Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах

(утв. Минздравом СССР 27.06.1990 № 5177-90)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["Методические рекомендации по обнаружению... (от 23.01.1984 N 2964-84)"]:::rst
  n1["Методические указания по обнаружению... (от 10.10.1985 N 3940-85)"]:::rst
  click n1 "https://bukva.ai/docs/3940-85" "Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерне и зернопродуктах (утв. Минздравом СССР 10.10.1985 N 3940-85)"
  n2["Методические указания по обнаружению... (от 27.06.1990 N 5177-90)"]:::doc
  click n2 "https://bukva.ai/docs/5177-90" "Методические указания по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) и зеараленона в зерне и зернопродуктах (утв. Минздравом СССР 27.06.1990"
  n0 --> n2
  n1 --> n2
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ ДЕЗОКСИНИВАЛЕНОЛА (ВОМИТОКСИНА) И ЗЕАРАЛЕНОНА В ЗЕРНЕ И ЗЕРНОПРОДУКТАХ

Методические указания предназначены для лабораторий санитарно-эпидемиологических станций и НИИ гигиенического профиля при контроле за загрязнением зерна и зернопродуктов фузариотоксинами: дезоксиниваленолом (вомитоксином) и зеараленоном вместо действующих ранее «Методических указаний по обнаружению, идентификации и определению содержания дезоксиниваленола (вомитоксина) в зерне и зернопродуктах» № 3940-85 и «Методических рекомендаций по обнаружению, идентификации и определению содержания зеараленона в пищевых продуктах» № 2964-84.

Разработаны в отделе гигиены питания Института питания АМН СССР.

Дезоксиниваленол и зеараленон являются микотоксинами, наиболее часто продуцируемыми широко распространенными микроскопическими грибами рода Fusarium (Fusarium graminearum, F. culmorum, F. roseum и др.), поражающим зерновые в ряде регионов страны.

Дезоксиниваленол (вомитоксин) — 3,7,15-тригидрокси-12,13-эпокси-трихотец-9-ен-8-он, относится к группе трихотеценовых микотоксинов, вызывающих тяжелые алиментарные микотоксикозы у животных, которые характеризуются геморрагическим синдромом, отказом от корма, рвотой, поражением кроветворных и иммунокомпетентных органов.

В СССР установлена временная ПДК на содержание дезоксиниваленола в продовольственном заготавливаемом зерне на уровне 1,0 мг/кг — в сильных и твердых сортах пшеницы и на уровне 0,5 мг/кг — в остальной пшенице («Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов», Минздрав СССР, 1989), в переработанном зерне — на уровне не выше 0,5 мг/кг.

Дезоксиниваленол — бесцветное кристаллическое вещество с молекулярной массой 296 а.е.м., имеет слабо выраженный максимум поглощения УФ-света при длине волны 219 нм (е 4500 в метаноле), не обладает флуоресценцией. Температура плавления 151 — 153 °C. Дезоксиниваленол хорошо растворим в воде, спиртах, ацетонитриле, этилацетате, нерастворим в гексане и бензоле. Обнаружение дезоксиниваленола при тонкослойной хроматографии (ТСХ) производят по специфической флуоресценции после обработки раствором хлорида алюминия.

Зеараленон — лактон 6-(10-окси-6-кето-транс-1-ундеценил)-b-резорциловой кислоты (F-2-токсин), обладает выраженным эстрогенным действием на большинство видов сельскохозяйственных животных, а также на приматов, вызывая нарушения функций воспроизводства.

В СССР установлена ПДК на содержание зеараленона в зерновых на уровне 1 мг/кг.

Зеараленон — бесцветное кристаллическое вещество, плохо растворим в воде и гексане, хорошо растворим в низших спиртах, ацетонитриле, ацетоне, бензоле, с молекулярной массой 318 а.е.м. и максимумами поглощения в УФ-спектре (в этаноле) при 236 нм (е 29700), 274 нм (е 13909) и 316 нм (е 6020). Зеараленон обладает сине-голубой флуоресценцией низкой интенсивности при возбуждении длинноволновым (360 нм) УФ-светом, которая повышается при возбуждении коротковолновым УФ-светом (254 нм). Интенсивность флуоресценции усиливается после обработки зеараленона раствором хлористого алюминия в этиловом спирте. Более высокая чувствительность обнаружения зеараленона при ТСХ достигается при использовании реакции азосочетания с растворами стабильных диазониевых солей: прочной синей B-соли или прочной фиолетовой B-соли, в результате которой образуется интенсивно окрашенные продукты.

