ФС.2.1.0195.18. Фармакопейная статья. Трипсин
(«Государственная фармакопея Российской Федерации. XIV издание. Том III»)
Примечание
В соответствии с Приказом Минздрава России от 31.10.2018 № 749 данный документ введен в действие с 01.12.2018. Текст документа приведен в соответствии с публикацией на сайте http://femb.ru/femb/pharmacopea.php, и разделен в Информационном банке на отдельные фармакопейные статьи. Взамен ГФ X, ст. 703.
МИНИСТЕРСТВО ЗДРАВООХРАНЕНИЯ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ
| Трипсин Trypsinum |
ФС.2.1.0195.18 Взамен ГФ X, ст. 703 |
|---|
Трипсин представляет собой протеолитический фермент, полученный путем активации трипсиногена, выделенного из поджелудочной железы млекопитающих.
В растворе наиболее активен <*> при pH 8,0, но наиболее стабилен при pH 3,0, при котором находится в состоянии обратимого ингибирования.
Субстанция должна обладать протеазной активностью не менее 0,08 тирозиновых единиц (TE_{35,5^{o}}^{HB}) на мг по Ансону и амидазной активностью не менее 6,0 микрокат/мг.
Описание. Белый или почти белый кристаллический или аморфный порошок. Гигроскопичен <*> в аморфном состоянии.
<*> Приводится для информации.
Растворимость. Легко растворим или растворим в воде и натрия хлорида растворе 0,9%.
1. Качественная реакция. 0,2 г субстанции растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, и доводят объем раствора водой до 20 мл. 1,0 мл полученного раствора доводят водой до 100 мл. В лунке агглютинационного планшета смешивают 0,1 мл полученного раствора и 0,2 мл раствора тозиларгинина метилового эфира гидрохлорида. В течение 3 мин должно развиться красно-фиолетовое окрашивание.
2. Качественная реакция. 0,2 г субстанции растворяют в воде, свободной от углерода диоксида, и доводят объем раствора водой до 20 мл. 0,5 мл полученного раствора доводят водой до 5 мл. Прибавляют 0,1 мл тозил-лизил-хлорметана гидрохлорида раствора 2%. Доводят pH раствора до 7,0, взбалтывают в течение 2 часов и доводят объем раствора водой до 50 мл. В лунке агглютинационного планшета смешивают 0,1 мл полученного раствора и 0,2 мл раствора тозиларгинина метилового эфира гидрохлорида. В течение 3 мин не должно наблюдаться красно-фиолетового окрашивания.
Удельный показатель поглощения. От 13,5 до 16,5 в максимуме поглощения при длине волны 280 нм, не более 7,0 в максимуме поглощения при длине волны 250 нм (0,03% раствор в 0,001 М хлористоводородной кислоте, ОФС «Спектрофотометрия в ультрафиолетовой и видимой областях»).
Прозрачность раствора <**>. Опалесценция раствора 0,1 г субстанции в 10 мл воды, свободной от углерода диоксида не должна превышать эталон сравнения III (ОФС «Прозрачность и степень мутности жидкостей»).
Цветность раствора <**>. Раствор, приготовленный в испытании «Прозрачность раствора» должен быть бесцветным (ОФС «Степень окраски жидкостей»).
Химотрипсин. Определение проводят потенциометрически (ОФС «Ионометрия», метод 3).
Испытуемый раствор. К 1,8 мл буферного раствора pH 8,0 прибавляют 7,4 мл воды и 0,5 мл 0,2 М ацетилтирозина этилового эфира. При взбалтывании раствора прибавляют 0,3 мл 1% раствора субстанции в воде, свободной от диоксида углерода, и ровно через 5 мин измеряют pH.
Раствор сравнения. К 1,8 мл буферного раствора pH 8,0 прибавляют 7,4 мл воды и 0,5 мл ацетилтирозина этилового эфира раствор 0,2 М. При взбалтывании раствора прибавляют 0,3 мл 0,05% раствора стандартного образца химотрипсина в воде, свободной от углерода диоксида, и ровно через 5 мин измеряют pH.
Значение pH испытуемого раствора должно быть выше значения pH раствора сравнения.
pH. От 3,0 до 6,0 (1,0% раствор, ОФС «Ионометрия», метод 3).
Сульфаты. Не более 0,5% (ОФС «Сульфаты», метод 1). 20 мг субстанции растворяют в 10 мл воды.
Потеря в массе при высушивании. Не более 7% (ОФС «Потеря в массе при высушивании», способ 1). Около 0,3 г (точная навеска) субстанции высушивают в вакууме при температуре 60 +/- 2 °C и остаточном давлении не более 5,0 мм рт.ст.
Остаточные органические растворители. В соответствии с ОФС «Остаточные органические растворители».
