Методы выявления патогенных микроорганизмов с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов производства Merck (Германия). Методические рекомендации
(утв. Минздравом России 04.03.2004 № 24ФЦ/976)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563). Документ введен в действие с 04.03.2004.
Утверждаю Заместитель Главного государственного санитарного врача Российской Федерации — Главный врач Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е. Н. Беляев 4 марта 2004 г. № 24ФЦ/976
Дата введения: 4 марта 2004 года
МЕТОДЫ ВЫЯВЛЕНИЯ ПАТОГЕННЫХ МИКРООРГАНИЗМОВ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИХ ЭКСПРЕСС-ТЕСТОВ ПРОИЗВОДСТВА MERCK (ГЕРМАНИЯ)
1. Разработаны: Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (Брагина И.В., Кривопалова Н.С, Минаева Н.А.), Всероссийским научно-исследовательским институтом ветеринарной вирусологии и микробиологии (Котляров В.М., Фирсова Т.Е., Чевелева С.С.), МУП «Уфаводоканал» (Кантор Л.И., Труханова Н.В., Майтова Р.Ф.), центром госсанэпиднадзора в Южном Административном округе г. Москвы (Митрофанова Т.А., Чернявский Г.И., Гудков А.А.), фирмой «Лаб-БиоМед» (Соколов Д.М., Кашинцев И.В.).
2. Утверждены и введены в действие Заместителем главного государственного санитарного врача Российской Федерации — Главным врачом Федерального центра госсанэпиднадзора Минздрава России Е.Н. Беляевым 04.03.2004 г.
1. Общие положения и область применения
1.1. Настоящие методические рекомендации устанавливают методы проведения лабораторных исследований по выявлению бактерий рода Salmonella, Listeria monocytogenes, Campylobacter, E. coli O157:H7, веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli с использованием иммунохроматографических экспресс-тестов Singlepath^{®} и Duopath^{®} в пищевых продуктах и продовольственном сырье, водных объектах окружающей среды и биоматериале от человека.
1.2. Методические рекомендации разработаны в соответствии с Федеральным законом «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения», Положением о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании, Положением о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации.
1.3. Методические рекомендации предназначены для применения в лабораториях организаций, независимо от форм собственности, осуществляющих производственный контроль продовольственного сырья и пищевых продуктов в лабораториях учреждений государственной санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации и санитарно-эпидемиологической службы федеральных органов исполнительной власти, осуществляющих государственный и ведомственный контроль, а также в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения испытаний указанной продукции для целей сертификации.
2. Нормативные ссылки
2.1. Федеральный закон «О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения» № 52-ФЗ от 30 марта 1999 г.
2.2. Закон РФ «О защите прав потребителей» от 7 февраля 1992 г.
2.3. Закон РФ «О качестве и безопасности пищевых продуктов» № 29-ФЗ от 2 января 2000 г.
2.4. «Положение о государственной санитарно-эпидемиологической службе Российской Федерации», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.
2.5 «Положение о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании», утвержденное Постановлением Правительства Российской Федерации № 554 от 24 июля 2000 г.
2.6. СП 1.2.731-99 Безопасность работы с микроорганизмами III — IV групп патогенности и гельминтами.
2.7. ГОСТ 26668-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Порядок отбора проб для микробиологических анализов».
2.8. ГОСТ 26669-85 «Продукты пищевые и вкусовые. Подготовка проб для микробиологических анализов».
2.9. ГОСТ 26670-91 «Продукты пищевые. Методы культивирования микроорганизмов».
2.10. ГОСТ Р 51446-99 (ИСО 7218-96) «Микробиология. Продукты пищевые. Общие правила микробиологических исследований».
2.11. ГОСТ 30519-97/ГОСТ Р 50480-93 «Продукты пищевые. Методы выявления бактерий рода Salmonella.»
2.12. МУ 2.1.5.800-99 Организация госсанэпиднадзора за обеззараживание сточных вод.
2.13. МУК 4.2.992-00 от 04.11.2000 г. Методы выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E. coli O157-H7
2.14. ГОСТ 51921-2002 Продукты пищевые. Методы выявления и определения бактерий Listeria monocytogenes.
2.15. МУК 4.2.1122-02 Организация контроля и методы выявления бактерий Listeria monocytogenes в пищевых продуктах.
2.16. МУ № 04-23/3 от 17.12.84 г. Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний вызываемых энтеробактериями.
2.17. Инс. № 15-6/28 от 21.11.89 г. Инструкция по клинической и лабораторной диагностике кампилобактериоза.