Предлагаемый метод определения дезоксиниваленола и зеараленона в одном образце зерна и зернопродуктов включает следующие этапы:

• экстракцию дезоксиниваленола и зеараленона из образца смесью ацетонитрил — вода (84:16);
• очистку одной части экстракта на колонке со смесью угля с оксидом алюминия;
• определение дезоксиниваленола в очищенном экстракте с помощью ТСХ с флуориметрическим обнаружением после обработки пластинок хлоридом алюминия или с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на силикагеле с УФ-детектором при длине волны 224 нм;
• обезжиривание второй части экстракта гексаном;
• разбавление экстракта водой и переэкстракция зеараленона в бензол;
• определение зеараленона с помощью одномерной или двумерной ТСХ с флуориметрическим обнаружением после обработки пластинок хлоридом алюминия или с помощью нормальнофазовой ВЭЖХ с УФ-детектором при длине волны 283 нм или флуориметрическим детектором (длина волны возбуждающего света 293 нм, эмиссионного света — от 420 нм).

Продолжительность анализа 3,5 — 4 часа.

Предел обнаружения метода:

    для дезоксиниваленола   0,2 мг/кг (по ТСХ); 0,05 мг/кг (по ВЭЖХ)
    для зеараленона         0,1 мг/кг (по ТСХ); 0,005 мг/кг (по ВЭЖХ).

Относительное стандартное отклонение:

    для дезоксиниваленола   0,25 - 0,30 (по ТСХ); 0,05 - 0,09 (по ВЭЖХ)
    для зеараленона         0,40 - 0,60 (по ТСХ); 0,06 - 0,09 (по ВЭЖХ).

Степень извлечения добавленных в пробу фузариотоксинов составляет 80 — 85% для дезоксиниваленола и 85 — 90% для зеараленона.

Оборудование и материалы

1. Аппарат для встряхивания проб типа АВУ-6С по ТУ 64-1-2151-78 или аналогичный.

2. Ротационный испаритель ИР-1М по ТУ 25-11-917-76 (завод «Химлабприбор») с ловушкой или аналогичный испаритель.

3. Мельница лабораторная электрическая ЭМ-3А по ТУ 46-22-236-79 или аналогичная.

4. Прибор для флуоресцентного анализа витаминов в растворе (модель 833) ТУ 64-1-1080-78 или диагностическая лампа ОЛД-41 или «Люминоскоп» ЛПК-1.

5. Жидкостной хроматограф с УФ-детектором с переменной длиной волны (для анализа зеараленона возможно также использование флуориметрического детектора), колонка и предколонка с силикагелем с размером частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки — 4,5 см, внутренний диаметр — 4,6 мм.

6. Микрошприцы МШ-10 на 10 мкл, микрошприцы на 10 и 25 мкл для ВЭЖХ.

7. Стеклянные камеры для ТСХ с притертыми крышками.

8. Пластинки для ТСХ «Силуфол» размером 15 x 15 см или 20 x 20 см, производство ЧСФР.

9. Колбы плоскодонные конические, 250 мл, НШ 29, тип КнКШ 250-29/32, ГОСТ 10394-74.

10. Колбы грушевидные на 100 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

11. Колбы грушевидные на 10 — 20 мл с НШ 14,5, тип ГрКШ-50-14/23 по ГОСТ 10394-74.

12. Колбы мерные на 100 мл, тип 2-100-2 по ГОСТ 1770-74.

13. Цилиндры мерные на 100 мл с притертой пробкой, тип 2-100 по ГОСТ 1770-74.

14. Воронки делительные ВД2-250 по ГОСТ 8613-75.

15. Колонка стеклянная хроматографическая 220 x 15 мм.

16. Распылитель стеклянный с грушей.

17. Стандартные растворы дезоксиниваленола в этилацетате с концентрацией 25 нг/мкл каждый, стандартный раствор зеараленона в бензоле с концентрацией 10 мг/мкл.

18. Ацетонитрил «ч.» по ТУ 6-09-3534-74.

19. Ацетон «ч.д.а.» по ГОСТ 2603-79.

20. Бензол «ч.д.а.» по ГОСТ 5955-75.

