Методические рекомендации по ускоренному определению коли-индекса воды с помощью систем индикаторных бумажных (СИБ)
(утв. Минздравом СССР 17.12.1982 № 2637-82)
17 декабря 1982 г. № 2637-82
МЕТОДИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ ПО УСКОРЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ КОЛИ-ИНДЕКСА ВОДЫ С ПОМОЩЬЮ СИСТЕМ ИНДИКАТОРНЫХ БУМАЖНЫХ (СИБ)
Методические рекомендации разработаны в спецлаборатории эпидотдела Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии МЗ РСФСР.
Рекомендованы к утверждению Лабораторным советом при Главном санитарно-эпидемиологическом управлении Министерства здравоохранения СССР.
Введение
Важная роль санитарно-микробиологического контроля окружающей среды в профилактике кишечных инфекций обуславливает актуальность разработки новых и совершенствования существующих методов индикации санитарно-показательной микрофлоры.
Как известно, показателем степени фекального загрязнения служит количество бактерий группы кишечных палочек, определяемое в 1 л воды (коли-индекс). В частности, проведение санитарно-бактериологического анализа питьевой воды регламентировано в настоящее время Государственным стандартом Союза ССР ГОСТ 18963-73 и подготовленным к утверждению ГОСТ «Вода питьевая: Полевые методы санитарно-микробиологического исследования». В качестве этапа накопления бактерий используют методы бродильный или мембранных фильтров, после чего производят выращивание микроорганизмов на дифференциальных диагностических лактозосодержащих средах типа Эндо. Для дальнейшего исследования отбирают колонии, характерные для бактерий группы кишечных палочек, которые идентифицируют по ограниченному количеству ключевых тестов: к кишечным палочкам относят грамотрицательные, не обладающие оксидазной активностью, не образующие спор бактерии, сбраживающие глюкозу с образованием кислоты и газа.
Существенная роль в этом анализе отводится оксидазному тесту, предназначенному для дифференциации бактерий семейства Enterobacteriaceal от других грамотрицательных водных сапрофитов, обладающих активной оксидазой. Таким образом, этот тест исключает ошибку в сторону увеличения коли-индекса. Оксидазная проба проста по выполнению, но для ее постановки требуются реактивы, которые не всегда имеются в практических лабораториях: диметил-н-фенилендиамин и альфа-нафтол. Одним из условий достоверности получаемых результатов является частая смена реактивов: действующий ГОСТ допускает их использование лишь в день приготовления.
Принадлежность оксидазоотрицательных колоний к бактериям группы кишечных палочек подтверждают по ферментации глюкозы.
Таким образом, при санитарно-бактериологическом исследовании воды широкое использование имеют два биохимических теста — определение оксидазной активности и характер ферментации глюкозы.
На основании широко проведенных экспериментально-практических исследований для выявления оксидазной активности и характера ферментации глюкозы микроорганизмами, выделяемыми в ходе санитарно-бактериологических анализов воды, рекомендуется использование систем индикаторных бумажных (СИБ) изготовления Горьковского НИИ эпидемиологии и микробиологии взамен обычно применяемых реактивов и дифференциально-диагностической среды.
1. Системы индикаторные бумажные (СИБ) для постановки оксидазного теста и ферментации глюкозы — ТУ-42.14.128-78.
2. Среда Эндо сухая — ГОСТ Дагестанского НИИ питательных сред.
3. Питательный агар щелочной сухой — Московского НИИ вакцин и сывороток им. Мечникова.
4. Питательный бульон pH 7,4 — 7,8.
5. Дистиллированная вода — ГОСТ 6709-72.
6. Чашки бактериологические Петри — ГОСТ 7900-56.
7. Пробирки бактериологические — ГОСТ 10515-63.
8. Термостат с терморегулятором — +37° +/- 1,0°.
9. Холодильник с терморегулятором — +4 — 6 °C.
10. Спиртовки лабораторные — ГОСТ 10090-82.
11. Бактериологическая петля из нихромовой проволоки диаметром 0,3 — 0,5 мм — ГОСТ 492-73.
12. Спирт этиловый — ректификат - ГОСТ 5962-67.
Характеристика систем индикаторных бумажных (СИБ)
Системы индикаторные бумажные представляют собой полоски или диски хроматографической бумаги, пропитанные соответствующими субстратами и индикаторами и покрытые для стабилизации пленкообразующим полимером — водным раствором поливинилового спирта.
Система индикаторная бумажная с глюкозой представляет собой диск диаметром 0,8 — 1,0 см. СИБ для определения оксидазы — в виде полосок размером 8 см х 1 см или дисков диаметром 3,5 — 4 см. Срок годности СИБ указан на этикетках (2 года).
Способы применения
Постановка оксидазного теста с помощью СИБ-оксидаза при работе бродильным методом
По 2 — 3 изолированных колонии каждого типа, выросших на секторах чашки со средой Эндо, снимают частично петлей и наносят на полоску СИБ-оксидазы (полоску помещают в чашку Петри). Оставшуюся часть колонии используют для изучения ферментации глюкозы. При положительной реакции на месте нанесения культуры бумажка синеет в течение одной минуты. При отрицательной — цвет бумажной полоски не изменяется. В ряде случаев оксидазный тест со среды Эндо проявляется недостаточно четко, особенно при исследовании колоний, окрашенных в темно-красный цвет. В таких случаях нужно пересеять колонии со среды Эндо на сектор чашки с питательным агаром или на скошенный питательный агар и после подращивания при температуре 37° +/- 1,0° в течение 3 — 5 часов пробу повторить.
