Методические указания по определению АТГ и АТГ-ф в воде, почве, растительном и биологическом материале методом тонкослойной хроматографии
(утв. Минздравом СССР 08.06.1989 № 5034-89)
8 июня 1989 г. № 5034-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ АТГ И АТГ-Ф В ВОДЕ, ПОЧВЕ, РАСТИТЕЛЬНОМ И БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Разработаны Ю.А. Бунятяном, М.О. Петросян (Филиал ВНИИГИНТОКС).
Препараты АТГ и АТГ-ф рекомендуются для применения в сельском хозяйстве в качестве ингибиторов нитрификации азотных удобрений на посевах риса, пшеницы, овощей, хлопчатника.
Краткая характеристика препаратов. АТГ — 4-амино-1,2,4-триазол. Брутто- формула C H N . Молекулярная масса 84. Химически чистое соединение 2 4 4
представляет собой белый порошок без запаха, хорошо растворимый в воде, ацетоне, спиртах. Разлагается при температуре выше 220 °C. Стабилен по отношению к действию кислот и щелочей. АТГ - малотоксичное соединение. Для крыс ЛД составляет 13600 мг/кг.
50
АТГ-ф - фосфорнокислая соль 4-амино-1,2,4-триазола. Брутто-формула C H N x H PO . Молекулярная масса 182. Химически чистое соединение 2 4 4 3 4 представляет собой белый порошок без запаха. Т. пл. 90 - 92 °C, хорошо растворимо в воде, этаноле, ацетоне. Стабилен при комнатной температуре, разлагается при температуре выше 220 °C. АТГ-ф малотоксичен для теплокровных животных. Для крыс ЛД составляет 4800 мг/кг.
50
Принцип метода. Методика основана на извлечении АТГ и АТГ-ф из анализируемой пробы ацетоном, очистке экстрактов на колонке с основным оксидом алюминия V степени активности и хроматографировании в тонком слое пластинок «Силуфол». Зоны локализации препаратов обнаруживаются в виде синих пятен на светлом фоне после предварительного облучения пластинок УФ-светом и обработки йод-крахмальным реагентом или о-толидином.
Метрологическая характеристика метода. Метрологическая характеристика метода дана в таблице 111.
МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ МЕТОДА (n = 5, p = 0,95
ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ В ВОДЕ, ПОЧВЕ, РАСТИТЕЛЬНОМ МАТЕРИАЛЕ;
n = 20, p = 0,95 — В БИОЛОГИЧЕСКОМ)
| Анализи- Предел руемый обнаружения, объект мг/кг или л | Диапазон определяемых концентраций, мг/кг или л | Среднее значение определения, % | Стандартное отклонение, % | Доверительный интервал среднего, % | |
| АТГ | |||||
| Вода | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 89 | +/- 2,53 | +/- 1,04 |
| Почва | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 81 | +/- 2,11 | +/- 0,87 |
| Пшеница | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 87 | +/- 1,70 | +/- 0,70 |
| Рис | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 81 | +/- 1,83 | +/- 0,76 |
| Томаты | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 85 | +/- 2,87 | +/- 1,19 |
| Кровь | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 90 | +/- 4,45 | +/- 1,84 |
| Печень | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 83 | +/- 1,99 | +/- 1,00 |
| Легкие | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 85 | +/- 1,77 | +/- 0,82 |
| Почки | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 85 | +/- 1,44 | +/- 0,66 |
| Сердце | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 87 | +/- 2,70 | +/- 1,28 |
| Селезенка | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 83,1 | +/- 2,15 | +/- 1,11 |
| Мозг | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 80 | +/- 2,39 | +/- 1,13 |
| Моча | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 80 | +/- 2,35 | +/- 1,11 |
| Кал | 0,2 | 0,2 — 2,0 | 81 | +/- 1,83 | +/- 0,76 |
| АТГ-ф | |||||
| Вода | 0,01 | 0,01 — 0,1 | 87 | +/- 1,60 | +/- 1,98 |
| Почва | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 80 | +/- 2,25 | +/- 2,75 |
| Рис | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 88 | +/- 2,39 | +/- 4,50 |
| Пшеница | 0,04 | 0,04 — 0,4 | 87 | +/- 1,60 | +/- 1,98 |
| Картофель | 0,08 | 0,08 — 0,4 | 81 | +/- 2,55 | +/- 3,15 |
Избирательность метода. Определению АТГ и АТГ-ф в предлагаемых условиях хроматографирования не мешают близкие по структуре и области применения такие соединения, как ГМП, КМП, ТМДИ, ГМДИ, ХГИ, нитрапирин, 6-хлорпиколиновая кислота, тилт, байлетон, лонтрел, хлорамп, а также применяющиеся на посевах риса пропанид, базогран, ордран.
