Методические указания по определению байлетона в картофеле, огурцах, томатах, яблоках, персиках, винограде, цитрусовых (лимонах, апельсинах, мандаринах), зерне, зеленой массе растений, сырье лекарственных культур, воде и почве методами газожидкостной и тонкослойной хроматографии

(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 3016-89)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["Методические указания по определению... (от 19.10.1979 N 2068-79)"]:::rst
  click n0 "https://bukva.ai/docs/2068-79" "Методические указания по определению фунгицида байлетона методом ТСХ в почве, корнях, зеленых листьях, плодах томатов и огурцов (утв. Минздравом СССР 19.10.1979 N 2068-79)"
  n1["Методические указания по определению... (от 08.06.1989 N 3016-89)"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/3016-89" "Методические указания по определению байлетона в картофеле, огурцах, томатах, яблоках, персиках, винограде, цитрусовых (лимонах, апельсинах, мандаринах), зерне, зеленой массе расте"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ БАЙЛЕТОНА В КАРТОФЕЛЕ, ОГУРЦАХ, ТОМАТАХ, ЯБЛОКАХ, ПЕРСИКАХ, ВИНОГРАДЕ, ЦИТРУСОВЫХ (ЛИМОНАХ, АПЕЛЬСИНАХ, МАНДАРИНАХ), ЗЕРНЕ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ РАСТЕНИЙ, СЫРЬЕ ЛЕКАРСТВЕННЫХ КУЛЬТУР, ВОДЕ И ПОЧВЕ МЕТОДАМИ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>

<*> Разработаны авторскими коллективами: Ф.Р. Мельцер, К.Ф. Новиковой (ВНИИХСЗР) [1]; Н.Б. Бажановой, К.В. Аветисян, Ф.А. Папоян (АрмНИИЗР) [2]; Д.Б. Гиренко, Л.Е. Морару, М.А. Клисенко (ВНИИГИНТОКС) [3]; Т.М. Петровой, Т.Ф. Блиновой (ВИЗР)[4]; Г.К. Тюрюкановой (ИПФ АН СССР) [5]; Г.П. Пушкиной, Р.Н. Ситишевой (ВИЛР) [6]; А.Ф. Скурьят, Б.Б. Елманской, М.М. Кивачицкой (БелНИИЗР) [7].

Краткая характеристика препарата дана в Методических указаниях № 5034-89.

Принцип метода. Метод основам на извлечении байлетона из овощей и фруктов этилацетатом, из зерна — смесью ацетона с водой, очистке экстракта перераспределением фунгицида в хлороформ, а затем на колонке с оксидом алюминия и определении методом ТСХ или ГЖХ с ТИД и ДЭЗ. Из воды байлетон извлекают хлороформом или гексаном. Из лекарственных растений байлетон экстрагируют ацетоном, экстракт очищают вымораживанием, а затем фунгицид перераспределяют в этилацетат, очищают на колонке с оксидом алюминия и определяют методами ГЖХ и ТСХ. Из обычной почвы триадимефон извлекают смесью ацетона с раствором хлорида кальция и после вымораживания фунгицид перераспределяют в гексан и определяют методом ГЖХ или ТСХ. Из почвы с большим содержанием гумуса байлетон извлекают смесью вода-ацетон-гексан (2:3:7) с последующим перераспределением в соляную кислоту, а затем, после подщелачивания раствора, — в гексан и определяют методом ГЖХ или ТСХ.

Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода представлена в таблице 116.

Таблица 116

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Примечание. В квадратных скобках даны ссылки на авторские коллективы (см. <*>).

Избирательность метода. Метод селективен. Другие пестициды определению не мешают. Избирательность метода обеспечивается сочетанием колонок (при ГЖХ) и систем подвижных растворителей (при ТСХ) различной полярности.