Постановка оксидазного теста с помощью СИБ-оксидаза при работе методом мембранных фильтров
Мембранный фильтр с выросшими на нем колониями переносят пинцетом не переворачивая на бумажный диск СИБ-оксидазу диаметром 3,5 — 4 см (по наиболее принятому размеру фильтра), который предварительно рекомендуется смочить стерильной дистиллированной водой. Через 2 — 4 минуты определяют результат. Все посиневшие колонии, а также колонии с синим ободком не относятся к семейству Enterobacteriaceal, их не учитывают. Мембранный фильтр сразу же после четкого проявления реакции переносят обратно на среду Эндо и немедленно (не позднее пяти минут} отсевают оксидазоотрицательные колонии по 2 — 3 колонии каждого типа для определения ферментации глюкозы.
Определение характера ферментации глюкозы
А. На плотной питательной среде (чашечный метод).
В чашку Петри тонким слоем наливают 2% щелочной агар pH 7,2 — 7,8 (не ниже 7,2). Подозрительные на кишечную палочку колонии засевают петлей на сектор чашки по ее периферии. На одной чашке могут быть исследованы до 6 — 8 культур. На место посева (площадка около 0,5 кв. см) накладывают диск с глюкозой. Для улавливания газообразования и фиксации диска последний заливают несколькими каплями расплавленного и остуженного до 40 — 45° полужидкого агара (0,6 — 0,8%). Инкубируют при температуре 37° +/- 1,0°. При разложении глюкозы до образования кислоты цвет диска меняется из красного в желтый. При наличии газообразования пузырьки газа скапливаются по краям диска и между диском и агаром. Результаты учитывают в течение 3 — 5 часов. Скорость реакции зависит от посевной дозы и ферментативной активности культуры. После 5 — 6 часов учитывать результаты реакции в ряде случаев затруднительно, так как спустя этот срок начинается подщелачивание среды за счет протеолиза белков, желтая зона вновь розовеет и приобретает первоначальный цвет.
В качестве контроля необходимо использовать диск без посева культуры. Красный цвет его не меняется. Различие в цвете контрольных и опытных дисков служит для сравнения при учете реакции.
Б. В жидкой питательной среде (пробирочный метод).
В пробирки с предварительно разлитым по 0,3 — 0,5 мл и подогретым до 37° питательным бульоном (pH 7,4 — 7,8) вносят петлей колонию изучаемой культуры и погружают диск с глюкозой. Среда в пробирках в результате быстрой диффузии в нее индикатора, импрегнированного в бумаге, становится красной. При ферментации глюкозы через 3 — 5 часов инкубации в термостате при температуре 37° +/- 1,0° среда приобретает желтый или оранжевый цвет, а у газообразующих культур на ее поверхности появляются пузырьки газа. Желтый или оранжевый цвет среды, как правило, сохраняется в течение 18 — 24 часов, пузырьки же газа к этому времени исчезают. В случае необходимости учета результатов на следующий день рекомендуется использовать погружение в среду небольшого клочка гигроскопической ваты или поплавок. Чем больше засеяно культуры, тем быстрее происходит ферментация глюкозы.
При определении индекса кишечных палочек выявление ферментации глюкозы является решающим, поэтому получение ответа через 4 — 5 часов имеет несомненное практическое значение.
1. Исследования проводят с чистой культурой.
2. Аппликацию дисков с глюкозой на чашки или погружение их в пробирки производят обожженным пинцетом.
3. Критерием правильности учета реакции СИБ с глюкозой должны быть четкие различия в окраске по сравнению с контролем (диск без посева культуры).
4. Для определения активности оксидазы можно использовать тот же сектор чашки, на котором изучается ферментация глюкозы. Дополнительный посев культуры при этом рекомендуется проводить на участке сектора, расположенного ближе к центру чашки.
5. Основные дефекты при применении СИБ с глюкозой зависят от несоблюдения режима pH: при использовании посуды, обработанной различными порошками и недостаточно отмытой, несоответствии фактических данных pH физиологического раствора, сухих сред с указанными на этикетках и т.п.
6. Для ускоренного получения результатов необходимо соблюдение стабильного температурного режима термостата (37° +/- 1 °C).
Заключение и оценка полученных данных
Таким образом, использование готовых к употреблению систем индикаторных бумажных (СИБ), в которых депонированы все необходимые для идентификации микроорганизмов ингредиенты, позволяет рационализировать и стандартизовать определение коли-индекса воды, в первую очередь питьевой, как на этапах очистки, так и для контроля за санитарно-техническим состоянием централизованного снабжения.
Преимущества СИБ по сравнению с общепринятыми методами заключаются в простоте и ускорении анализа, исключении этапа приготовления реактивов для определения оксидазы, а следовательно, и потребности в дефицитных ингредиентах. Особое значение приобретает работа с СИБ при выполнении анализов в полевых условиях вне стационарной лаборатории.
Заказы на наборы СИБ для определения коли-индекса воды (с указанием реквизитов) следует направить по адресу: Москва, 103012, ул. 25 Октября, 19. Управление ИЭМ и ПВС МЗ РСФСР.