Реактивы и материалы. АТГ х.ч. АТГ-ф х.ч. Ацетон х.ч. н-Гексан х.ч. Хлороводородная кислота концентрированная, х.ч., 25-процентный в.р. (по объему). Уксусная кислота х.ч. Гидроксид натрия х.ч. Этиловый спирт х.ч. Марганцовокислый калий х.ч., 3-процентный в.р. Йодид калия х.ч., 1-процентный. Водорастворимый крахмал х.ч., 3-процентный в.р. Сульфат натрия безводный, х.ч. Бикарбонат аммония х.ч., 1 М водный раствор. Оксид алюминия основной, размеры частиц 40/250 мк. Анионообменная смола AB-17-8.
Фильтры бумажные обеззоленные «синяя лента», предварительно промытые смесью хлороформ-ацетон (1:1). Пластинки хроматографические «Силуфол» УФ 254
размером 15 x 15 см. Стандартные растворы АТГ и АТГ-ф в ацетоне концентрацией 100; 10 и 1 мкг/мл. Хранить в холодильнике не более 3 мес. Проявляющие реагенты: раствор для хлорирования (смешивают равные объемы 3-процентного раствора перманганата калия и 25-процентного раствора хлороводородной кислоты). Готовят перед употреблением в количествах, необходимых для разового пользования; проявляющий реагент 1: а - 1-процентный водный раствор йодида калия, б - 3-процентный раствор крахмала. Перед употреблением смешать растворы а, б и этиловый спирт в соотношении 2,5:2,5:1. Проявляющий реагент 2: а - 0,2 г о-толидина растворяют в 2 мл уксусной кислоты, б - 0,8 г йодида калия растворяют в 2 мл дистиллированной воды. Смешивают растворы а, б и доводят дистиллированной водой до объема 200 мл. Перед опрыскиванием пластинку помещают в эксикатор, содержащий раствор для хлорирования, на 3 - 5 мин., после чего оставляют на воздухе до удаления запаха хлора (около 15 мин.) и
обрабатывают проявляющим реагентом 1 или 2.
Приборы, аппаратура, посуда. Ртутно-кварцевая лампа ПРК-2 или ПРК-4. Прибор для отгонки растворителей. Колбы: мерные на 100 мл; конические на 250 и 100 мл; круглодонные на 100 мл. Воронки делительные и химические. Микропипетки на 0,1 мл. Цилиндры мерные вместимостью 50 и 100 мл. Колонки стеклянные хроматографические диаметром 1,5 — 2 см, длиной 20 см. Камера хроматографическая. Пульверизаторы стеклянные. Камера для хлорирования (эксикатор).
Подготовка к определению. Подготовка анионита AB-17-18. Анионит (200 г)
замачивают в дистиллированной воде в течение 24 ч, периодически сменяя воду, далее промывают 1 М раствором бикарбоната аммония (1,5 - 2 л). Затем
промывают смолу дважды по 100 мл дистиллированной водой. Переведенный таким — образом в HCO — форму анионит готов для проведения анализа. 3
Приготовление хроматографической колонки. В колонку диаметром 1,5 — 2 см помещают 20 г основного оксида алюминия (40/250 мк) V степени активности (19% воды) и 5 г безводного сульфата натрия. Колонки предварительно промывают сначала этанолом (50 мл), затем смесью бензол-ацетон по 50 мл (1:1).
Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов.
В 100 мл пробы воды вносят 25 г предварительно подготовленного анионита и встряхивают на аппарате для встряхивания в течение 1 ч. Затем воду фильтруют через фильтр «синяя лента» в перегонную колбу, анионит еще дважды тщательно промывают дистиллированной водой и фильтруют через ту же воронку. Воду отгоняют на ротационном испарителе досуха при температуре не выше 80 °C. Сухой остаток с помощью ацетона количественно наносят на хроматографическую пластинку «Силуфол».
К 25 г измельченной и просеянной почвы добавляют 3 мл воды при определении АТГ и 3 мл 20-процентного раствора гидроксида натрия при определении АТГ-ф и экстрагируют препараты ацетоном трижды по 50 мл. Объединенный экстракт фильтруют через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия (1 — 2 г), отгоняют растворитель досуха при определении АТГ и до объема 1 мл при определении АТГ-ф на ротационном испарителе при температуре не выше 80 °C. Остаток с помощью ацетона (2 — 3 мл) количественно переносят на колонку с основным оксидом алюминия V степени активности и безводным сульфатом натрия. Колонки предварительно промывают сначала этанолом, затем смесью бензол-ацетон (1:1). Коэкстрактивные вещества вымываются 50 мл смеси бензол-ацетон (1:1). Этот элюат отбрасывается, далее препараты элюируют этанолом. При этом первые 10 мл не содержат АТГ или АТГ-ф, а препараты выходят в последующих 30 мл этанола, которые отгоняют на ротационном испарителе до объема 0,1 — 0,2 мл и с помощью ацетона количественно наносят на хроматографическую пластинку. Рабочие объемы колонок необходимо выявлять для каждого отдельного случая перед использованием для серийных анализов.
При определении АТГ в растительном материале (рисе, пшенице, картофеле, томатах) 25 г измельченной пробы экстрагируют ацетоном трижды по 50 мл, а при определении АТГ-ф к 25 г пробы риса, пшеницы добавляют 3 мл 60-процентного раствора гидроксида натрия, а картофеля — 20-процентного раствора гидроксида натрия и трижды экстрагируют ацетоном по 50 мл. Растворитель фильтруют в перегонную колбу через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия. Далее поступают аналогично экстракции препаратов из почвы.
Для определения АТГ из биологического материала (крови, печени, легких, почек, сердца, селезенки, мозга, мочи, кала) к 5 г (или 5 мл) измельченной пробы добавляют 3 мл 50-процентного раствора гидроксида натрия и экстрагируют АТГ ацетоном трижды по 15 — 20 мл. Объединенный экстракт фильтруют через фильтр «синяя лента» и слой безводного сульфата натрия (1 — 2 г) и отгоняют растворитель досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 80 °C. Остаток с помощью ацетона (2 — 3 мл) количественно переносят на колонку. Далее поступают аналогично экстракции препаратов из почвы.
Условия хроматографирования. После отгонки растворителя пробы с помощью
ацетона количественно наносят на пластинки "Силуфол" на расстоянии 1 см от нижнего край пластинки. Справа и слева от пробы наносят стандартные растворы АТГ или АТГ-ф, содержащие известное количество препаратов. Развитие хроматограммы проводят ступенчато сначала в системе гексан-ацетон
(5:3), затем в 80-процентном этаноле. После поднятия фронта растворителя на
14 см пластинку проветривают на воздухе до полного удаления растворителя. После этого пластинку подвергают облучению УФ-светом в течение 30 - 40 мин., затем помещают в камеру с раствором для хлорирования на 3 мин., оставляют пластинку на воздухе до полного удаления запаха хлора (около 15 мин.) и обрабатывают из пульверизатора проявляющим реагентом (йод-крахмальный или о-толидин). Зоны локализации АТГ и АТГ-ф обнаруживаются в виде синих пятен на светлом фоне. Окраска пятен устойчива в течение 3 дней. Величина R составляет 0,54. Линейный диапазон измерения
f
на пластинке 0,01 - 10 мкг. Если содержание препаратов в пробе превышает верхнюю границу диапазона, то для нанесения на пластинку необходимо брать
аликвотную часть экстракта.
