Методические указания по определению остаточных количеств хлорофоса в картофеле хроматоэнзимным методом
(утв. Минздравом СССР 22.05.1985 № 3895-85)
Примечание
Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 № 299).
22 мая 1985 г. № 3895-85
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ХЛОРОФОСА
В КАРТОФЕЛЕ ХРОМАТОЭНЗИМНЫМ МЕТОДОМ
(Дополнение к № 3185-85 от 03.01.85)
Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава СССР, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Агропрома СССР и лабораторий других министерств и ведомств, занимающихся анализом остаточных количеств пестицидов и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.
Срок действия временных методических указаний устанавливается до утверждения гигиенических регламентов.
Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками Госагропрома СССР.
Методические указания согласованы и одобрены отделом перспективного планирования санэпидслужбы ИМПиТМ им. Марциновского Е.И. и Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Минздрава СССР.
1. Краткая характеристика препарата
Хлорофос (трихлорфон, диптерекс, Дилокс) — фосфорорганический инсектицид, является эффективным средством борьбы со многими вредными членистоногими, в том числе с колорадским жуком на картофеле.
Действующее начало препарата — 0,0-диметил-(1-окси-2,2,2-трихлорэтил)фосфонат.
CH O O
3 \||
P-CH-CCl C H Cl O P / | 3 4 18 3 4 CH O OH 3 Мол. масса 257,45. В чистом виде это белое кристаллическое вещество, плавящееся при 82 - 83 °С, температура кипения - 100 °С при 0,1 мм рт. ст. Растворимость
препарата на 100 г: в воде — 15,4 (25 °С), бензоле — 15,2, хлороформе — 75.
Хорошо растворяется в спирте, плохо - в н-гексане, пентане, петролейном эфире. Хлорофос обладает умеренной токсичностью для теплокровных животных. ЛД для мышей и крыс 225 - 1200 мг/кг. МДУ в растительных продуктах 1
50
мг/кг.
2. Методика определения хлорофоса в картофеле
2.1. Основные положения
2.1.1 Принцип метода
Метод основан на извлечении остаточных количеств хлорофоса из картофеля ацетоном с последующим определением ТСХ.
Хлорофос на хроматограммах проявляют биохимической реакцией. В качестве фермента используют эстеразу микробного происхождения. В качестве субстрата эстеразы — хромогенный субстрат — индофенилацетат.
Высокая чувствительность биохимической реакции позволяет исключить стадию очистки экстракта и его концентрирования.
2.1.2 Метрологическая характеристика метода
Предел обнаружения в хроматографируемой пробе - 0,1 нг. Предел обнаружения - 0,1 мг/кг. Процент определения - 70 - 90%. Среднее значение
_ с 80%. Стандартное отклонение +/- 7,5%. Доверительный интервал среднего при
Р = 0,95 и n = 5,80 +/- 7,5%.
2.2. Реактивы и растворы
Реактивы: натрий гидроокись — ОС 18-3, ГОСТ 6-01-302-74;
борная кислота — ОС 12-3, ТУ 6-09-597-77;
Индофенилацетат, хч, ТУ 6-09-469-77.
Эстераза микробная — технический регламент ВНИИ Биотехника, 1982 г., Вышеволоцкий завод ферментных препаратов.
2.2.1. Растворы: готовят борно-щелочной буфер 0,7 М с рН 9,5 смешением 0,7 М натрия гидроокиси и 0,7 М борной кислоты.
2.2.2. Рабочий раствор фермента готовят при концентрации 0,5 мг/мл в 0,7 М борно-щелочном буфере, рН 9,5 (при исходной активности фермента — 0,5 + 1,0 Е/мг по индофенилацетату).
2.2.3 Индофенилацетат растворяют в ацетоне до концентрации 2 мг/мл.
-3
2.2.4. Стандартный раствор хлорофоса в ацетоне 1 х 10 мг/мл и серия -5
стандартных растворов с содержанием 0,5; 1; 2; 3; 5; 10; 20; 50 х 10 мг/мл (что при объеме пробы 20 мкл соответствует 0,1; 0,2; 0,4; 0,6; 1,0;
2,0; 4,0; 10 нг на хроматографической пластинке).
2.3. Приборы и посуда
Колбы плоскодонные на 250 мл, ГОСТ 1770-74.
Мерные колбы на 100 и 50 мл, ГОСТ 1770-74.
Пипетки на 0,1; 1 и 10 мл, ГОСТ 1770-74.
Мерные цилиндры на 50 мл, ГОСТ 1770-74.
Прибор для встряхивания АВУ-1, ТУ 64-1-1081-73.
Хроматографические камеры, ГОСТ 10565-75.
2.4. Ход анализа
2.4.1 Отбор проб
Пробы отбирают в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб», утвержденными Заместителем Главного государственного санитарного врача СССР, № 2051-79 от 21.08.79. Для анализа из каждого вымытого клубня вырезают ножом кубики размером 0,5 х 0,5 см и отвешивают пробу 10 г.
2.4.2 Проведение определения
Навеску картофеля (10 г) помещают в плоскодонную колбу, добавляют 50 мл
ацетона и экстрагируют хлорофос в течение 30 мин. при помощи механического встряхивателя. Экстракт фильтруют в другую плоскодонную колбу. Повторяют экстракцию еще два раза 50 мл ацетона. Экстракты объединяют. Из объединенного экстракта наносят пробу 20 мкл микрошприцем на хроматографическую пластинку. Параллельно на пластинку наносят серию
-5
стандартных растворов с концентрацией 0,5, 1, 2, 3, 5, 10, 20, 50 х 10 мг/мл (тоже по 20 мкл).
Хроматограмму развивают в системе гексан — ацетон (1:1). После развития хроматограмму сушат, обрабатывают раствором фермента и помещают во влажную камеру на 40 — 60 мин., а затем обрабатывают раствором индофенилацетата.
Хлорофос проявляется в виде желтых пятен на сине-зеленом фоне (цвет фона впоследствии переходит в розово-синий). Причем пятна, соответствующие количествам хлорофоса 0,1 - 1,0 нг, стабильны в течение 10 минут, 1,0 нг - в течение 10 часов. R хлорофоса 0,56 +/- 0,02. Нижний предел определения -
f
0,1 нг в хроматографируемой пробе.
2.5. Обработка результатов анализа
Количественное определение проводят путем сравнения размера и интенсивности пятен в рабочей пробе с пятнами стандартных растворов. Содержание хлорофоса в картофеле вычисляют по формуле:
V х А
где:
А — количество хлорофоса, найденное в рабочей пробе на хроматограмме, мкг;
V — объем нанесенной на пластинку аликвоты в мл (0,02 мл = 20 мкл); а
V — конечный объем рабочего раствора, мл (150 мл);
Р — взятая навеска картофеля в г (10 г).
ДДВФ определению не мешает, т.к. в данной системе имеет R = 0,80. f
Примечание: При анализе старого картофеля на линии старта (R = 0,0) f могут проявляться пятна вследствие образования при хранении картофеля токсинов, обладающих антиэстеразным действием.
3. Требования безопасности
Меры предосторожности при работе с хлорофосом — как со среднетоксичными пестицидами. Необходимо также соблюдать требования техники безопасности, принятые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями.
4. Разработчики
Методические указания разработаны в институте Химаналит, НПО «Химавтоматика», Ленинград, Вашкевич О.В.