Вместо навески мясного продукта берут кусок пергаментной бумаги.
Контрольную пробу (с повторением) следует проводить каждый раз после приготовления свежей порции реагентов или растворов. Рекомендуется также периодическое повторение контрольной пробы при использовании реагентов, которыми уже давно пользуются.
2.4.10. При получении сомнительных результатов (слишком низких или с большими колебаниями между параллельными испытаниями) необходимо провести проверку установки для перегонки или процедуры минерализации.
Для проверки установки для перегонки в аппарат помещают, например, 10 см3 раствора сульфата аммония 0,05 моль/дм3 (0,1 н), подщелачивают, перегоняют и титруют. Низкий результат (менее 0,95 \cdot 10^{- 3}\text{моль} ) может указывать на неполную перегонку или неплотность аппарата.
Для проверки всего процесса с неорганическим веществом используют сульфат аммония и проводят все испытания, как указано в пп. 2.4.1 - 2.4.5. Низкий результат, который не может быть приписан процессу перегонки, может быть вызван потерями во время испытаний (выплескивание жидкости, улетучивание соединений азота и т.д.).
Для проверки всего процесса с учетом разложения органического вещества определяют содержание азота в органическом трудноразлагаемом соединении (например, в триптофане), чистом или смешанном с веществами, не содержащими азот.
Низкий результат может быть получен из-за недостаточного разложения органического вещества (например, вследствие неправильного обогрева или применения несоответствующего катализатора).
2.5 Обработка результатов
2.5.1 Содержание общего азота (X), в процентах, вычисляют по формуле
X = \frac{0,14 \cdot (V_{1} - V_{2})}{m} , (1)
V_{1} — объем точно 0,1 моль/дм3 — 0,05 моль/дм3 кислоты (0,1 н — 0,1 н), израсходованный на титрование исследуемой пробы, см3;
V_{2} — объем точно 0,1 моль/дм3 — 0,05 моль/дм3 кислоты (0,1 н — 0,1 н), израсходованный на титрование контрольной пробы, см3.
2.5.2. Если разница между двумя параллельными определениями не превышает 0,1% по азоту, то за результат принимают среднее арифметическое двух параллельных определений с точностью до 0,01%. Если разница больше, определение повторяют.
2.5.3. При применении соляной или серной кислоты другой концентрации, в формулу (1) следует ввести соответствующий корректирующий коэффициент.
2.5.4 Содержание общего белка (X_{1}) , в процентах, вычисляют по формуле
X — среднее содержание общего азота в испытуемой пробе, вычисленное по формуле (1), %, (см. п. 2.5.1).