Обработка результатов анализа. Количественная оценка проводится путем сравнения площадей и интенсивности окраски пятен проб и стандартных растворов. Содержание АТГ и АТГ-ф в анализируемой пробе (X, мг/кг или л) определяют по формуле:
A
A — количество АТГ, найденное путем сравнения со стандартами, мкг;
P — навеска или объем анализируемой пробы, г или мл;
K — коэффициент пересчета АТГ на АТГ-ф, равный 2,2.
Требования безопасности. Соблюдать все необходимые требования безопасности при работе в химических лабораториях.
УНИФИЦИРОВАННАЯ МЕТОДИКА ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАЙЛЕТОНА,
БАЙТАНА В СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННОЙ ПРОДУКЦИИ, ВОДЕ И ПОЧВЕ
МЕТОДАМИ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ <*>
<*> Настоящая методика рекомендуется наряду с официальными методами определения остаточных количеств. Унифицированная методика подготовлена специалистами СССР на основе национальной методики, разработанной авторским коллективом ВНИИХСЗР, ВНИИГИНТОКС, ВИЗР, АрмНИИЗР.
Краткая характеристика препаратов представлена в таблице 112. ДСД байлетона — 0,03 мг/кг. В огурцах, томатах МДУ — 0,5 мг/кг, яблоках — 0,05, винограде — 0,1 мг/кг. В землянике и смородине остаточные количества байлетона не допускаются.
КРАТКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТОВ
| Торговое название | Общепринятое название | Химическое название | Брутто формула (молекулярная масса) | Т. пл., °C | Растворимость при 20 °C, г/л |
|---|---|---|---|---|---|
| Байлетон | Триадимефон | 3,3-Диметил- 1-(III-1,2,4- триазолил-1)- 1-(4-хлорфенокси) бутанон-2 | C H ClN O 14 16 3 2 (293,8) | 82,3 | В воде — 0,26, толуоле — 400, циклогексаноне — 600 |
| Байтан | Триадименол | 3,3-Диметил- 1-(III-1,2,3- триазолил-1)- 1-(4-хлорфенокси) бутанол-2 | C H ClN O 14 18 3 2 (295,8) | 112 | В воде — 0,12, толуоле — 40, циклогексаноне — 400 |
Принцип метода. Метод основан на извлечении байлетона и байтана из воды хлороформом, а из овощей, фруктов, зерна и почвы с большим содержанием гумуса — смесью гексана с ацетоном (4:1), очистке экстракта перераспределением фунгицидов в хлороформ, а затем на колонке с оксидом алюминия и определении тонкослойной или газожидкостной хроматографией с ТИД или ДЭЗ. Из почвы с низким содержанием гумуса препараты извлекают смесью ацетона с раствором хлорида кальция и после вымораживания фунгициды перераспределяют в гексан и определяют методами ГЖХ или ТСХ.
Метрологическая характеристика метода. Метрологические данные представлены в таблицах 113, 114.