21. Гексан «ч.» по ТУ 6-09-3375-78 или гептан «ч.д.а.» по ГОСТ 5.395-70.

22. Изопропиловый спирт (пропанол-2) «х.ч.» по ТУ 6-09-1710-77.

23. Кислота уксусная «ч.д.а.» по ГОСТ 61-75.

24. Кислота муравьиная «ч.» по ГОСТ 5848-73.

25. Метанол «ч.д.а.» по ГОСТ 6995-77.

26. Толуол «ч.д.а.» по ГОСТ 5789-78.

27. Хлороформ для наркоза или по ГОСТ 3610-51.

28. Этанол по ТУ 6-09-1710-77.

29. Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат) «ч.д.а.» по ГОСТ 22300-76.

30. Эфир диэтиловый по ГОСТ 6265-52.

31. Эфир петролейный (т. кип. 40 — 70 °C) по ТУ 6-02-1244-83.

32. Алюминий оксид нейтральный для хроматографии по Брокману, «Реанал» (Венгрия), № 01125 или алюминий оксид для хроматографии по ТУ 6-09-916-75.

33. Алюминий хлористый 6-водный «ч.д.а.» по ГОСТ 3759-75.

34. Натрий сернокислый безводный «ч.д.а.» по ГОСТ 4166-76.

35. Натрий кислый углекислый «ч.д.а.» по ГОСТ 83-79.

36. Натрий хлористый «ос.ч.» по ТУ 6-09-3658-74.

37. Прочный синий В-соль (диазоль синий С) или прочный фиолетовый В-соль для гистологии, «Хемапол», ЧСФР.

38. Уголь активированный Р.72.270.3.

1. Экстракция

При отборе пробы для анализа следует руководствоваться требованиями ГОСТ 13586.3-83 «Зерно. Правила приемки и методы отбора проб». Отобранную пробу измельчают в течение 1 — 2 мин. в лабораторной мельнице или кофемолке. Навеску 25 г измельченного зерна или муки помещают в плоскодонную коническую колбу на 250 мл, добавляют 20 мл воды и затем 105 мл ацетонитрила. Встряхивают на аппарате для встряхивания проб в течение 30 минут. Полученную смесь фильтруют через бумажный складчатый фильтр в мерный цилиндр. Отбирают 25 мл фильтрата для анализа на дезоксиниваленол и 50 мл фильтрата для анализа на зеараленон.

2. Обнаружение, идентификация и определение содержания дезоксиниваленола в экстракте

2.1. Очистка экстракта

В стеклянную хроматографическую колонку на дно помещают кусочек ваты, насыпают 0,75 г порошка активированного угля и сверху — слой 0,75 г оксида алюминия. Над слоем оксида алюминия помещают кусочек ваты. Осторожно помещают в колонку 25 мл экстракта, соответствующие 5 г исходного образца (при анализе кукурузы наливают 15 мл экстракта, соответствующие 3 г исходного образца). Отбирают элюат и, не давая колонке просохнуть, добавляют 10 мл смеси ацетонитрил-вода (84:16). Объединенные элюаты фильтруют через бумажный складчатый фильтр в грушевидную колбу на 50 мл, бумажный фильтр промывают 5 — 10 мл изопропилового спирта в ту же колбу и фильтрат упаривают на ротационном испарителе до объема 5 — 7 мл. Добавляют около 20 мл изопропилового спирта и повторно упаривают на ротационном испарителе досуха. Остаток в колбе после упаривания не должен содержать капель воды. Остаток растворяют в 200 мкл этилацетата и плотно закрывают стеклянной пробкой (раствор A).

2.2. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью одномерной ТСХ

На пластинке «Силуфол» проводят тонкую карандашную линию в 1,5 — 2 см от нижнего края пластинки. На эту линию на расстоянии 2 см друг от друга с помощью микрошприца наносят 2, 5, 10 и 20 мкл раствора A. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 2, 4, 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола (50, 100 и 150 нг дезоксиниваленола). Пластинку помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан-ацетон (3:2) на расстоянии 15 см. Пластинку извлекают из камеры, сушат на воздухе 3 — 4 минуты и опрыскивают 10-процентным раствором хлористого алюминия в этаноле. Пластинку нагревают в сушильном шкафу в течение 5 — 7 минут при 105 °C, затем рассматривают в длинноволновом УФ-свете. Дезоксиниваленол проявляется в виде пятен с синей флуоресценцией с Rf 0,25 — 0,30. Наличие в экстракте пятен, соответствующих по цвету флуоресценции и хроматографической подвижности стандарту дезоксиниваленола, свидетельствует о возможном наличии этого токсина в образце.