2.18. ГОСТ 19569-89 Стерилизаторы паровые медицинские. Общие технические требования и методы испытаний.
2.19. ГОСТ 24104-2001 Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.
2.20. ГОСТ 29227-91 Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Часть 1. Общие требования.
2.21. ГОСТ 16317-87 Приборы холодильные электрические бытовые. Общие технические условия.
2.22. ГОСТ 25336-82 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.
2.23. ГОСТ 23932-90 Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Общие технические условия.
2.24. ГОСТ 18300-87 Спирт этиловый ректификованный. Технические условия.
3. Требования к помещениям и технике безопасности
3.1. Требования безопасности, общее расположение лаборатории, а также ее инфраструктура должны удовлетворять требованиям СП 1.2.731, ГОСТ Р 51446.
3.2. Лаборатория должна иметь разрешение на работу с микроорганизмами III — IV групп патогенности.
4. Аппаратура, материалы, питательные среды и экспресс-тесты <*>
<*> Производство питательных сред и экспресс-тестов компании Merck KGaA (Германия) имеет международный сертификат качества ISO 9001:2000.
| 4.1. | Термостат электрический с диапазоном измерения от 15 до 65 °C с допустимой погрешностью регулирования температуры +/- 1 °C. | ТУ 64-1-1382-83 |
| 4.2. | Автоклав или стерилизатор паровой медицинский. | ГОСТ 19569 |
| 4.3. | Шкаф сушильно-стерилизационный, обеспечивающий поддержание заданного температурного режима в диапазоне от 50 до 200 °C с погрешностью +/- 2 °C. | |
| 4.4. | Гомогенизатор бактериологический перистальтического типа Masticator (или аналогичный) со стерильными полиэтиленовыми пакетами. | |
| 4.5. | Облучатель бактерицидный | |
| 4.6. | Весы лабораторные с наибольшим пределом взвешивания 200 г и допустимой погрешностью +/- 2 мг | ГОСТ 24104 |
| 4.7. | Холодильник позволяющий поддерживать температуру +2 — 4 °C | ГОСТ 16317 |
| 4.8. | Водяная баня с терморегулятором, позволяющая поддерживать температуру 100 +/- 2 °C. | ТУ 42-22-608-75 |
| 4.9. | Пипетки градуированные исполнения 1, 2 классов точности вместимостью 1 см3, 10 см3. | ГОСТ 29227 |
| 4.10. | Пробирки бактериологические вместимостью не менее 10 см3 | ГОСТ 25336 |
| 4.11. | Посуда широкогорлая | ГОСТ 25336 |
| 4.12. | Singlepath^{®} - Listeria тест | Merck, Cat. № 1.04142.0001 |
| 4.13. | Бульон Фразера — Fraser broth | |
| 4.13.1. | Основа бульона Фразера — Fraser Listeria Selective Enrichment Broth (base) | Merck, Cat. № 1.10398.0500 |
| 4.13.2. | Селективная добавка для бульона Фразера — Fraser Listeria Supplement | Merck, Cat. № 1.10399.0001 |
| 4.14. | Забуференный бульон для обогащения листерий — Buffered Listeria Enrichment Broth (BLEB) | |
| 4.14.1. | Основа забуференного бульона для обогащения листерий — Listeria Enrichment Broth, buffered (base) | Merck, Cat. № 1.11781.0500 |
| 4.14.2. | Селективная добавка к бульону для обогащения листерий — Listeria Selective Enrichment Supplement | Merck, Cat. № 1.11781.0001 |
| 4.15. | ПАЛКАМ агар — PALCAM Agar | |
| 4.15.1. | Основа ПАЛКАМ агара — PALCAM Listeria Selective Base | Merck, Cat. № 1.11755.0500 |
| 4.15.2. | Селективная добавка для ПАЛКАМ агара — PALCAM Listeria Selective Supplement | Merck, Cat. № 1.12122.0001 |
| 4.16. | ОКСФОРД агар — OXFORD Agar | |
| 4.16.1. | Основа Оксфорд агара — Oxford Listeria Selective Agar Base | Merck, Cat. № 1.07004.0500 |
| 4.16.2. | Селективная добавка для Оксфорд агара — Oxford Listeria Selective Supplement | Merck, Cat. № 1.07006.0001 |
| 4.17. | Singlepath^{®} - Salmonella тест | Merck, Cat. № 1.04140.0001 |
| 4.18. | Забуференная пептонная вода — Peptone water (buffered) | Merck, Cat. № 1.07228.0500 |