(ПРЕДЕЛ ОБНАРУЖЕНИЯ 3 НГ)
| Анализируемая проба | Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг или мг/л | Среднее значение определения при n = 15, % | Стандартное отклонение при n = 15, % | Доверительный интервал среднего определения при p = 0,95, n = 5, % |
|---|---|---|---|---|
| Картофель Фрукты (яблоки, виноград и др.) Овощи (огурцы, помидоры, перец) Зерно Почва Вода | 0,02 — 0,4 0,02 — 0,6 0,02 — 0,6 0,1 — 3,0 0,2 — 5,0 0,001 — 0,02 | 84,9 80,6 86,8 75,4 85,1 90,4 | +/- 8,2 +/- 6,9 +/- 9,8 +/- 4,3 +/- 6,7 +/- 7,4 | +/- 10,1 +/- 8,5 +/- 12,2 +/- 5,4 +/- 8,3 +/- 9,2 |
ОПРЕДЕЛЕНИЯ БАЙЛЕТОНА
| Анализируемая проба | Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг или мг/л | Предел обнаружения, нг (ГЖХ), мкг (ТСХ) | Среднее значение определения при n = 15, % | Стандартное отклонение при n = 15, % | Доверительный интервал среднего определения при p = 0,95, n = 5, % |
| Метод газожидкостной хроматографии | |||||
| Картофель | 0,01 — 0,34 | 2 | 81,5 | +/- 6,4 | 81,5 +/- 7,9 |
| Яблоки | 0,01 — 0,34 | 2 | 92,3 | +/- 7,9 | 92,3 +/- 9,8 |
| Цитрусовые | 0,01 — 0,34 | 2 | 84,0 | +/- 9,0 | 84,0 +/- 11,1 |
| Зерно | 0,05 — 1,7 | 2 | 90,0 | +/- 7,4 | 90,0 +/- 9,2 |
| Зеленая растительная масса | 0,1 — 3,4 | 2 | 81,7 | +/- 5,8 | 81,7 +/- 7,2 |
| Почва | 0,05 — 1,7 | 2 | 91,6 | +/- 7,7 | 91,6 +/- 9,5 |
| Вода | 0,002 — 0,0034 | 2 | 89,3 | +/- 6,2 | 89,3 +/- 7,7 |
| Метод тонкослойной хроматографии | |||||
| Картофель | 0,04 — 0,16 | 2 | 79 | +/- 3 | 79 +/- 4 |
| Яблоки | 0,02 — 0,16 | 1 | 81 | +/- 8 | 81 +/- 10 |
| Цитрусовые | 0,06 — 0,16 | 3 | 91 | +/- 10 | 91 +/- 12 |
| Зерно | 0,3 — 1,6 | 3 | 85 | +/- 10 | 85 +/- 12 |
| Почва | 0,2 — 1,6 | 2 | 88 | +/- 8 | 88 +/- 10 |
| Вода | 0,002 — 0,016 | 1 | 91 | +/- 7 | 91 +/- 9 |
| Лекарственные растения | 0,01 — 0,1 | 0,5 | 86 | +/- 5 | 86 +/- 6 |
Реактивы и растворы. Ацетон х.ч. н-Гексан х.ч. Хлороформ х.ч. Этилацетат х.ч. Четыреххлористый углерод. Хлорид кальции ч.д.а., 0,05 н раствор. Хлорид натрия ч.д.а. Сульфат натрия безводный ч.д.а. Оксид алюминия II степени активности по Брокману, нейтральный.
Стандартные растворы триадимефона и триадименола в ацетоне с содержанием 1000; 100 и 10 мкг/мл. Стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 мес.
Все растворители должны быть свежеперегнанными.
Для газожидкостной хроматографии: носитель хроматон N-супер (0,16 — 0,20 мм); хроматон N-AW-DMCS и HMDS (0,20 — 0,25 мм); хроматон N-AW (0,125 — 0,160 мм). Стационарные фазы SE-30, XE-60, карбонакс 20 М. Газообразный азот особой чистоты или гелий в баллоне. Водород из баллона или получаемый из генератора водорода. Воздух из баллона или нагнетаемый компрессором. Для тонкослойной хроматографии: ацетон ч.д.а. н-Гексан ч.д.а. Бензол ч.д.а. Этилацетат ч.д.а. Толуол ч.д.а. Хлороформ ч.д.а. Изооктан ч.д.а. Уксусная кислота ч.д.а. Нитрат серебра ч.д.а. Бромфениловый синий ч.д.а. Аммиак. Лимонная кислота, 1-процентный раствор. Проявляющий реагент (приготовление). Перед применением смешать в равных объемах 0,4-процентный ацетоновый раствор бромфенолового синего с 2-процентным йодным раствором азотнокислого серебра. Раствор хранят в темной склянке.
