Временные методические указания по определению остаточных количеств имазетапира в сое, горохе, сырье лекарственных культур, почве, воде методом тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 29.07.1991 № 6245-91)
29 июля 1991 г. № 6245-91
ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИМАЗЕТАПИРА В СОЕ, ГОРОХЕ, СЫРЬЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ КУЛЬТУР, ПОЧВЕ, ВОДЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ
Калинин В.А. — к.с.н., профессор, зав. кафедры ТСХА; Пушкина Г.П. — к.б.н.
Российский институт лекарственных культур: Борисов Г.С. — зав. КТЛ РРСТАЗР: Федорова Н.Е. — к.х.н., МНИИГ им. Эрисмана.
Настоящие методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхозпрода РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.
1. КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТА
Имазетапир — действующее вещество гербицида пивот, ф. Цианамид, США.
Химическое название: (RS)-5-этил-2-(4-изопропил-4-метил-5-оксо-2- имидозолин-2-ил) никотиновая кислота.
Молекулярная формула: C_{15}H_{19}N_{3}O_{3} .
Химически чистый препарат пивота представляет собой порошок от белой до желтой окраски с легким кисловатым запахом. Т. пл. 169 — 173 °C, Т. кип. 180 °C. Растворимость при 25 °C (г/100 мл): в ацетоне — 4,82; диметилсульфоксиде — 42,25; метаноле — 10,5; пропаноле — 1,73; воде — 0,14. Давление паров — 1 \cdot 10^{- 7}\text{мм рт}.\text{ст} .
Препарат малотоксичен для теплокровных. \text{ЛД}_{50} для кроликов и мышей при оральном введении 5000 мг/кг. При прямом контакте не оказывает раздражающего действия на кожу.
МДУ пивота в бобах сои — 0,5 мг/кг, ПДК пивота в почве — 0,1 мг/кг, в воде — 0,7 мг/л, ОБУВ в воздухе рабочей зоны — 2,0 мг/м3, в атмосферном воздухе — 0,04 мг/м3.
Пивот применяется в борьбе с сорной растительностью в посевах бобовых культур.
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод определения имазетапира основан на извлечении гербицида из бобов и травы сои подкисленным водным этанолом, из травы лекарственных культур и гороха (зерно) — 70% водным ацетоном,из почвы смесью ацетона и 0,05 н CaCl_{2} , очистке экстрактов путем переэкстракции с последующим определением вещества тонкослойной хроматографией.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода
I. В качестве проявляющего реагента — О-толидин. Минимально определяемое количество имазетапира в пробе — 0,5 мкг. Нижний предел определения пивота в лекарственном сырье (трава) и горохе (зерно) — 0,08 мг/кг, в почве — 0,05 мг/кг, в воде — 0,01 мг/кг, % обнаружения пивота в сырье — 68 — 70%, в почве — 75 — 80%.
II. В качестве проявляющего реагента — бромфеноловый синий. Минимально определяемое количество пивота в пробе — 3 мкг. Нижний предел обнаружения пивота в сырье бобов сои — 0,3 мг/кг, в траве — 0,30 мг/кг, в почве — 0,15 мг/кг, в воде — 0,07 мг/кг.
2.1.3 Избирательность метода
Метод селективен. Прочие пестициды не мешают определению.
2.2. Реактивы и растворы
Ацетон, х.ч., ГОСТ 22300-76.
Хлороформ, х.ч., ГОСТ 22300-76, перегнанный.
Имазетапир, ан. станд., фирма Цианамид.
Н-гексан, ч.д.а., ТУ 6-09-3375-78.
Сульфат натрия, х.ч., ТУ 6-09-3675-74, безводный.
Соляная кислота, ч., ГОСТ 3118-77.
Этиловый спирт, ректиф., ГОСТ 5962-67.
Уксусная кислота, ч., ГОСТ 18270-72, ледяная.
Перманганат калия, ГОСТ 20490-75.
Йодид калия, ч., ГОСТ 4222-74.
Азотнокислое серебро, ч.д.а., ГОСТ 1277-81.
Бромфеноловый синий, ч.д.а., ТУ 6-09-113-2.
Проявляющие реагенты: I. Растворяют 0,16 г о-толидина в 30 мл ледяной уксусной кислоты, доводят до 500 мл дистиллированной водой и прибавляют 1 г йодида калия. Раствор хранят в темной склянке. Годен к употреблению в течение длительного времени. II. 0,05 г бромфенолового синего растворяют в 10 мл ацетона и доводят до 100 мл 1% раствором нитрата серебра в водном ацетоне (ацетон — вода, 3:1).
