Методические указания по определению оксадиксила в картофеле, огурцах, томатах, сахарной свекле, винограде, почве и воде методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 27.07.1991 № 6270-91)
Утверждено Министерством здравоохранения СССР 27 июля 1991 г. № 6270-91
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОКСАДИКСИЛА В КАРТОФЕЛЕ, ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, САХАРНОЙ СВЕКЛЕ, ВИНОГРАДЕ, ПОЧВЕ И ВОДЕ МЕТОДАМИ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Разработчики: ВНИИХСЗР. Ф.Р. Мельцер, К.Ф. Новикова.
Оксадиксил 2-метокси-N-(2-оксо-1,3-оксазолидин-3-ил)ацет-2,6-ксилидин (ИЮПАК).
В чистом виде белые кристаллы с Tпл. 104 — 105 °C. Растворимость в % при 25 °C: в воде — 0,34, ацетоне — 34,4, диэтиловом эфире — 0,6, диметилсульфоксиде — 39, этаноле — 5, ксилоле — 1,7.
Сандофан — фунгицид, эффективный против грибковых заболеваний фруктовых и овощных культур. ЛД50 для крыс 1860 — 3480 мг/кг. МДУ оксадиксила в картофеле, свекле сахарной — 1 мг/кг, в яблоках, томатах, винограде — 0,5 мг/кг. ОБУВ в воде санитарно-бытового водопользования — 0,05 мг/л. ОДК в почве — 0,5 мг/кг. ДСД — 0,017 мг/кг веса человека в сутки.
2.1 Основные положения.
2.1.1 Принцип метода.
Метод основан на извлечении оксадиксила из анализируемого объекта этилацетатом, очистке экстракта на колонке с оксидом алюминия и определении газожидкостной хроматографией. При определении методом ТСХ дополнительно проводится очистка микросублимацией в вакууме.
2.1.2 Избирательность метода.
Метод селективен, фосфорорганические пестициды, симм-триазиновые гербициды, байлетон, байтан, ридомил определению не мешают. Селективность обеспечивается сочетанием метода ГЖХ и ТСХ.
2.1.3 Метрологическая характеристика метода
Метрологическая характеристика метода представлена в таблице 1.
2.2 Реактивы и растворы.
Этилацетат, хч., МРТУ 6-09-6515.
Хлороформ, чда., ГОСТ 20015-74.
Оксид алюминия 2 степени активности по Брокману, нейтральный, производства ВНР, Реанал или отечественный, для хроматографии. МРТУ 6-09-5296-68.
Хроматон N-AW-HMDS (0,20 — 0,25 мм). ЧССР. Хемапол.
Карбовакс 20М, полиэтиленгликоль 20000.
Сульфат натрия, хч., ТУ 6-09-3675-74, безводный.
Азот газообразный из баллона с редуктором. ГОСТ 9293-74.
Водород из баллона с редуктором, ГОСТ 3022-80, или получаемый из генератора водорода.
Воздух из баллона с редуктором, ГОСТ 11882-73, или нагнетаемый компрессором.
Хлороводородная кислота, HCl, ч., ГОСТ 3118-77, концентрированная.
Перманганат калия, ч., ГОСТ 20490-75.
Уксусная кислота, ч., ГОСТ 18270-72, ледяная.
Йодид калия, KI, ч., ГОСТ 4232-74.
2.3 Приборы и посуда.
Хроматограф «Цвет-106» или аналогичный прибор с термоионным детектором.
Хроматографическая колонка стеклянная, длиной 65 см, внутренним диаметром 3 мм.
Хроматографическая камера с пришлифованной крышкой, ГОСТ 25336-82.
Хроматографическая колонка с краном и оттянутым носиком, длиной 10 см, внутренним диаметром 1 см.
Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный.
Лампа УФ-света, ТУ 16-535-280-74, или аналогичная.
Градуированные пробирки, ГОСТ 1770-74, с пробками на шлифах, вместимостью 10 и 5 мл.
Микрошприц на 100 мкл или микропипетка, ГОСТ 20292-74, на 0,1 мл.
Делительные воронки, ГОСТ 25336-82, вместимостью 1 л.
Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.
Колбы плоскодонные, ГОСТ 9737-70, вместимостью 500 и 250 мл.
Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.
Колбы грушевидные, ГОСТ 9737-70, вместимостью 50 мл.
Воронки химические, ГОСТ 25336-82.
Пластинки хроматографические «Silufol» или «Sorbfil», ТУ 26-11-17-89, производство ПКБ Пластмаш, ИВС АН СССР, г. Краснодар.
2.4 Отбор, хранение и подготовка проб.
2.4.1 Отбор проб.
Отбор проб для анализа проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными Минздравом СССР 21 августа 1979 г. № 2051-79.
2.4.2 Подготовка проб к анализу.
Для анализа картофеля, томатов, огурцов, сахарной свеклы из отдельных клубней или плодов ножом вырезают сектора толщиной 2 — 3 мм и измельчают их на мелкие дольки. Для анализа винограда отбирают 2 — 3 ягоды из каждой грозди и также измельчают ножом.