Приборы и посуда. Для экстракции и очистки экстракта. Мерная посуда 1 класса точности. Ротационный вакуумный испаритель. Аппарат для встряхивания. Почвенное сито. Колонки хроматографические стеклянные с краном и оттянутым носиком длиной 10 см, внутренним диаметром 1 см. Воронки делительные на 1000 и 100 мл. Колбы: круглодонные на 500 и 50 мл; плоскодонные на 250 и 100 мл; грушевидные на 50 мл. Для газожидкостной хроматографии. Газожидкостный хроматограф с ТИД и ДЭЗ. Колонки хроматографические стеклянные длиной 150, 110 и 100 см, внутренним диаметром 3 мм. Микрошприц на 10 мкл. Для тонкослойной хроматографии. Хроматографическая камера с пришлифованной крышкой. Пульверизатор. Микрошприц на 100 мкл. Стеклянные пластинки «Силуфол» размером 20 x 20 см. Термостат. Градуированные пробирки с пришлифованными пробками.
Стеклянная посуда перед использованием тщательно моется хромовой смесью (5-процентный раствор бихромата калия в концентрированной серной кислоте), затем многократно промывается сначала водопроводной, а затем дистиллированной водой.
Отбор проб и подготовка их к анализу. Пробы сельскохозяйственной продукции, воды и почвы хранят в холодильнике не более 5 дней. Каждую пробу воды отбирают в стеклянную бутылку с притертой пробкой вместимостью не меньше 1 л. Для анализа картофеля, огурцов, томатов, персиков, яблок, цитрусовых из отдельных клубней или плодов средней пробы ножом вырезают сектора толщиной 2 — 3 мм и измельчают их. Для анализа винограда отбирают по 2 — 3 ягоды от каждой грозди и также измельчают ножом. Подготавливают по 3 — 5 параллельных навесок анализируемых образцов массой 50 г. Зеленую массу растений измельчают ножом на полоски длиной 0,5 — 0,7 см и подготавливают навески массой 5 г. Зерно измельчают на кофейной мельнице до консистенции муки грубого помола и отбирают навеску массой 10 г. Почву просеивают через почвенное сито и отбирают навески массой 10 — 20 г.
Ход анализа. Экстракция и очистка экстрактов. Навеску анализируемой пробы из картофеля, огурцов, томатов, яблок, цитрусовых, персиков, винограда (50 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл, заливают 100 мл этилацетата и проводят экстракцию триадимефона и триадименола с помощью механического встряхивания в течение 20 мин. Экстракт фильтруют в круглодонную колбу вместимостью 500 мл. Еще дважды повторяют операцию тем же количеством растворителя. Этилацетат из экстракта с помощью ротационного вакуумного испарителя удаляют полностью. Остаток количественно, при помощи 25 мл ацетона, переносят в делительную воронку на 200 мл, добавляют 50 мл дистиллированной воды, 0,5 чайной ложки хлорида натрия и 20 мл хлороформа. Делительную воронку закрывают стеклянной пробкой и ее содержимое энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой переносят в коническую колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию повторяют еще 2 раза тем же количеством хлороформа. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 — 15 г), фильтруют через бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 100 мл и отгоняют растворитель досуха при помощи роторного испарителя. К сухому остатку добавляют 2 — 3 мл четыреххлористого углерода и проводят очистку на колонке с оксидом алюминия.
Хроматографическую колонку готовят следующим образом. В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем суспензию оксида алюминия в четыреххлористом углероде (при открытом кране). Когда сорбент заполнит всю колонку, избытку растворителя дают стечь, оставляя маленький слой (0,2 — 0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают. Колонка готова к работе. Полученный раствор переносят в колонку, стенки колбы обмывают несколько раз небольшими порциями четыреххлористого углерода, общим объемом 2 мл, и также переносят на колонку. Открывают кран колонки, дают раствору полностью впитаться в сорбент. Колонку промывают 10 мл смеси четыреххлористый углерод-бензол-гексан (1:1:1) со скоростью 1 кап./с. Равномерность потока растворителя обеспечивается вакуумом, регулируемым водоструйным насосом. Поменяв приемную колбу на грушевидную, вместимостью 20 мл, элюируют с колонки триадимефон и триадименол 25 мл этилацетата. С помощью ротационного вакуумного испарителя из грушевидной колбы полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 0,5 мл ацетона. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и стенки колбы тщательно обмывают растворителем. Определение триадимефона и триадименола в полученной пробе проводят методом ГЖХ или ТСХ.