Реактивы и растворители. Ацетон х.ч. Хлороформ свежеперегнанный, ч.д.а. Бензол ч.д.а. Ацетонитрил х.ч. Активированный уголь, КАД молотый. Хлороводородная кислота особой чистоты, 1 н раствор. Гексан ч.д.а. Этилацетат свежеперегнанный, х.ч. Толуол х.ч. Четыреххлористый углерод ч.д.а. Хлорид натрия х.ч. Изооктан х.ч. Гидроокись калия ч.д.а., 4 н раствор. Безводный сульфат натрия х.ч. Хлорид кальция х.ч., 0,05 н раствор. Уксусная кислота ч.д.а. Нитрат серебра ч.д.а. Бромфеноловый синий ч.д.а. Лимонная кислота х.ч., 1-процентный в.р. Проявляющий реагент: перед применением смешать в равных объемах 0,4-процентный ацетоновый раствор бромфенолового синего с 2-процентным водным раствором нитрата серебра. Раствор хранят в темной склянке. Пригоден к употреблению в течение длительного времени. На каждое определение расходуется 3 — 5 мл раствора. Оксид алюминия II степени активности по Брокману, нейтральный. Хроматон N-супер с 3% SE-30 (0,16 — 0,20 мм), готовый товарный носитель (I колонка) [1]. Хроматон N-AW (0,125 — 0,160) с 5% SE-30 (II колонка) [4]; (V колонка) [7]. Хроматон N-AW-DMCS (0,20 — 0,25 мм) с 5% XE-60, готовый товарный носитель (III колонка) [1]. Хроматон N-AW-HMDS (0,20 — 0,25 мм) с 3% карбовакса 20 М (IV колонка) [1]. Газ-хром Q (0,16 — 0,20 мм) с 3% OV-1 (VI колонка) [7]. Газообразный азот или гелий в баллоне с редуктором. Водород из баллона или полученный из генератора водорода. Воздух из баллона или нагнетаемый компрессором. Стандартные растворы байлетона в ацетоне с содержанием 1000; 100 и 10 мкг/мл. Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес. Пластинки «Силуфол».

Приборы, аппаратура, посуда. Хроматограф «Цвет-106» или аналогичный прибор с ТИД и ДЭЗ или аналогичный прибор. Хроматографические колонки стеклянные длиной 100, 110 и 150 см, внутренним диаметром 3 мм. Хроматографические камеры с пришлифованными крышками. Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М. Воронки делительные вместимостью 1000 и 100 мл; химические. Колбы: круглодонные вместимостью 100 и 250 мл; мерные на 100 мл; грушевидные на 50 мл. Цилиндры мерные. Пипетки с делениями вместимостью 10 и 1 мл. Микрошприц на 10 мкл. Пульверизаторы стеклянные. Хроматографические колонки стеклянные с краном и оттянутым носиком, длиной 10 см, внутренним диаметром 1 см (колонка I) и длиной 20 см, внутренним диаметром 2 см (колонка II).

Подготовка к определению. Хроматографическую камеру заполняют системой подвижных растворителей бензол-этилацетат (9:1) [1, 2] или гексан-ацетон (72:28) [1, 2], или толуол-этилацетат-аммиак (85:30:3) [1, 2], или хлороформ-ацетон (9:1) [3], или изооктан-ацетон (70:3) [2] за 1 ч до начала хроматографирования. Объем подвижного растворителя в камере должен по высоте находиться не выше чем 0,7 — 0,1 см над уровнем дна. В стеклянную хроматографическую колонку I помещают ватный тампон, затем суспензию оксида алюминия в четыреххлористом углероде при открытом кране. Когда сорбент заполнит всю колонку, избытку растворителя дают стечь, оставляя маленький слой его (0,2 — 0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают. Колонка I готова к работе [1].

Колонку II последовательно заполняют на 2 см оксидом алюминия и на 1 см — безводным сульфатом натрия, промывают 10 мл гексана. Колонка готова к работе [6].

Подготовка проб к анализу. Для анализа картофеля, помидоров, огурцов, яблок, цитрусовых, персиков из отдельных клубней или плодов средней пробы ножом вырезают сектора толщиной 2 — 3 мм и измельчают их. Для анализа винограда отбирают по 2 — 3 ягоды от каждой грозди и также измельчают ножом. Подготавливают по 3 — 5 параллельных навесок анализируемых образцов, массой 50 г. Зеленую массу растений измельчают ножом на полоски длиной 0,5 — 0,7 см и подготавливают навески массой 5 г. Зерно измельчают на кофейной мельнице до консистенции муки грубого помола и отбирают навеску массой 10 г. Почву просеивают через почвенное сито и отбирают навески массой 10 г. Лекарственное сырье измельчают.

