Методические указания по определению изофена и его метаболита диносеба в хлопковом масле методом тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 5015-89)
8 июня 1989 г. № 5015-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ИЗОФЕНА И ЕГО МЕТАБОЛИТА ДИНОСЕБА В ХЛОПКОВОМ МАСЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны Ф.Р. Мельцер, Т.В. Алдошиной, К.Ф. Новиковой (ВНИИХСЗР).
Дополнение к № 4657-88 от 14.07.88.
Краткая характеристика препаратов приведена в Методических указаниях № 4709-88.
Принцип метода. Метод основан на извлечении изофена и диносеба из масла подкисленной смесью ацетона с водой (4:1), перераспределении пестицидов в хлороформ, отделении диносеба экстракцией 0,5 н NaOH. Хлороформную фракцию, содержащую изофен, очищают хроматографией на колонке с оксидом алюминия и определяют методом ТСХ. Щелочной экстракт, содержащий диносеб, подкисляют хлороводородной кислотой, экстрагируют диносеб хлороформом и после сернокислотной очистки экстракта определяют методом ТСХ.
Метрологическая характеристика метода. Нижний предел обнаружения в хроматографируемой пробе изофена — 0,5 мкг, диносеба — 0,2 мкг. Нижний предел определения в масле 0,05 мг/кг. Среднее значение определения заданных количеств в пробе (при n = 15) изофена — 75 +/- 9%, диносеба — 75 +/- 6%. Доверительный интервал среднего определения (p = 0,95, n = 5) изофена — +/- 11%, диносеба — +/- 7%.
Избирательность метода. Метод селективен. Другие пестициды определению не мешают. Избирательность метода обеспечивается сочетанием трех систем подвижных растворителей.
Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. Хлороформ ч.д.а. Бензол ч.д.а., свежеперегнанный. Гексан ч.д.а., свежеперегнанный. Этилацетат х.ч. Спирт этиловый ректиф. Уксусная кислота ч.д.а., ледяная. н-Гептан эталонный. Кислота серная особой чистоты, концентрированная. Сульфат натрия безводный х.ч. Кислота хлороводородная особой чистоты, концентрированная. Смесь ацетона с водой (4:1), подкисленная до pH 1. На 1 л смеси добавляют 1 мл концентрированной HCl. Гидроксид натрия х.ч., 0,5 н раствор. Гидроксид натрия ч., 6-процентный раствор в этиловом спирте. Хлорид натрия х.ч. Оксид алюминия II степени активности по Брокману, нейтральный для хроматографии. Обезжиренная вата (вату последовательно промывают ацетоном, гексаном и диэтиловым эфиром, высушивают и хранят в склянке с притертой пробкой). Пластинки «Силуфол». Стандартные растворы диносеба и изофена в гексане с содержанием 100 мкг/мл (раствор № 1), 10 мкг/мл (раствор № 2). Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес.
Приборы и посуда. Хроматографические камеры с пришлифованными крышками. Ротационный вакуумный испаритель. Стеклянная хроматографическая колонка с краном и оттянутым носиком длиной 10 см с внутренним диаметром 1 см. Делительные воронки на 250 и 100 мл. Колбы: плоскодонные вместимостью 250 мл; грушевидные вместимостью 5 мл; мерные на 100 мл. Мерные цилиндры на 1000 и 100 мл. Пипетки на 10 и 1 мл с делениями. Пульверизаторы стеклянные.
Подготовка к определению. Хроматографические камеры заполняют системой подвижных растворителей гексан-ацетон (4:1), н-гептан-этилацетат (4:1) или гексан-ацетон-ледяная уксусная кислота (20:50:1) за 1 ч до начала хроматографирования. Уровень подвижного растворителя в камере должен находиться на 0,7 — 1,0 см выше уровня дна.
В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию оксида алюминия в гексане (при открытом кране колонки). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают стечь избытку растворителя, оставляя небольшой слой (0,2 — 0,3 см) над поверхностью оксида алюминия. Затем кран закрывают. Колонка готова к работе.
Ход анализа. Экстракция. Навеску хлопкового масла (10 г) помещают в делительную воронку на 100 мл и экстрагируют изофен и диносеб подкисленной смесью ацетона с водой (4:1) четыре раза порциями по 25 мл. К объединенному в делительной воронке на 250 мл экстракту добавляют воду до общего объема 150 мл (по предварительной отметке на воронке) и трижды экстрагируют изофен и диносеб хлороформом порциями по 50 мл. Из хлороформного экстракта, объединенного в делительной воронке вместимостью 250 мл, диносеб экстрагируют трижды 0,5 н NaOH порциями по 30 мл. Изофен остается в хлороформе. Далее изофен и диносеб определяют раздельно.
