Методические рекомендации по обнаружению, идентификации и определению остаточных количеств левомицетина в продуктах животного происхождения
(утв. Минздравом БССР 20.05.1991 № 4-18/1890)
20 мая 1991 г. № 4-18/1890
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Разработаны Институтом питания АМН СССР, кафедрой общей гигиены Белорусского Государственного института усовершенствования врачей Минздрава СССР.
Предназначены для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах санитарно-эпидемиологическими станциями, а также заводскими и сельскохозяйственными лабораториями.
Введение
Среди ряда посторонних веществ, которые могут загрязнять различные пищевые продукты, важное место занимают лекарственные средства. Наиболее часто пищевые продукты загрязняются остатками лекарственных препаратов, применяемых для профилактики и лечения животных и птицы, ускорения их роста, улучшения качества и сохранности кормов и т.п. Номенклатура лекарств, используемых в животноводстве и ветеринарии, постоянно расширяется.
К сильнодействующим лекарственным препаратам, используемым в ветеринарии и животноводстве, относятся антибиотики. Известно большое число антибиотиков, природных и полусинтетических, обладающих различными свойствами, механизмом и спектром действия, распределением в организме животного, характером метаболизма и др.
Широкое применение антибиотиков в ветеринарии и животноводстве создает определенные проблемы с точки зрения гигиены питания, требует проведения соответствующих мероприятий для снижения уровня загрязненности продуктов этими веществами, а также организации контроля за остаточными количествами препаратов в продуктах животноводства.
При систематическом поступлении в организм человека с пищей антибиотики могут вызывать различные аллергические реакции, нарушение обмена веществ, дисбактериоз, подавлять активность некоторых ферментов, изменять микрофлору, способствовать распространению устойчивых форм микроорганизмов и т.д. Следует учитывать возможность отрицательного влияния антибиотиков в сырье для пищевой промышленности на проведение ряда технологических процессов по переработке мяса, рыбы, молока и других продуктов, кроме того, наличие антибиотиков может затруднять бактериологические исследования качества продуктов животного происхождения.
В мясе, печени, почках, молоке, твороге, сметане, сыре, яйце, рыбе, меде и других продуктах довольно часто обнаруживают остаточные количества антибиотиков, что предопределяет необходимость проведения выборочного, периодического или систематического их контроля. Некоторые из перечисленных продуктов являются диетическими (молоко, творог, сметана и др.), поэтому отсутствие в них токсических и лекарственных соединений особенно важно.
В СССР остаточные количества ряда антибиотиков регламентированы предельно допустимыми концентрациями (ПДК) <*>. К ним относятся тетрациклины (0,01 ед./г), пенициллины (0,01 ед./г) и стрептомицин (0,5 ед./г).
<*> Медико-биологические требования и санитарные нормы качества продовольственного сырья и пищевых продуктов. М., Издательство стандартов, 1990 г.
Для контроля уровней этих антибиотиков Минздравом СССР утверждены микробиологические методы определения, которые позволяют обнаруживать и идентифицировать группы указанных веществ на уровне ПДК.
Левомицетин (хлормицетин, хлорамфеникол) — эффективный синтетический антибиотик широкого спектра действия, запрещен к использованию в животноводстве и ветеринарии для лечения скота, птицы, мясо, молоко и яйца которых предназначены для питания людей. Это связано с токсичностью левомицетина, проявляющейся в аллергических реакциях, поражении кроветворных органов и др. Однако относительная дешевизна этого препарата и высокая антибактериальная активность приводят к нелегальному использованию его в относительно высоких масштабах.
Микробиологические методы неэффективны для анализа этого антибиотика в пищевых продуктах, т.к. найденные тест-культуры малочувствительны и не позволяют осуществлять контроль за остаточными количествами левомицетина хотя бы на уровне ПДК других антибиотиков, разрешенных к применению.
В связи с этим за рубежом наиболее часто применяют химические методы определения левомицетина в пищевых продуктах с использованием хроматографического разделения.