Ход анализа. Экстракция, очистка экстракта. Навеску анализируемой пробы из картофеля, яблок, цитрусовых, персиков, винограда, огурцов, томатов [1] массой 50 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, заливают 100

мл  этилацетата  и  проводят  экстракцию  байлетона с помощью механического
встряхивания  в  течение  30  мин.  Экстракт фильтруют в круглодонную колбу
вместимостью  500  мл.  Еще  дважды  повторяют  операцию тем же количеством
растворителя.  Этилацетат  из  экстракта  с помощью ротационного вакуумного
испарителя  удаляют  полностью.  Остаток  количественно,  при  помощи 25 мл
ацетона,  переносят  в  делительную  воронку  на  100  мл,  добавляют 50 мл
дистиллированной  воды; 0,5 чайной ложки хлорида натрия и 20 мл хлороформа.
Делительную  воронку закрывают стеклянной пробкой и ее содержимое энергично
встряхивают.  После  разделения  слоев нижний хлороформный слой переносят в
коническую  колбу  вместимостью 250 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза тем
же  количеством  хлороформа.  Объединенный  хлороформный экстракт сушат над
безводным  сульфатом  натрия (10 - 15 г), фильтруют через бумажный фильтр в
круглодонную  колбу  вместимостью 100 мл и отгоняют растворитель досуха при
помощи  роторного  испарителя.  К сухому остатку добавляют 2 - 3 мл CCl   и

                                                                   4

проводят  очистку  на  колонке  I  с оксидом алюминия. Для этого полученный
раствор   переносят   на  колонку,  стенки  колбы  обмывают  несколько  раз

небольшими порциями CCl , общим объемом 2 мл, и также переносят на колонку. 4

Колонку   промывают  10  мл  смеси  четыреххлористый  углерод-бензол-гексан
(1:1:1)   со   скоростью   1   кап./с.  Равномерность  потока  растворителя
обеспечивается   вакуумом,   регулируемым   водоструйным  насосом.  Поменяв
приемную  колбу  на  грушевидную,  вместимостью  20  мл, элюируют с колонки
байлетон  1 мл этилацетата. С помощью ротационного вакуумного испарителя из
грушевидной   колбы  полностью  отгоняют  растворитель.  К  сухому  остатку
пипеткой  добавляют  0,5  мл  ацетона.  Колбу  закрывают пробкой на шлифе и
стенки  колбы  тщательно  обмывают  растворителем.  Определение байлетона в

полученной пробе проводят методом ГЖХ или ТСХ.

Навеску размолотого на кофейной мельнице зерна [1] массой 10 г помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл и трижды проводят экстракцию байлетона этилацетатом порциями по 50 мл при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Все остальные операции проводят так же, как описано для картофеля.

Из пробы почвы с малым содержанием гумуса [4] массой 20 г препарат экстрагируют 50 мл смеси ацетона с 0,05 н водным раствором хлорида кальция (1:1). Пробы в течение 1 ч встряхивают на аппарате для встряхивания. Колбу с экстрактом помещают в морозильную камеру бытового холодильника на 1 ч. Затем экстракт фильтруют через вату в другую коническую колбу. Препарат трижды экстрагируют н-гексаном по 20 — 25 мл. Гексановые фракции фильтруют через безводный сульфат натрия в круглодонные колбы и упаривают до определенного объема. Аликвоту в количестве 1 — 2 мкл вводят в хроматограф.

Пробу почвы с большим содержанием гумуса [5] массой 50 г заливают 120 мл смеси вода-ацетон-гексан (2:3:7) и экстрагируют байлетон с помощью механического встряхивания колбы в течение 1 ч или оставляют на сутки для пассивной экстракции. Полученный экстракт фильтруют, почву на фильтре дважды промывают ацетоном порциями по 10 мл. Экстракт концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя. Остатки органических растворителей из водного остатка выдувают слабым потоком воздуха. К водному остатку добавляют 30 мл 0,1 н HCl. Полученный раствор фильтруют через бумажный фильтр в делительную воронку вместимостью 100 мл. Колбу и фильтр дважды ополаскивают по 15 мл 0,1 н HCl. К солянокислому раствору добавляют по 2 мл 4 н KOH (до pH 8 — 10). Байлетон экстрагируют гексаном порциями один раз 20 мл и 2 раза по 10 мл. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и из полученного фильтрата с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана, колбу закрывают пробкой на шлифе. Далее проводят определение методом ГЖХ или ТСХ [5].