Для количественного определения сравнивают интенсивность флуоресценции разных количеств стандартов дезоксиниваленола с интенсивностью флуоресценции их пятен в образце, визуально оценивая количество нг токсинов в нанесенных на пластинку объемах раствора A. Концентрацию дезоксиниваленола в образце рассчитывают по формуле:

                            V  x m
                             1

C = -------------, мг/кг, V x M x 1000 2

где:

V — объем раствора A в мкл (200 мкл); 1

V — объем раствора A, нанесенный на пластинку, в мкл; 2

m — масса дезоксиниваленола (в нг) в V мкл раствора A, оцененная 2 визуальным сравнением со стандартом на ТСХ-пластинке;

M — аликвотная навеска образца, соответствующая раствору A (5 г для пшеницы, 3 г для кукурузы).

    Если  интенсивность  флуоресценции  пятна дезоксиниваленола в экстракте
выше  интенсивности флуоресценции пятна дезоксиниваленола, соответствующего
6  мкл  стандартного раствора, то следует разбавить раствор A этилацетатом,
т.е.  увеличить  объем  V ,  внеся  соответствующие  коррективы в расчетную

                     1

формулу.

Окончательное заключение о наличии и уровне загрязнения образца дезоксиниваленолом принимается только на основе данных двумерной ТСХ.

2.3. Подтверждение наличия и количественное определение дезоксиниваленола с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля. В правом нижнем углу на расстоянии 12 мм от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора A. В левом нижнем углу пластинки наносят 2, 4 и 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола, 2 и 5 мкл раствора A. В верхнем правом углу пластинки наносят 2, 4 и 6 мкл стандартного раствора дезоксиниваленола, 10 и 20 мкл раствора A. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан-ацетон (3:2) и элюируют ее в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 4 см от верхнего края, пластинку извлекают из камеры и сушат на воздухе. Затем проводят элюирование пластинки во 2-ом направлении смесью эфир-гексан-изопропиловый спирт-вода (77:18:4,5:0,5). После достижения фронтом растворителя карандашной линии, проведенной в 4,5 см от верхнего края пластинки, ее извлекают из камеры и сушат на воздухе. Обнаружение и количественное определение проводят аналогично п. 2.2.

2.4. Обнаружение и количественное определение дезоксиниваленола с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан-изопропанол-вода (85:25:1,5), скорость подвижной фазы 1,0 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанные растворители, фильтруя их через бумажный складчатый фильтр перед использованием. УФ-детектор устанавливается на длину волны 224 нм, шкала чувствительности 0,005 Е.О.П. Входное напряжение самописца 10 мВ.

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят по 2 и 4 мкл стандартных растворов, что соответствует 50 и 100 нг дезоксиниваленола. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных выше условиях ВЭЖХ время удерживания пика дезоксиниваленола составляет от 5 до 6 мин. в зависимости от изменений в составе подвижной фазы.

В инжектор хроматографа вводят 10 мкл раствора A. При наличии пика, совпадающего по времени удерживания с каким-либо стандартом, определяют его высоту (h ). Расчет концентрации дезоксиниваленола в образце проводят по обр формуле:

                             V  x m x h
                              1        обр

C = -------------------, мг/кг,

                          V  x M x 1000 x h
                           2               ст

где:

V — объем раствора A, мкл (200 мкл); 1

V — объем раствора A, внесенный в хроматограф, в мкл (10 мкл); 2

m — масса стандарта дезоксиниваленола, введенная в хроматограф, в нг;

M — аликвотная навеска образца, соответствующая раствору A (5 г для пшеницы, 3 г для кукурузы);

h — высота пика, соответствующая данной массе стандарта, в мм; ст

h — высота пика дезоксиниваленола из образца, в мм. обр

    Если   пик   дезоксиниваленола  в  образце  выходит  за  пределы  шкалы
самописца,   анализ   проводят   повторно   после  разбавления  раствора  A