Аномальная токсичность <**>. Субстанция должна быть нетоксичной (ОФС «Аномальная токсичность»). Тест-доза — 0,25 мг субстанции в 0,5 мл натрия хлорида раствора 0,9% на мышь, внутримышечно. Срок наблюдения — 24 ч.
Пирогенность <**>. Субстанция должна быть апирогенной (ОФС «Пирогенность»). Тест-доза: 0,1 мг субстанции в 1 мл 0,9% раствора натрия хлорида на 1 кг массы кролика.
Микробиологическая чистота. В соответствии с ОФС «Микробиологическая чистота».
Стерильность <**>. Субстанция должна быть стерильной (ОФС «Стерильность»).
<**> Контроль по показателям качества «Прозрачность раствора», «Цветность раствора», «Аномальная токсичность», «Бактериальные эндотоксины», «Пирогенность» и «Стерильность» проводят в субстанции, предназначенной для производства лекарственных препаратов для парентерального применения.
1. Протеазная активность. Не менее 0,07 тирозиновых единиц (TE_{35,5^{o}}^{HB}) на мг по Ансону. Метод основан на определении количества тирозина, освобождаемого трипсином из гемоглобина в определенных условиях.
Субстанция имеет активность в 1 тирозиновую единицу, если при ее воздействии на субстрат гемоглобин в течение одной минуты освобождается такое количество продуктов гидролиза, не осаждаемых трихлоруксусной кислотой, которое при реакции с реактивом Фолина-Чокальтеу соответствует 1 миллиэквиваленту (мэкв) тирозина.
Около 25 мг (точная навеска) субстанции растворяют в 200 мл хлористоводородной кислоты раствора 0,0025 М. 2,0 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 20 мл и доводят объем раствора 0,0025 М раствором хлористоводородной кислоты до метки. В контрольную и 3 опытные пробирки вносят по 5 мл субстрата. В контрольную пробирку прибавляют 10 мл трихлоруксусной кислоты раствора 0,3 М, 1 мл приготовленного раствора субстанции и тщательно перемешивают. Опытные пробирки и раствор субстанции нагревают в водяной бане при 35,5 +/- 0,5 °C в течение ровно 3 минут.
К содержимому пробирок прибавляют по 1 мл раствора субстанции с интервалом в 30 сек по секундомеру, тщательно перемешивают и выдерживают в термостате при той же температуре в течение ровно 10 минут. Затем в каждую пробирку с интервалом в 30 сек по секундомеру прибавляют по 10 мл трихлоруксусной кислоты раствора 5%. После осаждения белков смесь выдерживают при комнатной температуре 30 минут, после чего фильтруют содержимое контрольной и опытных пробирок. В конические колбы вместимостью 25 мл вносят по 5 мл фильтрата, по 10 мл 0,5 М раствора натрия гидроксида и затем, при помешивании, по 3 мл разведенного реактива Фолина-Чокальтеу. Через 10 минут измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 630 нм в кювете с толщиной слоя 1 см.
Построение калибровочного графика. Калибровочный график строят по стандартному раствору тирозина. Около 14,5 мг (точная навеска) чистого тирозина растворяют в 100 мл хлористоводородной кислоты раствора 0,2 М. Полученный исходный раствор содержит 8·10-4 мэкв тирозина в 1 мл. Для получения стандартного раствора 10 мл исходного раствора переносят в мерную колбу емкостью 50 мл и доводят объем раствора 0,2 М раствором хлористоводородной кислоты до метки. 5 мл полученного раствора содержат 0,0008 мэкв (8·10-4 мэкв) тирозина.
Для построения калибровочного графика готовят следующие разведения стандартного раствора:
После этого к содержимому каждой пробирки прибавляют по 10 мл натрия гидроксида раствора 0,5 М и по 3 мл реактива Фолина-Чокальтеу разведенного. Через 10 минут измеряют оптическую плотность растворов на спектрофотометре при длине волны 630 нм в кювете с толщиной слоя 1 см, сравнивая с контрольным опытом. Затем строят калибровочный график, откладывая по оси абсцисс количество тирозина в миллиэквивалентах в пробе, а по оси ординат — соответствующие оптические плотности.
Из величины оптической плотности опытных растворов вычитают величину оптической плотности контрольного раствора и по найденной оптической плотности и калибровочному графику находят содержание тирозина в миллиэквивалентах в опытных пробах.
Количество тирозиновых единиц в 1 г субстанции (X) вычисляют по формуле:
X = \frac{C \cdot V \cdot 16 \cdot 1000}{a \cdot 5 \cdot 10}
C — содержание тирозина в опытной пробе, мэкв (среднее арифметическое из трех определений);
V — объем, в котором растворена субстанция, мл;
Примечание. 1. Приготовление 22% раствора гемоглобина. 2,2 г сухого гемоглобина растворяют в воде и доводят объем раствора водой до 10 мл.