    Навеску  лекарственного сырья [6] массой 5 - 10 г сухого или 50 - 100 г
сырого  измельчают,  заливают  ацетоном  (70 - 250 мл) и оставляют на ночь.
Затем  в  случае сухого сырья растворитель сливают через бумажный фильтр, в
случае  сырого  -  через безводный сульфат натрия. Остаток трижды промывают
ацетоном  по  50  мл.  Объединенные  экстракты  упаривают  до  10  - 15 мл,
добавляют  20 - 25 мл 0,05 н CaCl  и ставят в холодильник для вымораживания

                             2

масел на 2 — 3 ч. Затем фильтруют через фильтр «синяя лента» и проводят переэкстракцию в этилацетат (3 раза по 30 мл). Остаток в колбе растворяют в

5  мл  ацетонитрила  и  количественно переносят в делительную воронку, куда
предварительно  добавлено 10 - 15 мл 2-процентного раствора NaCl.  Байлетон
трижды экстрагируют  этилацетатом  порциями по 30 мл. Этилацетатный раствор
сушат  безводным  сульфатом  натрия и отгоняют  до 5 - 10 мл. Далее очистка
экстракта  проводится  на  колонке II  (20 x 2 см), заполненной слоем окиси
алюминия  II  степени  активности   (2  см)  и  сульфата   натрия  (1  см).
Предварительно через колонку  пропускают 10  мл  гексана, колонку промывают
100 мл этилацетата. Этилацетат отгоняют досуха. Сухой остаток растворяют  в
1 мл гексана, раствор  концентрируют  на  водяной бане до объема ~ 0,05 мл.

Далее проводят определение методом ТСХ.

К 5 г измельченной ножницами зеленой массы растений [1] приливают 50 мл этилацетата. Экстракцию байлетона и очистку экстракта проводят, как описано выше для почвы и картофеля.

Пробу воды [1, 3, 5] 500 мл помещают в делительную воронку на 1 л, подщелачивают 4 н раствором KOH до pH 8 — 10, добавляют 1 чайную ложку хлорида натрия и 50 мл хлороформа или гексана. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев органический слой сливают в плоскодонную колбу на 250 мл. Экстракцию байлетона проводят еще 2 раза тем же количеством растворителя. Объединенный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (~ 10 г). Раствор сливают через бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 250 мл. Сульфат натрия промывают небольшими порциями того же растворителя (10 — 12 мл) и сливают фильтрат в круглодонную колбу. Из объединенного раствора с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл гексана. Далее проводят определение методом ГЖХ или ТСХ. Если экстракт грязный, то предварительно проводят очистку перераспределением в соляную кислоту по схеме, описанной для почвы с большим содержанием гумуса.

Навеску почвы, зеленой массы, яблок 100 г или зерна 10 — 20 г (пробу измельчают) экстрагируют 100 — 200 мл ацетона с помощью механического встряхивания в течение 1 ч. Затем экстракцию повторяют, встряхивают анализируемую пробу в течение 30 мин. со 100 мл ацетона. Осушенный объединенный экстракт очищают активированным углем в течение 1,5 ч на аппарате для встряхивания. Затем пробе дают отстояться и фильтруют через плотный фильтр, наполненный безводным сульфатом натрия. Осушенный объединенный экстракт упаривают на ротационном испарителе и хроматографируют [7].

Примечание. При работе с оводненными плодами после выпаривания ацетона довольно часто на дне колбы остается вода, которая при 70 °C не выпаривается. В таком случае надо к водному остатку добавить хлороформ, по объему равный жидкости, и экстрагировать препарат в течение 1 ч на аппарате для встряхивания. Отделить хлороформ, пропустить его через безводный сульфат натрия, а в жидкость снова добавить такое же количество хлороформа и еще раз поставить на качалку на 30 мин. Экстракты объединить, выпарить. Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетона и 2 — 4 мкл вводят в хроматограф [7].

Определение методом ГЖХ. В хроматограф вводят 1 — 4 мкл полученного раствора.

Условия хроматографирования. Хроматограф «Цвет 106» с ТИД и ДЭЗ. Насадки колонок: I колонка — 3% SE-30 на хроматоне N-супер (0,20 — 0,16 мм) [1]; II и V колонки — 5% SE-30 на хроматоне N-AW (0,125 — 0,160 мм) [4, 7]; III колонка — 5% XE-60 на хроматоне N-AW-DMCS (0,20 — 0,25 мм) [1]; IV колонка — 3% карбовакса 20 М на хроматоне N-AW-HMDS (0,20 — 0,25 мм) [1]; VI колонка — 3% OV-1 на газе-хроме Q (0,16 — 0,20 мм) [7]. Конкретные параметры работы устанавливаются в зависимости от применяемого прибора. Ниже представлены условия хроматографирования на приборе «Цвет 106» с ТИД и ДЭЗ (табл. 117).