этилацетатом, т.е. после увеличения объема V . 1

3. Обнаружение, идентификация и определение содержания зеараленона

3.1. Очистка экстракта

В делительную воронку на 500 мл помещают 50 мл фильтрата, добавляют 50 мл гексана (или гептана), насыщенного ацетонитрилом (гексан, насыщенный ацетонитрилом, готовят следующим образом: в делительную воронку на 500 мл помещают 200 мл гексана и 30 мл ацетонитрила, интенсивно встряхивают, и после расслоения жидкостей отделяют верхний слой, содержащий гексан). Встряхивают, после разделения слоев отбрасывают верхний гексановый слой. Нижний ацетонитрильный слой дважды встряхивают с 30 мл гексана, насыщенного ацетонитрилом, каждый раз отбрасывая верхний гексановый слой. К обезжиренному ацетонитрильному экстракту в делительной воронке добавляют 100 мл дистиллированной воды и 50 мл бензола. Встряхивают и после разделения слоев отделяют верхний бензольный слой. Если полного расслоения жидкостей не происходит, добавляют 10 мл насыщенного раствора хлорида натрия и смесь еще раз слегка встряхивают. Водный слой экстрагируют еще дважды 30 мл бензола, бензольные слои объединяют и сушат безводным сульфатом натрия. После фильтрования упаривают в грушевидной колбе на 100 мл на ротационном испарителе при температуре водяной бани не выше 45 °C. Сульфат натрия промывают 10 мл бензола в ту же грушевидную колбу и упаривают раствор досуха. Остаток растворяют в 500 мкл бензола — раствор B.

3.2. Обнаружение и идентификация зеараленона с помощью одномерной ТСХ

На пластинке «Силуфол» проводят тонкую карандашную линию на расстоянии 12 мм от нижнего края пластинки. На эту линию на расстоянии 2 см друг от друга наносят с помощью микрошприца 5 и 10 мкл раствора B. Между пятнами экстракта на расстоянии 1 см от них на ту же линию наносят 5, 10 и 20 мкл стандартного раствора зеараленона (50, 100 и 200 нг зеараленона соответственно). Аналогично готовят вторую пластинку «Силуфол». Обе пластинки помещают в камеру для ТСХ и элюируют в системе гексан-ацетон (7:3). Пластинки извлекают, сушат на воздухе 3 — 4 мин.

Для обнаружения пятен зеараленона на 1-ой пластинке используют опрыскивание 10-процентным раствором хлорида алюминия в этиловом спирте с последующим нагреванием в сушильном шкафу при температуре 100 — 105 °C в течение 10 минут. Обнаружение на пластинке пятен, соответствующих по цвету флуоресценции (синий) и хроматографической подвижности пятнам стандартов зеараленона, свидетельствует о возможном наличии зеараленона в образце.

Для подтверждения наличия зеараленона 2-ую ТСХ-пластинку опрыскивают 1-процентным раствором прочной синей В-соли или прочной фиолетовой В-соли в дистиллированной воде, затем пластинку немедленно опрыскивают 5-процентным раствором углекислого натрия до появления красно-бордовой окраски пятен стандарта зеараленона. Обнаружение на пластинке пятна, соответствующего по цвету и хроматографической подвижности стандартам зеараленона, подтверждает наличие зеараленона в образце.

3.3. Количественное определение зеараленона с помощью двумерной ТСХ

Пластинку «Силуфол» размечают тонкими карандашными линиями, не повреждая слоя силикагеля. В правом нижнем углу на расстоянии 12 мм от краев пластинки наносят с помощью микрошприца 20 мкл раствора B. В правом верхнем углу наносят 3 и 7 мкл стандартного раствора зеараленона, 10 и 20 мкл раствора B; в левом нижнем углу наносят 5 и 10 мкл раствора зеараленона, 2 и 5 мкл раствора B. Пластинку помещают в камеру для ТСХ со смесью гексан-ацетон (7:3) и элюируют в 1-ом направлении до достижения фронтом растворителя тонкой карандашной линии, проведенной в 4,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают и сушат на воздухе 5 мин. Затем проводят хроматографию во 2-ом направлении в системе толуол-этилацетат-хлороформ-85% муравьиная кислота (45:25:25:5) до достижения карандашной линии, проведенной в 4,5 см от верхнего края пластинки. Пластинку извлекают из камеры, сушат и обнаруживают пятна по флуоресценции после обработки раствором хлорида алюминия, как описано в п. 3.2. Сравнивая интенсивность окраски разных количеств стандарта зеараленона с интенсивностью окраски пятна зеараленона в экстракте (раствор B), определяют количество нг зеараленона в экстракте.