2. Приготовление раствора субстрата. К 8,0 мл 1 М раствора натрия гидроксида прибавляют 72,0 мл воды, 36,0 г мочевины и 10,0 мл 22% раствора гемоглобина. Смесь термостатируют в течение 45 +/- 15 мин при 25 °C, после чего к ней прибавляют раствор 4 г мочевины в 10 мл 1 М раствора калия дигидрофосфата. pH полученного раствора должен быть 7,5 — 8,0. Хранят при 5 +/- 3 °C не более 10 суток.
2. Амидазная активность. Не менее 6,0 микрокаталь/мг. Метод основан на определении количества n-нитроанилина, освобождаемого трипсином из синтетического субстрата — гидрохлорида N^{\alpha} -бензоил-DL-аргинин-n-нитроанилида (БАПНА, CAS 911-77-3). Все растворы используются свежеприготовленными.
Субстанция имеет активность в 1 микрокаталь, если при ее воздействии на субстрат БАПНА в течение одной секунды освобождается 1 микромоль n-нитроанилина.
Раствор n-нитроанилина. Около 50 мг (точная навеска) нитроанилина растворяют в мерной колбе вместимостью 100 мл в смеси 0,1 М трис-гидрохлорид буферный раствор pH 7,8-диметилсульфоксид-уксусной кислоты раствор 5 М 96:4:20.
1 мл полученного раствора помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводят объем раствора той же смесью до метки. Получают раствор с концентрацией около 5 мкг/мл. При необходимости раствор дополнительно разбавляют так, чтобы оптическая плотность при длине волны 405 нм составляла 0,35 +/- 0,15. Измеряют оптическую плотность полученного раствора при длине волны 405 нм по сравнению со смесью 4,8 мл 0,1 М трис-гидрохлорид буферного раствора pH 7,8, 0,2 мл диметилсульфоксида и 1 мл уксусной кислоты раствора 5 М.
Коэффициент наномолярной экстинкции n-нитроанилина (K, л·нмоль-1·см-1) вычисляют по формуле:
K = \frac{A_{405} \cdot 138,12 \cdot 100 \cdot 100 \cdot P}{a \cdot 1000000000}
А405 — оптическая плотность раствора n-нитроанилина при длине волны 405 нм;
а — а-навеска нитроанилина, мг;
138,12 — молекулярная масса нитроанилина;
100, 100 — разведение навески нитроанилина;
Р — дополнительное разведение раствора n-нитроанилина (если применялось);
1 000 000 000 — пересчет моль в наномоль.
Испытуемый раствор. Около 20,0 мг (точная навеска) субстанции помещают в мерную колбу вместимостью 100 мл, растворяют в 0,1 М трис-гидрохлорид буферном растворе pH 7,8 и доводят объем раствора тем же растворителем до метки.
Раствор субстрата. 100 мг (точная навеска) гидрохлорида БАПНА растворяют при 35 +/- 2 °C в 10 мл диметилсульфоксида. При хранении при температуре от 2 до 10 °C раствор пригоден для использования в течение 3 суток.
Проведение анализа. В три опытные пробирки вместимостью 10 мл и три контрольные пробирки вносят по 4,6 мл 0,1 М трис-гидрохлорида буферного раствора pH 7,8.
В контрольные пробирки прибавляют 1 мл 0,5 М уксусной кислоты, перемешивают и прибавляют 0,2 мл испытуемого раствора.
В опытные пробирки прибавляют по 0,2 мл испытуемого раствора.
Все пробирки термостатируют в течение 5 мин при 25,0 +/- 0,5 °C.
Во все пробирки в определенном порядке с интервалом 30 с прибавляют по 0,2 мл раствора субстрата и продолжают термостатирование при 25,0 +/- 0,5 °C в течение 900 с. Для остановки реакции, во все опытные пробирки в том же порядке с интервалом в 30 с прибавляют по 1,0 мл уксусной кислоты раствора 5 М и перемешивают.
Измеряют оптическую плотность растворов в опытных пробирках на спектрофотометре при длине волны 405 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм по сравнению с растворами в контрольных пробирках.
Амидазную активность трипсина (X) в нанокатал на мг субстанции вычисляют по формуле:
X = \frac{A_{405} \cdot 6 \cdot 100}{K \cdot 0,2 \cdot 900 \cdot a}
A405 — средняя арифметическая оптическая плотность опытных растворов по сравнению с контрольными;
К — коэффициент наномолярной экстинции n-нитроанилина, л·нмоль-1·см-1;
6 — объем испытуемых растворов, мл;
100 — исходный объем раствора субстанции, мл;
0,2 — объем раствора субстанции в анализе, мл;
Хранение. В сухом, защищенном от света месте, при температуре от 2 до 8 °C.