Подготавливают по 3 — 5 параллельных навесок анализируемых образцов, массой 50 г. Почву просеивают через почвенное сито и отбирают навески массой 10 г.
2.5 Подготовка к определению.
2.5.1 Приготовление стандартных растворов.
Стандартный раствор оксадиксила из очищенного препарата с содержанием действующего вещества не менее 95,0% — в ацетоне с концентрацией 100 (раствор № 1) и 10 (раствор № 2) мкг/мл. Стандартные растворы стабильны при хранении в темном месте при температуре 22 — 24 °C в течение 6 месяцев.
2.5.2 Приготовление проявляющих реагентов.
Проявляющий реагент. Растворяют 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, доводят до 500 мл дистиллированной воды и прибавляют 1 г йодида калия. Раствор хранят в темной склянке. Годен к употреблению в течение длительного времени.
2.5.3 Подготовка газохроматографической колонки.
Для приготовления насадки колонки для хроматографического анализа жидкую фазу карбовакс 20 М в количестве 2% от веса хроматона помещают в круглодонную колбу и растворяют в хлороформе. Объем хлороформа должен быть в два раза больше насыпного объема сорбента и должен занимать не более 1/3 объема круглодонной колбы.
В полученный раствор при постоянном перемешивании насыпают хроматон. Колбу подсоединяют к ротационному вакуумному испарителю и перемешивают содержимое колбы без подогрева в течение нескольких минут. Затем колбу помещают в горячую водяную баню и отгоняют растворитель полностью с подсоединением слабого вакуума. Сорбент с нанесенной фазой высыпают в фарфоровую чашку и нагревают в сушильном шкафу при 80 — 100 °C в течение 30 мин, охлаждают на воздухе, перемешивая стеклянной палочкой. Подготовленный таким образом носитель хранят в стеклянной склянке с притертой пробкой.
Хроматографическую колонку заполняют насадкой с подсоединением слабого вакуума. Колонку кондиционируют при скорости азота 70 — 80 мл/мин в режиме программирования температуры от 50 до 240 °C, со скоростью нагрева 2 °C в мин, а затем в изотермическом режиме при 240 °C в течение 6 — 8 час без подсоединения колонки к детектору.
2.5.4 Приготовление колонки с оксидом алюминия
В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию 4 г оксида алюминия в 15 мл хлороформа (при открытом кране колонки). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают возможность стечь избытку растворителя, оставляя маленький слой его (0,2 — 0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают.
2.5.5 Подготовка хроматографических камер.
Хроматографическую камеру за один час до начала хроматографирования заполняют смесью подвижных растворителей: хлороформ и гексан:ацетон (3:2) для насыщения камеры парами подвижного растворителя. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте находиться не выше, чем на 0,7 — 1,0 см от уровня дна камеры.
2.5.6 Подготовка хлорирующей камеры
Камеру для хлорирования готовят следующим образом: на дно эксикатора помещают чашку Петри с 5 г KMnO4, а затем к ее содержимому осторожно приливают 15 мл концентрированной HCl. Эксикатор закрывают пришлифованной крышкой. Камера может быть использована через 10 — 15 мин.
2.6 Описание определения
2.6.1 Экстракция и очистка экстрактов
2.6.1.1 Картофель, томаты, огурцы, виноград, сахарная свекла.
Навеску анализируемой пробы (50 г) помещают в плоскодонную колбу, вместимостью 500 мл, заливают 100 мл этилацетата и проводят экстракцию оксадиксила при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Экстракцию оксадиксила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Этилацетат удаляют с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью. Сухой остаток с помощью 2 — 3 мл хлороформа количественно переносят на колонку с оксидом алюминия.
Каждый раз дают возможность раствору впитаться в сорбент, открывая кран колонки, но не допуская ее осушения. Во всех случаях над сорбентом должен оставаться небольшой стой растворителя (2 — 3 мм). Оксадиксил элюируют с колонки 10 мл хлороформа, собирая элюат в круглодонную колбу. Элюирование проводят со скоростью 1 кап/сек. Равномерность потока растворителя обеспечивается вакуумом, регулируемым водоструйным насосом.
Из приемной колбы вместимостью 20 — 25 мл с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл ацетона. Колбочку закрывают пришлифованной пробкой и ее стенки тщательно обмывают растворителем. В хроматограф вводят 3 мкл полученного раствора.
При определении методом ТСХ очистки экстракта на колонке с оксидом алюминия, как правило, недостаточно. Для этого дополнительно вводится очистка микросублимацией в вакууме. Для этого из колбы, после отгона растворителя с помощью ацетона оксадиксил количественно переносится в патрон сублиматора и растворитель при нагревании патрона сублиматора на горячей водяной бане полностью удаляется. Необходимо следить, чтобы остаток равномерно распределялся по дну патрона. В патрон сублиматора вставляют «палец» сублиматора, подсоединяют водяное охлаждение и сублимируют оксадиксил при 0,3 мм рт. ст. на кипящей водяной бане в течение 40 мин.