Навеску размолотого на кофейной мельнице зерна (10 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл и трижды проводят экстракцию триадимефона и триадименола этилацетатом порциями по 50 мл при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 мин. Все остальные операции проводят, как описано для экстракции из картофеля.
К 20 г почвы с малым содержанием гумуса, помещенной в коническую колбу, добавляют 50 мл смеси ацетона с 0,05 н водным раствором хлорида кальция (1:1) и экстрагируют триадимефон с помощью механического встряхивания колбы и течение 1 ч. Колбу с экстрактом помещают в морозильную камеру бытового холодильника на 1 ч. Затем экстракт фильтруют через вату в делительную воронку. Фунгициды экстрагируют из фильтрата трижды гексаном порциями по 20 — 25 мл. Гексановые фракции фильтруют через слой безводного сульфата натрия в грушевидную колбу на 100 мл. Из колбочки с помощью ротационного вакуумного испарителя полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 — 2 мл гексана. Далее проводят определение методом ГЖХ.
К 10 г почвы с большим содержанием гумуса, растертой в фарфоровой ступке, добавляют 2 мл дистиллированной воды. Экстракцию триадимефона и триадименола проводят трижды смесью гексан-ацетон (4:1) порциями по 50 мл при механическом встряхивании колбы в течение 30 мин. Все дальнейшие операции проводят, как описано выше для экстракции из картофеля.
Воду (500 мл) помещают в делительную воронку на 1 л, добавляют 1 чайную ложку хлорида натрия и 50 мл хлороформа. Смесь в течение нескольких минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой сливают в плоскодонную колбу на 250 мл. Экстракцию триадимефона и триадименола проводят еще 2 раза тем же количеством хлороформа. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 г). Раствор сливают через бумажный фильтр в круглодонную колбу вместимостью 250 мл. Сульфат натрия промывают небольшими порциями хлороформа (10 — 12 мл) и сливают фильтрат в круглодонную колбу. Из объединенного раствора с помощью ротационного вакуумного испарители полностью отгоняют растворитель. К сухому остатку пипеткой добавляют 2 — 3 мл четыреххлористого углерода и проводят очистку на колонке с оксидом алюминия и все последующие операции, как описано выше для экстракции из картофеля.
Методы аналитического определения. Метод ГЖХ. В хроматограф вводят 1 — 3 мкл полученного раствора.
Условия хроматографирования. Хроматограф «Цвет-106» с ТИД и ДЭЗ.
Насадки колонок: I колонка — 3% SE-30 на хроматоне N-супер (0,20 — 0,26 мм); II колонка — 5% SE-30 на хроматоне N-AW (0,125 — 0,160 мм); III колонка — 5% XE-60 на хроматоне N-AW-DMCS (0,20 — 0,25 мм); IV колонка — 3% карбовакса 20 М на хроматоне N-AW-HMDS (0,20 — 0,25 мм). Конкретные параметры работы устанавливаются в зависимости от применяемого прибора. Ниже представлены условия хроматографирования на приборе «Цвет-106» с ТИД и ДЭЗ на различных колонках (табл. 115).