Экстрагирующая смесь: 1 часть 1 M HCl, 39 частей H_{2}O и 60 частей этанола.
Стандартные растворы имазетапира в ацетоне с содержанием 100 мкг/мл и 10 мкг/мл.
2.3. Приборы, аппаратура, посуда
Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 11-97-76.
Хроматографическая камера с пришлифованной крышкой.
Мерные колбы, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 мл.
Делительные воронки, ГОСТ 25336-82, вместимостью 500 мл, 250 мл.
Пипетки градуированные, ГОСТ 20292-74 на 10, 1 и 0,1 мл.
Градуированные пробирки, ГОСТ 1770-74, с пробками на шлифах, вместимостью 10 мл.
Колбы плоскодонные, ГОСТ 25335-82, вместимостью 500 и 250 мл.
Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 100 и 25 мл.
Микрошприцы на 100 мкл, ГОСТ 20292.
Хроматографические пластинки «Silufol», Чехословакия.
Хроматографические пластинки «Сорбфил», ТУ 26-11-17-89 ПКБ Пластмаш, МВС АН России, г. Краснодар.
Зерновая мельница или кофемолка.
2.4. Подготовка к определению
2.4.1 Подготовка камеры для хлорирования
Хлорирующий раствор готовят быстрым смешиванием четыреххлористого углерода, 3% раствора перманганата калия и 12% раствора HCl (1:1:1).
2.4.2 Подготовка хроматографических камер
Хроматографическая камера заполняется смесью подвижных растворителей: I. Н-гексан — хлороформ — уксусная кислота — этиловый спирт (20:2:2:4) (для лекарственного сырья).
II. Н-гексан — этанол — хлороформ — уксусная кислота (30:10:5:1) (для сои). Для насыщения камеры парами подвижных растворителей необходимо 1 — 1,5 часа при температуре не менее 20 — 25 °C.
2.5. Отбор проб
Отбор проб для проведения определения проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов внешней среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными Минздравом СССР 21 августа 1979 года № 2051-79.
2.6. Подготовка проб к анализу
Сухое сырье (траву) лекарственных культур, трав и бобы сои, зерна гороха измельчают на зерновой мельнице или кофемолке, сырое сырье режут ножницами, навеску бобов (сырую) растирают в ступке.
Сырую почву растирают в ступке, а сухую просеивают через сито.
2.7. Проведение определения
Лекарственное сырье (трава), горох (зерно).
Навеску сырой травы 50 г или сухой 10 г, зерен гороха (сухой) — 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Пробу заливают 100 и 50 мл 70% подкисленного HCl ацетона соответственно и оставляют на ночь. Экстракт фильтруют и повторяют экстракцию 2 раза по 50 и 25 мл растворителя.
Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, добавляют 50 мл дистиллированной воды, подкисляют концентрированной H_{2}SO_{4} до pH = 2 и приливают 30 мл гексана. Содержимое взбалтывают в течение 2-х минут. Гексановую фракцию отбрасывают, в делительную воронку к оставшейся водно-ацетоновой фракции добавляют 30 мл хлороформа и пивот экстрагируют путем встряхивания в течение 2-х минут.
Повторяют экстракцию еще 2 раза по 25 мл. Хлороформные экстракты объединяют и переносят в делительную воронку, приливают 25 мл 50% водного раствора бикарбоната натрия, встряхивают содержимое в течение 2-х минут. После разделения слоев хлороформ отбрасывают, а в бикарбонат добавляют 1 M H_{2}SO_{4} до pH = 2. Жидкость перемешивают до полной дегазации.
Далее в бикарбонатный раствор добавляют 25 мл хлороформа и 10 г хлористого натрия. Воронку встряхивают. После разделения фаз хлороформный слой переносят в отгонную колбу, пропуская его через слой безводного сернокислого натрия. Повторяют экстракцию порциями хлороформа по 15 мл. Хлороформ отгоняют под вакуумом при 40 °C досуха.
Сухой остаток растворяют в 0,5 мл ацетона.
Соя, (трава, бобы). Навеску бобов сои 50 г сырых и 20 г сухих заливают экстрагирующей смесью ( HCl1M:H_{2}O:\text{этанол} , (1:39:60)) 100 и 50 мл соответственно и оставляют на ночь.
Навеску травы сои 50 г сырой и 50 г сухой также заливают экстрагирующей смесью и оставляют на ночь.
Экстракты фильтруют через воронку Бюхнера, промывая пробу экстрагирующей смесью дважды по 50 мл.