В настоящих Методических рекомендациях впервые в СССР предпринята попытка применения для контроля остаточных количеств левомицетина в пищевых продуктах простого химического метода анализа, основанного на извлечении антибиотика экстракцией органическим растворителем, концентрировании экстракта, отделении левомицетина в тонком слое силикагеля от коэкстрактивных веществ и определении его после восстановления в виде производного с n-деметиламинобензальдегидом.
Доступность реактивов и оборудования позволяет рекомендовать этот метод для серийных анализов пищевых продуктов в условиях санэпидстанций, заводских и сельскохозяйственных лабораторий.
Предел обнаружения левомицетина на хроматографической пластинке 5 — 10 нг в зоне. Относительное стандартное отклонение при визуальном определении не превышает 0,4, при спектрофотометрическом — 0,2. Метод позволяет проводить анализ левомицетина при содержании его 0,05 мг/кг продукта и выше.
Метод состоит из следующих основных стадий:
2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрированного экстракта.
3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте.
4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе.
5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте.
Аппаратура, материалы и реактивы
Спектрофотометр СФ-26 или аналог
Центрифуга настольная по <...> 375-4261 или аналог
Ротационный испаритель с крышкой по ТУ 25-11-917
Баня масляная или глицериновая
Камера для тонкослойной хроматографии с притертой крышкой, например стеклянный четырехгранный сосуд 195 x 195 x 200 мм завода «Дружная горка».
Пластины для тонкослойной хроматографии «Силуфол» размером 15 x 15 см, ЧСФР или Сорбфил 100 x 100 (г. Краснодар) ТУ 26-11-17-89
Весы технические по ГОСТ 24104
Весы аналитические по ГОСТ 24104
Карандаш графитовый М или аналог
Цилиндры мерные вместимостью 25 и 100 мл по ГОСТ 1770
Колбы плоскодонные на 250 и 500 мл с НШ № 14,5 по ТУ 48-52
Колбы мерные на 25 мл по ГОСТ 1770
Пипетки на 5 и 10 мл по ГОСТ 20292
Колбы для упаривания на <...> мл с НШ № 14,5 по ГОСТ 10394
Натрий сернокислый, безводный по ГОСТ 4166
Серная кислота по ГОСТ 14262 <...> 1 н
Натрий хлористый по ГОСТ <...> насыщенный раствор в воде
Натрий углекислый по ГОСТ <...> 2% водный раствор
Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-87
Петролейный эфир, фракции <...>
бета-глукуронидаза, водный раствор 1 мг/мл
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Кислота соляная, конц. по ГОСТ 3118
Хлорид олова (II), восстанавливающий реактив: 3 мл 15% раствора SnCl 2
(в воде) + 15 мл HCl + 180 мл H O
конц. 2
1. Отбор и подготовка проб
Способ отбора и подготовки проб должен быть указан в нормативно-технической документации на конкретную продукцию.
2. Извлечение левомицетина из пищевых продуктов и концентрирование экстракта
Мясо <*>. 10 +/- 0,1 г гомогенизируют с 15 мл 0,025 М фосфатного буфера, pH 6,88 (0,34 г KH PO и 0,36 г Na HPO растворяют в 100 мл 2 4 2 4 дистиллированной воды), добавляли 200 мкл водного раствора бета-глукуронидазы и инкубировали 1,5 часа при 37 °С. Гомогенат экстрагировали 3 x 30 мл этилацетата, при необходимости применяя для расслоения суспензии центрифугирование 5 - 10 мин. при 4000 об./мин.
Этилацетатный слой объединяли. --------------------------------
<*> Аналогично извлекали левомицетин из мясных продуктов, органов и тканей животных.
Молоко <**>. 25 +/- 0,1 мл насыщают 10 г Na SO , приливают 10 мл 2 4 этилацетата и 5 мл 1 н H SO , интенсивно встряхивают 1 - 2 мин. Для 2 4 расслоения эмульсии применяют центрифугирование 5 - 10 мин. при 4000
об./мин. Этилацетат декантируют, а супернатант экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. --------------------------------
<**> Аналогично извлекали левомицетин из кефира, ряженки, йогуртов.