Содержание зеараленона в образце рассчитывают по формуле:

                            V  x V  x m
                             1    3

C = ------------------, мг/кг,

                         V  x V  x M x 1000
                          2    4

где:

C — концентрация зеараленона в образце в мг/кг;

V — объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции в мл (125 мл); 1

V — объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для анализа, в мл 2 (50 мл);

V — объем очищенного экстракта перед ТСХ (раствор B) в мкл (500 мкл); 3

V — объем очищенного экстракта (раствор B), наносимый на пластинку, в 4 мкл (20 мкл);

M — навеска образца, взятая для анализа, в г (25 г);

m — масса зеараленона (в нг), в V мкл очищенного экстракта, оцененная 4

по  ТСХ.
    При  приведенных  в  скобках  объемах  и  навесках  формула  содержания

зеараленона выражается следующим образом:

C = 0,0025 x m, мг/кг.

Если интенсивность окраски пятна зеараленона в экстракте выше интенсивности окраски пятна стандарта, соответствующего 20 мкл стандартного раствора (200 нг зеараленона), то на пластинку следует нанести либо меньшее количество экстракта (уменьшить объем V ), либо разбавить раствор B 4 бензолом (увеличить объем V ), внеся соответствующие коррективы в расчетную 3 формулу.

3.4. Обнаружение и количественное определение зеараленона с помощью ВЭЖХ

Условия ВЭЖХ: подвижная фаза гексан-эфир-уксусная кислота (65:35:1), скорость подвижной фазы 1,5 мл/мин. или петролейный эфир (т. кип. 40 — 70 °C)-эфир-уксусная кислота (50:50:1), скорость подвижной фазы 2 мл/мин. Рекомендуется использовать перегнанный гексан или петролейный эфир и эфир, профильтрованный через слой оксида алюминия (5 см). УФ-детектор устанавливается на длину волны 283 мн, шкала чувствительности 0,005 Е.О.П. Шкала самописца 10 мВ. Если используется флуориметрический детектор, то длина волны на линии возбуждения устанавливается около 283 нм, а на линии эмиссии — фильтр от 420 нм (или 440 нм в случае монохроматора на линии эмиссии).

Для калибровки прибора в инжектор с помощью микрошприца вводят 2 и 5 мкл стандартного раствора, что соответствует 20 и 50 нг зеараленона. Для каждого количества стандарта определяют высоту пика на хроматограмме. При описанных условиях ВЭЖХ время выхода пика зеараленона составляет 5 — 7 мин.

    В  инжектор  хроматографа  вводят  10 мкл раствора B. При наличии пика,
совпадающего  по  времени  выхода  со  стандартом,  определяют  его  высоту
(h   ).

обр

Расчет концентрации зеараленона в образце проводят по формуле:

                           V  x V  x m x h
                            1    3        ст

C = -------------------------, мг/кг,

                       V  x V  x M x h    x 1000
                        2    4        обр

где:

C — концентрация зеараленона в образце в мг/кг;

V — объем водно-ацетонитрильной смеси для экстракции в мл (125 мл); 1

V — объем водно-ацетонитрильного фильтрата, взятый для анализа, в мл 2 (50 мл);

V — объем очищенного экстракта перед ВЭЖХ (раствор B) в мкл (500 мкл); 3

V — объем очищенного экстракта (раствор B), внесенный в хроматограф, в 4 мкл (20 мкл);

M — навеска образца, взятая для анализа, в г (25 г);

m — масса стандарта зеараленона, введенная в хроматограф, в нг;

h — высота пика, соответствующая данной массе стандарта, мм; ст

h — высота пика зеараленона из образца в мм. обр

    Если  пик  зеараленона  в  образце  выходит за пределы шкалы самописца,
анализ  проводят повторно после разбавления раствора B бензолом, т.е. после

увеличения объема V . 3

При ВЭЖХ зеараленона чувствительность УФ- и флуориметрического детектора примерно одинаковы. Преимуществом флуориметрического детектора является его селективность (меньшее количество посторонних пиков на хроматограмме).