Таблица 117

НА РАЗЛИЧНЫХ КОЛОНКАХ И ДЕТЕКТОРАХ

Количественное определение на ТИД проводят методом соотношения со стандартом по высоте пика. Серию стандартов для ГЖХ готовят следующим образом: из стандартного раствора байлетона с содержанием 10 мкг/мл в градуированные пробирки с оттянутым дном и пробками на шлифах пипеткой вносят 0,1; 0,3; 0,5; ...; 1,5; 1,7 мл и доводят до 5 мл ацетоном. В пробирки помещают заплавленные в верхней части капилляры и концентрируют растворы на горячей водяной бане до объема 1 мл, вынимают из пробирки капилляры и полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 0,5 мл ацетона. Пробирки закрывают пробкой и их содержимое перемешивают. В хроматограф вводят 3 мкл полученных растворов. Расчет проводят по стандартному раствору, высота пика которого наиболее близка высоте пика рабочей пробы. Количественное определение при работе на ДЭЗ проводят методом абсолютной калибровки по градуировочному графику.

Определение методом ТСХ. Для определения остаточных количеств байлетона

методом  ТСХ  [1, 2, 3, 5, 6]  концентрируют  ацетоновый раствор на горячей
водяной  бане  до объема ~ 0,05 мл.  Оставшуюся  каплю  количественно,  при
помощи  стеклянного  капилляра,  наносят  на пластинку "Силуфол".  Справа и
слева  от рабочей  пробы  стеклянным  капилляром  наносят  серию стандартов
байлетона 1; 2; 3; 4; ...; 8 мкг,  которые  готовят  следующим  образом: из
стандартного раствора  байлетона  с  содержанием  10  мкг/мл  в пробирки  с
оттянутым дном пипеткой наносят последовательно 0,1;  0,2;  0,3;  0,4; ...;
0,8 мл  и  концентрируют  растворы   на  горячей  водяной  бане  до  объема
~ 0,05 мл.  Сконцентрированные  стандарты  наносят  на пластинку аналогично
рабочей пробе.  Пластинку  помещают в хроматографическую камеру и развивают
хроматограмму  в системе  подвижных  растворителей бензол-этилацетат (9:1),
или гексан (толуол)-ацетон-аммиак (85:30:3),  или  гексан-ацетон   (72:28).
После окончания хроматографирования  пластинку сушат  на воздухе,  а  затем
опрыскивают  из  пульверизатора  проявляющим  раствором до появления синего

фона на пластинке. Фон снимают, опрыскивая пластинку 1-процентным раствором

лимонной  кислоты.  Байлетон проявляется на пластинке в виде синих пятен на
лимонно-желтом фоне с R  0,22 +/- 0,03 в первой системе, 0,35 +/- 0,05 - во

                   f

второй  и  0,50  +/-  0,05  -  в  третьей.  Пятна  стабильны в течение дня.
Линейность  определения сохраняется в пределах 1 - 8 мкг. При более высокой

концентрации хроматографируют аликвотную часть раствора.

Обработка результатов анализа. Газохроматографическое определение. Содержание байлетона в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) при работе на ТИД вычисляют по формуле:

                               C  H  V
                                ст рп

X = -------, H V P ст а

где:

C — количество стандарта, введенного в хроматограф, нг; ст

    H  , H   - высоты пиков соответственно рабочей пробы и стандарта, мм;
     рп   ст

V — общий объем рабочего раствора, мл;

V — объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл; а

P — навеска анализируемого образца или объем пробы воды, г или мл.

Содержание байлетона в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) при работе на ДЭЗ вычисляют по формуле:

                                 AV

X = ---, V P а

где:

A — количество байлетона, найденное по градуировочному графику в хроматографируемой пробе, нг.

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит «зашкаливание», к рабочему раствору пипеткой добавляют известное количество ацетона и анализируют более разбавленный раствор.

Определение методом тонкослойной хроматографии. Количественно байлетон в пробе определяют путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов. При большом содержании байлетона на пластинку наносит аликвотную часть раствора из 0,5 мл рабочей пробы. Содержание байлетона в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:

                                 AV

X = ---, V P а

где:

A — количество байлетона, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

V — общий объем раствора, из которого отбирают аликвоту для хроматографирования, мл;

V — объем аликвоты, нанесенной на хроматографическую пластинку, мл а (при нанесении всей пробы V = V ); а

P — навеска анализируемой пробы или объем анализируемой воды, г или мл.

Требования безопасности. Соблюдать требования безопасности, принятые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.