| Параметры | ТИД, 3% SE-30 | ДЭЗ, 5% SE-30 | ТИД, 5% XE-60 | ТИД, 5% карбовакса 20 М |
|---|---|---|---|---|
| Длина и внутренний диаметр колонки, см x мм | 150 x 3 -10 | 100 x 3 -10 | 110 x 3 -10 | 110 x 3 -10 |
| Рабочая шкала электрометра, А | 2 x 10 | 2 x 10 | 2 x 10 | 2 x 10 |
| Скорость протяжки ленты самописца, мм/ч | 240 | 240 | 240 | 240 |
| Скорость потока азота, мл/мин. | 60 | 43 | 30 | 75 |
| Скорость потока водорода, мл/мин. | 15 | - | 13 — 14 | 13 — 14 |
| Скорость потока воздуха, мл/мин. | 400 | - | 400 | 400 |
| Температура, °C: | ||||
| колонки | 220 | 220 | 220 | 190 |
| испарителя | 220 | 240 | 230 | 200 |
| детектора Объем вводимой пробы, мкл | - 3 | 250 1 — 2 | - 3 | - 3 |
| Время удерживания триадимефона | 2 мин. 37 с | 2 мин. | 35 мин. 35 с | 1 мин. 55 с |
| То же, триадименола | 3 мин. 25 с | - | 5 мин. 50 с | 4 мин. 43 с |
| Линейный диапазон определения, нг: | ||||
| триадимефона | 1 — 40 | 0,5 — 10 | 2 — 50 | 1 — 30 |
| триадименола | 2 — 80 | - | 3 — 70 | 3 — 70 |
Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пика при работе на ТИД и методом абсолютной калибровки по градуировочному графику при работе на ДЭЗ.
Для определения остаточных количеств пестицидов методом ТСХ ацетоновый раствор концентрируют на горячей водяной бане до объема 0,05 мл. Оставшуюся каплю количественно, при помощи стеклянного капилляра, наносят на пластинку
"Силуфол". Справа и слева от рабочей пробы стеклянным капилляром наносят серию стандартов препаратов с содержанием 1; 2; 3; 4; ...; 8 мкг, которые готовят следующим образом. Из стандартного раствора триадимефона и триадименола с содержанием 10 мкг/мл в пробирки с оттянутым носиком пипеткой вносят последовательно 0,1; 0,2; 0,3; 0,4; ...; 0,8 мл и концентрируют растворы на горячей водяной бане до объема 0,05 мл.
Сконцентрированные стандарты наносят на пластинку аналогично рабочей пробе.
Пластинку помещают в хроматографическую камеру и развивают хроматограмму в системе растворителей бензол-этилацетат (3:1), гексан-ацетон (4:1). После окончания хроматографирования пластинку сушат на воздухе, а затем опрыскивают из пульверизатора проявляющим реагентом до появления синего фона на пластинке, после чего опрыскивают пластинку 1-процентным раствором
лимонной кислоты. Триадимефон и триадименол проявляются на пластинке в виде синих пятен на лимонно-желтом фоне с R 0,12 +/- 0,03 и 0,78 +/- 0,09 в f первой системе растворителей, R 0,28 +/- 0,05 и 0,56 +/- 0,05 — во второй. f
Пятна стабильны в течение 5 - 7 мин. Линейность определения сохраняется в пределах 1 - 8 мкг. При более высокой концентрации хроматографируют
аликвотную часть раствора.
Обработка результатов анализа. Газохроматографическое определение. При работе на ТИД содержание триадимефона и триадименола в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:
C H V
ст пр 2
где:
C — количество стандарта, введенного в хроматограф, нг; ст
H , H - высоты пиков соответственно рабочей пробы и стандарта, мм; пр ст V - общий объем рабочего раствора, мл;
2
V — объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл; 1
P — навеска или объем анализируемого образца, г или мл.
При работе на ДЭЗ расчет результатов определения проводят по формуле:
AV
2
A — количество триадимефона, найденное в хроматографической пробе по градуировочному графику, нг.
Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики или происходит «зашкаливание», к рабочему раствору пипеткой добавляют известное количество ацетона и анализируют более разбавленный раствор.
Определение методом тонкослойной хроматографии. Количественно триадимефон и триадименол в пробе определяют путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов. При большом содержании триадимефона на пластинку наносят аликвотную часть раствора из 0,5 мл рабочей пробы. Содержание триадимефона в анализируемой пробе (X, мг/кг или мг/л) вычисляют по формуле:
AV
2
где:
A — количество триадимефона, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;
V — общий объем раствора, из которого отбирают аликвоту для 2 хроматографирования, мл;
V — объем аликвоты, нанесенной на хроматографическую пластинку, мл 1
(при нанесении всей пробы V = V );
1 2
P — навеска или объем анализируемой пробы, г или мл.
Требования безопасности. Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями и токсическими веществами.