После охлаждения сублиматора и снятия вакуума, «палец» вынимают из патрона и смывают оксадиксил с «пальца» в градуированную пробирку вместимостью 5 мл ацетона. В пробирку вставляют заплавленный в верхней части стеклянный капилляр и концентрируют ее содержимое на горячей водяной бане до объема 1 мл. На хроматографическую пластинку наносят 0,1 мл полученного раствора.
2.6.1.2. Почва. К 10 г почвы, растертой в фарфоровой ступке, добавляют 2 мл дистиллированной воды. Почву тщательно увлажняют. Экстракцию оксадиксила проводят этилацетатом три раза порциями по 50 мл при механическом встряхивании колбы в течение 30 мин. Дальнейшее определение проводят согласно разделу 2.6.1.1.
2.6.1.3. Вода. 500 мл воды помещают в делительную воронку вместимостью 1 л, добавляют около 5 г хлорида натрия и 50 мл хлороформа. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию оксадиксила повторяют еще дважды тем же количеством растворителя. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (-10 — 12 г).
Раствор сливают через бумажный фильтр порциями в грушевидную колбочку вместимостью 50 мл. Концентрируют каждую порцию с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 2 мл. Последнюю порцию растворителя отгоняют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 мл ацетона, колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. В хроматограф вводят 3 мкл. На хроматографическую пластинку наносят 0,1 мл полученного раствора.
2.6.2 Условия хроматографирования.
2.6.2.1 ГЖХ.
Насадка колонки 2% карбовакса 20 М на хроматоне N-AW-HMДS (0,20 — 0,25).
Длина и внутренний диаметр колонки 65 см x 3,0 мм.
Скорость потока газа — носителя азота 100 мл/мин.
Скорость потока водорода 20 мл/мин.
Скорость потока воздуха 300 мл/мин.
Температура термостата колонки 240 °C.
Температура испарителя 240 °C.
Рабочая шкала электрометра 5·10-10 а.
Скорость протяжки ленты самописца 240 мм/час.
Время удерживания оксадиксила 3 мин. 38 с.
Линейный диапазон определения 3 — 180 нг.
2.6.2.2 ТСХ.
На хроматографические пластинки с помощью микрошприца 100 мкл или микропипетки на 0,1 мл наносят аликвотную часть полученного по п. 2.!. раствора. Справа и слева таким же способом наносят серию стандартных растворов оксадиксила с содержанием 0,2; 0,3; 0,4; 0,5 ........ 1,0 мкг. Градуировочные растворы готовят в градуированных пробирках вместимостью 10 мл с пробками на шлифах согласно таблице 2.
Хроматограмму развивают в системе сначала хлороформ, а затем после высушивания хроматограммы — гексан:ацетон (3:2). После развития высушенную хроматограмму помещают под лампу УФ-света на 10 мин, а затем на 10 мин в свежеприготовленную хлорирующую камеру. После удаления избытка хлора пластинку обрабатывают из пульверизатора проявляющим реагентом. Оксадиксил проявляется в виде темных пятен на белом фоне с Rf 0,30 = 0,05. Линейный диапазон определения 0,2 — 1,0 мкг. Пятна стабильны в течение длительного времени.
2.6.3 Обработка результатов анализа.
2.6.3.1 ГЖХ.
Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом, по высоте пика. Стандартный раствор с содержанием 10 мкг/мл оксадиксила вводят до и после введения рабочей пробы.
Содержание оксадиксила в анализируемой пробе (X) в мг/кг или мг/л вычисляют по формуле:
X = \frac{C_{\text{ст}} \cdot \text{Н}_{\text{пр}} \cdot V}{\text{Н}_{\text{ст}} \cdot V_{a} \cdot P} , мг/кг, мг/л, где
C — количество стандарта, введенного в хроматограф, нг;
Hпр — высота пика рабочей пробы, мм:
Hст — высота пика стандарта, мм;
V — общий объем рабочего раствора, мл;
Vа — объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл;
P — навеска анализируемого образца в г или объем пробы воды в мл.
Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит «зашкаливание» к рабочему раствору пипеткой добавляют замеренное количество ацетона и анализируют более разбавленный раствор.
2.6.3.2 ТСХ.
Количественное определение оксадиксила проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов.
Содержание оксадиксила в анализируемой пробе (X) мг/кг (мг/мл) вычисляют по формуле:
\text{Х } = \frac{\text{С } \cdot V}{V_{a} \cdot P} мг/кг (мг/л), где
C — содержание оксадиксила, найденное в хроматографируемой пробе, мкг.
Vа — объем аликвоты, нанесенной на пластинку, мл;
P — навеска или объем анализируемой пробы в г или мл.
3. Требования техники безопасности.
При работе соблюдать требования безопасности, принятые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.