Яйцо <***>. 10 +/- 0,1 г гомогената яйца перетирают с 5 г Na SO , 2 4
приливают 40 мл этилацетата и 5 мл 1 н H SO , перемешивают и центрифугируют
2 4 5 - 10 мин. при 4000 об./мин. Этилацетатный слой декантируют, а водную часть экстрагируют последовательно 30 и 20 мл этилацетата, при необходимости применяя центрифугирование для расслоения. Объединенные этилацетатные экстракты из продуктов промывают последовательно 10 мл 2%
раствора Na CO , насыщенного NaCl, и 10 мл насыщенного раствора NaCl. 2 3 ----------------------------
<***> Яичный порошок предварительно разводят водой до консистенции жидкой сметаны.
Органический слой отбирают и упаривают на ротационном испарителе при температуре <= 50 °С до минимального объема, отдувают азотом до исчезновения запаха этилацетата, добавляют 3 мл смеси ацетонитрил - вода 1:4 и экстрагируют 3 x 5 мл петролейного эфира. Петролейный эфир отбрасывают и извлекают левомицетин этилацетатом (3 x 5 мл). Этилацетатный экстракт сушат над Na SO (1 г), декантируют, промывают 3 мл этилацетата 2 4 сульфат натрия, объединяют его с экстрактом и упаривают на ротационном испарителе при температуре <= 50 °С досуха. Остаток растворяют в 200 мкл
метанола.
3. Хроматографическое разделение, идентификация и ориентировочная оценка концентрации левомицетина в экстракте
3.1. Приготовление стандартных растворов
Отвешивают 25 мг левомицетина, помещают в мерную колбу на 25 мл и растворяют в метаноле, концентрация левомицетина — 1 мг/мл. 0,25 мл полученного раствора помещают в мерную колбу на 25 мл и разбавляют метанолом. Концентрация левомицетина в стандартном растворе 10 нг/мкл.
При анализе сметаны ее разбавляют в 2,5 — 5 раз в зависимости от жирности. Сыры и творог гомогенизируют с водой до получения гомогенной массы.
3.2. Хроматографическое разделение
На пластинку для тонкослойной хроматографии наносят (рис. а — рисунки здесь и далее не приводятся): в точки 1, 3 и 5 соответственно 1, 2 и 4 мкл раствора стандарта, а в точки 2 и 4 соответственно 3 и 10 мкл концентрированного экстракта.
Пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ - метанол 10:1. По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl в
2
HCl, оставляют на 15 мин. и опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и R , соответствующих пятнам стандарта,
f
свидетельствует о возможном присутствии левомицетина в продукте. Сравнивая интенсивность окраски пятен стандартов и опытной пробы, ориентировочно
оценивают содержание левомицетина в экстракте.
4. Подтверждение наличия левомицетина в пробе
Аликвотную часть экстракта (50 - 100 мкл) упаривают досуха, добавляют 150 мкл 10% раствора HCl, греют на масляной бане при температуре 98 °С в
течение 30 мин., отдувают досуха азотом и приливают 200 мкл 2% метанольного раствора № CO .
2 3 На хроматографическую пластинку наносят 5 - 10 мкл полученной пробы и
соответствующее количество стандарта левомицетина (с учетом предварительной
оценки содержания левомицетина в экстракте); пластинку помещают в камеру для ТСХ и хроматографируют в системе растворителей хлороформ - метанол -
уксусная кислота — вода 12:5:4:2.
По достижении фронтом элюента верхнего края пластинки ее вынимают, сушат, опрыскивают раствором SnCl в HCl, оставляют на 15 мин. Вновь
2
опрыскивают раствором n-диметиламинобензальдегида. Появление желтых пятен на хроматографической пластинке по оттенку и R , соответствующих пятнам
f
стандарта, подтверждает наличие левомицетина в продукте.