Очистка экстракта при определении изофена. Хлороформный экстракт трижды обрабатывают концентрированной серной кислотой порциями по 10 мл. При каждой экстракции воронку встряхивают не дольше 10 с. Хлороформный слой несколько раз промывают дистиллированной водой порциями по 15 мл до нейтральной реакции промывных вод. Хлороформный экстракт пропускают через слой безводного сульфата натрия (10 — 12 г), помещенный в химической воронке на небольшой тампон из обезжиренной ваты. Сульфат натрия промывают 10 мл дистиллированной воды и концентрируют фильтрат с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема около 1 мл.
Остаток переносят на подготовленную хроматографическую колонку с Al O . 2 3 Стенки колбы тщательно обмывают гексаном порциями по 2 — 3 мл (общим объемом 20 — 40 мл) и каждую порцию переносят на колонку при открытом кране после прохождения через нее очередной порции растворителя. Нельзя допускать
осушения колонки! Над сорбентом всегда должен оставаться небольшой слой растворителя! Гексановый элюат отбрасывают и элюируют изофен из колонки 50 мл смеси гексана с бензолом (4:1) со скоростью 1 капля в секунду в грушевидную колбу вместимостью 50 мл. Из элюата с помощью ротационного
вакуумного испарителя отгоняют растворитель до объема примерно 0,05 мл.
Очистка экстракта при определении диносеба. Щелочной экстракт, содержащий диносеб, переносят в делительную воронку вместимостью 100 мл, подкисляют 1,5 мл концентрированной HCl (до pH 3) и трижды экстрагируют диносеб хлороформом порциями по 10 мл. Объединенный хлороформный экстракт переносят в делительную воронку на 100 мл и очищают его, дважды обрабатывая концентрированной серной кислотой порциями по 10 мл. Хлороформный слой несколько раз промывают дистиллированной водой до нейтральной реакции промывных вод (200 мл), затем сушат его над безводным сульфатом натрия (6 г), фильтруют в грушевидную колбу вместимостью 50 мл и концентрируют раствор с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема около 0,05 мл. Далее определение диносеба проводят методом ТСХ.
Определение изофена и диносеба методом ТСХ. Для определения изофена и диносеба сконцентрированные до объема около 0,05 мл экстракты количественно при помощи стеклянного капилляра переносят на пластинку «Силуфол». Справа и слева от рабочей пробы наносят серию стандартных растворов изофена или диносеба с содержанием первого 0,5; 1; 2; 3 мкг, второго — 0,2; 0,3; ...; 2 мкг. Растворы готовят следующим образом: из стандартного раствора № 2 изофена или диносеба с содержанием 10 мкг/мл микрошприцем на 100 мкл или микропипеткой на 0,1 мл в пробирки вносят соответственно 50; 100; 200; 300 мкл изофена или 20; 30; 50; ...; 200 мкл диносеба и концентрируют растворы на горячей водяной бане до объема около 0,05 мл.
Пластинку помещают в хроматографическую камеру и развивают хроматограммы в одной из систем подвижных растворителей: гексан-ацетон
(4:1), н-гептан-этилацетат (4:1) или гексан-ацетон-ледяная уксусная кислота
(20:5:1). Последняя система - основная, первые две - альтернативные. После окончания хроматографирования пластинку сушат на воздухе, в последнем случае до полного испарения уксусной кислоты, а затем обрабатывают 6-процентным КОН в этиловом спирте. Диносеб проявляется сразу же в виде желтых пятен на белом фоне с величиной R 0,65 +/- 0,05 в первой системе,
f
0,60 +/- 0,05 — во второй и 0,74 +/- 0,05 — в третьей. Изофен на пластинках проявляется после нагревания хроматограмм в сушильном шкафу при температуре
80 - 90 °C в течение 5 - 7 мин. в виде желтых пятен на белом фоне с величиной R соответственно 0,62 +/- 0,05; 0,50 +/- 0,05 и 0,53 +/- 0,05
f
в первой, второй и третьей системе растворителей. Цвет пятен стабилен в течение нескольких лет.
Обработка результатов анализа. Количественное определение изофена или диносеба в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартных растворов. При большом содержании изофена или диносеба конечный раствор концентрируют досуха и пипеткой добавляют известное количество гексана. На пластинку наносят аликвотную часть раствора.
Содержание изофена или диносеба в анализируемой пробе (X, мг/кг) вычисляют по формуле:
AV
где:
A — количество изофена или диносеба, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;
V — общий объем рабочего раствора, мл;
V — объем аликвоты, нанесенной на хроматографическую пластинку, мл a (при нанесении всей пробы V = V); a
P — навеска анализируемой пробы, мг.
Требования безопасности. Соблюдают правила безопасности, принятые для работы с пестицидами и легковоспламеняющимися жидкостями.