Объединенные экстракты переносят в делительную воронку, доводят pH раствора до 1 — 2 и приливают 30 мл смеси гексана. Далее определение проводят так, как в случае лекарственного сырья.
Почва. Навеску сырой почвы 100 г, навеску сухой/почвы 50 г заливают смесью ацетона и 0,05 н CaCl_{2} (2:1) и оставляют на ночь.
Количество смеси: 100 мл в случае сырой почвы, 50 мл в случае сухой.
Экстракт фильтруют в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще 2 раза по 50 и 25 мл растворителя. Объединенные в делительной воронке экстракты подкисляют 1 M H_{2}SO_{4} до pH = 2, добавляют 50 мл хлороформа и пивот экстрагируют при перемешивании в течение 2-х минут.
Далее определение вещества проводят аналогично описанному для лекарственного сырья.
Вода. 200 мл воды помещают в делительную воронку на 500 мл, подкисляют конц. H_{2}SO_{4} до pH = 2. Имазетапир экстрагируют трижды по 30 мл хлороформа. Объединенные хлороформные экстракты пропускают через слой безводного сернокислого натрия. Растворитель упаривают досуха при температуре t = 40 °C. Остаток растворяют в 0,5 мл ацетона.
2.7.1 Хроматографирование
На хроматографические пластинки «Силуфол» и «Сорбфил» с помощью микропипетки на 0,1 мл наносят 0,1 мл раствора. Справа и слева наносят серию стандартных растворов имазетапира с содержанием вещества 0,4; 0,5; 0,6; 0,8; 1,0 мкг в случае проявляющего реагента о-толидина. Градуировочные растворы готовят в мерных пробирках на 10 мл согласно таблице 1.
реагенте о-толидин
| Номер стандарта | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Взято стандартного раствора имазетапира 10 мкг/мл | 4 | 5 | 6 | 8 | 10 |
| Добавлено ацетона в мл | 6 | 5 | 4 | 2 | 0 |
| Содержание имазетапира в 0,1 мл в мкг | 0,4 | 0,5 | 0,6 | 0,8 | 1 |
В случае проявляющего реагента бромфенолового синего стандартные растворы определяемого соединения наносятся с содержанием 2; 3; 4; 5; 7 мкг. Градуировочные растворы готовят в мерных пробирках на 10 мл согласно таблице 2.
реагенте бромфеноловый синий
| Номер стандарта | |||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | |
| Взято стандартного раствора имазетапира 100 мкг/мл | 2 | 3 | 4 | 5 | 7 |
| Добавлено ацетона в мл | 8 | 7 | 6 | 5 | 3 |
| Содержание имазетапира в 0,1 мл в мкг | 2 | 3 | 4 | 5 | 7 |
Хроматографирование осуществляют в системах:
I. Н-гексан — хлороформ — уксусная кислота — этанол (20:2:2:1) (для лекарственного сырья, почвы и воды).
II. Н-гексан — этанол — хлороформ — уксусная кислота (30:10:5:1) (для сои, почвы и воды).
При подъеме фронта растворителя на 10 см на пластинках «Силуфол» и на 5 см на пластинках «Сорбфил» пластинки вынимают из хроматографической камеры, сушат на воздухе. Далее пластинки обрабатывают проявляющим реагентом:
I. Пластинку помещают под УФ-лампу на 10 минут, а затем на 10 — 15 минут в хлорирующую камеру. После удаления избытка хлора пластинку обрабатывают из пульверизатора о-толидином.
II. Пластинку обрабатывают бромфеноловым синим, подсушивают и опрыскивают 2% раствором лимонной кислоты.
Пивот проявляется в виде синего пятна на желтоватом фоне. Окраска сохраняется в течение 5 — 10 минут.
R_{f} препарата 0,35. Если температура будет ниже 20 °C, то значение R_{f} может быть ниже указанной величины.
2.8. Обработка результатов анализа
Количественное определение содержания имазетапира в пробе проводят путем сравнения площади интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартных растворов.
Содержание имазетапира в анализируемой пробе (X) мг/кг вычисляют по формуле:
X = \frac{C \cdot V}{V_{1} \cdot P} , мг/кг
C — содержание имазетапира, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;
V_{1} — объем аликвоты, нанесенной на пластинку, мл;
P — навеска анализируемой пробы в г.
3. ТРЕБОВАНИЯ ТЕХНИКИ БЕЗОПАСНОСТИ
Соблюдать требования техники безопасности, принятые для работы с растворителями, легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.