5. Количественное определение и расчет содержания левомицетина в продукте
При необходимости точного количественного определения левомицетина в пищевом продукте на хроматографическую пластинку наносят в несколько точек,
близко расположенных друг к другу, аликвотную часть экстракта и таким же образом раствор стандарта так, чтобы количество левомицетина в нем было близко к установленному в пробе при ориентировочной визуальной оценке.
Пластинку хроматографируют и опрыскивают как в п. 3.2. Вырезают зоны левомицетина в опытной пробе, стандарте и соответствующую по R и площади f
зону на пластинке, служащую контролем (рис. б). Зоны элюируют 3 x 1 мл метанола, метанол упаривают досуха, приливают 200 мкл 5% раствора SnCl в
2
5% HCl, греют при температуре 98 °С в течение 1 часа; пробы охлаждают, добавляют по 2 мл 1% раствора n-диметиламинобензальдегида в метаноле, 1 мл
метанола и измеряют оптическую плотность полученных растворов опытной пробы и стандарта относительно контрольной пробы на спектрофотометре в кюветах с l = 10 мм при лямбда = 430 нм.
Рассчитывают содержание левомицетина в пробе продукта по формуле:
ОП x P x V
-3 о
C = 10 x k x ------------- (мг/кг),
ОП x V x M
ст 1
где:
k - коэффициент, учитывающий полноту извлечения левомицетина из пищевого продукта и равный 1,33 для мяса, 1,13 - для молока и 1,25 - для
яиц;
ОП — оптическая плотность элюата опытной пробы, относ. ед.; о
ОП — оптическая плотность элюата стандарта, относ. ед.; ст
P — количество стандарта левомицетина, нанесенного на пластинку, мкг;
V — объем анализируемой пробы, мкл;
V — объем аликвотной части экстракта, взятой для количественного 1 определения, мкл;
M — масса образца пищевого продукта, кг (л).
Интервал определяемых масс левомицетина составляет 0,5 — 6,0 мкг.
Вычисления проводят до второго десятичного знака.
За окончательный результат испытаний принимают среднее арифметическое двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает 20%.
Окончательный результат округляют до первого десятичного знака.
Заключение
В случае обнаружения остаточных количеств левомицетина и подтверждения правильности его идентификации в исследуемых пищевых продуктах вопрос с их реализацией решается согласно «Методическим указаниям по определению остаточных количеств антибиотиков в продуктах животноводства». Москва, Минздрав СССР, ГОЭУ. 1985 г., 34 с. <*>
<*> № 3049-84 от 29 июня 1984 г.
РЕЦЕНЗИЯ НА МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО ОБНАРУЖЕНИЮ, ИДЕНТИФИКАЦИИ И ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ПРОДУКТАХ ЖИВОТНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ
Представленные рекомендации являются первой в СССР попыткой наладить систематический контроль за наличием и уровнями левомицетина в пищевых продуктах. До настоящего времени анализ левомицетина при необходимости выполняли микробиологически. Однако, отсутствие чувствительных тест-культур не позволяет рассчитывать на обнаружение микрограммовых количеств этого антибиотика такими способами. В связи с этим особенно важно создание химического метода контроля остаточных количеств левомицетина, позволяющего с небольшими затратами обнаружить, идентифицировать и количественно определить его содержание. Левомицетин обладает определенной токсичностью и поэтому запрещен к использованию как у нас в стране, так и за рубежом для лечения, например, лактирующих коров или кур-несушек. Анализ литературных данных позволяет сделать заключение, что применение его для лечения сельскохозяйственных животных и птицы — достаточно частое явление, оправданное дешевизной и эффективностью препарата.
Интенсификация сельскохозяйственного производства может стать одной из причин снижения качества пищевых продуктов и, в частности, загрязнения их антибиотиками. Поэтому своевременный и надежный контроль за наличием левомицетина становится важным и актуальным.
Все отмеченное позволяет рекомендовать утвердить разработанные методические рекомендации для внедрения в практику работы учреждений Госсаннадзора. Полученные этим методом материалы целесообразно обобщить для создания общей картины частоты и уровней загрязнения пищевых продуктов БССР левомицетином.