| 4.19. | Селективная среда Раппапорт-Василиадис (магниевая) — Selective Enrichment Broth Rappaport-Vassiliadis (RVS) | Merck, Cat. № 1.07700.0500 |
| 4.20. | Селенитовая среда — Selenite Enrichment Broth Leifson | Merck, Cat. № 1.07717.0500 |
| 4.21. | Тетратионатная среда — Tetrathionate Broth Muller-Kauffmann | Merck, Cat. № 1.10863.0500 |
| 4.22. | РАМБАХ агар — RAMBACH^{®} Agar | Merck, Cat. № 1.07500.0001 |
| 4.23. | Salmosyst^{®} бульон — Salmosyst® Broth Base | Merck, Cat.N1.10153.0500 |
| 4.24. | Salmosyst^{®} селективная добавка — Salmosyst® Selective Supplement | Merck, Cat. № 1.10141.0001 |
| 4.24. Singlepath^{®} - E.coli O157 тест | ||
| Merck, | Cat. № 1.04141.0001 | 4.25. Модифицированный EC бульон с новобиоцином — mEC Broth with Novobiocin (mEC) |
| Merck, | Cat. № 1.14582.0500 | 4.26. Модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином — mTryptic-Soy-Broth with Novobiocin (mTSBN) |
| Merck, | Cat. № 1.09205.0500 | 4.27. Агар Мак-Конки с сорбитолом — Sorbitol-MacConkey Agar (SMAC Agar) |
| Merck, | Cat. № 1.09207.0500 | 4.28. Singlepath^{®} - Campylobacter тест |
| Merck, | Cat. № 1.04141.0001 | 4.29. Селективный бульон Болтона — Bolton Selective Enrichment Broth |
| 4.29.1. | Основа селективного бульона Болтона — Bolton Selective Enrichment Broth | |
| Merck, | Cat. № 1.00068.0500 | 4.29.2. Селективная добавка для бульона Болтона — Bolton Broth Selective Supplement |
| Merck, | Cat. № 1.00069.0001 | 4.30. Газогенерирующие пакеты — Anaerocult-C |
| Merck, | Cat. № 1.16275.0001 | 4.31. Campylobacter селективный агар — Campylobacter Selective Agar |
| 4.31.1. | Основа для Campylobacter селективного агара — Campylobacter Selective Agar Base | |
| Merck, | Cat.N1.02248.0500 | 4.31.2. Селективная добавка для Campylobacter селективного агара — Campylobacter Selective Supplement |
| Merck, | Cat. № 1.02249.0001 | 4.32. Duopath^{®} - Verotoxins тест |
| Merck, | Cat. № 1.04144.0001 | 4.33. Агар Мак-Конки с сорбитолом усиленной селективности — CT-SMAC Agar |
| 4.33.1 | Агар Мак-Конки с сорбитолом — (SMAC agar) | |
| Merck, | Cat. № 1.09207.0500 | 4.33.2. Селективная добавка для CT-SMAC-агара — CT-Supplement |
| Merck, | Cat. № 1.09202.0001 | 4.34. CAYE бульон — CAYE Broth |
| 4.34.1. | Основа CAYE бульона — CAYE Broth Base | |
| Merck, | Cat. № 1.00060.0100 | 4.34.2. Добавка (индуктор) к основе CAYE бульона — CAYE broth Supplement |
| Merck, | Cat. № 1.00051.0001 | 4.35. Раствор полимиксина 0.5% |
| Merck, | Cat. № 1.09875.0001 | Допускается использование оборудования импортного производства аналогичного назначения. |
5. Описание и принцип действия экспресс-тестов
Иммунохроматографические экспресс-тесты Singlepath и Duopath предназначены для выявления бактерий рода Salmonella, Listeria, E. coli O157 и веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli.
Экспресс-тесты представляет собой диагностическую тест-панель с лункой для внесения образца, и окном с тестовой и контрольной зонами. Экспресс-тест содержит иммобилизованные на подложке меченые золотом антитела, обладающие высокой специфичностью к определяемым бактериям или веротоксинам.
Принцип действия экспресс-тестов основан на методе визуальной иммунохроматографии — разновидности иммуноферментного анализа. Антигены определяемых бактерий или веротоксинов, присутствующие в исследуемом образце, взаимодействуют с мечеными золотом антителами с образованием комплекса антиген-антитело. При прохождении по подложке теста комплекс антиген-антитело связывается с иммобилизованными антителами с образованием красных линий в тестовой и контрольной зонах.
6. Сущность метода
Метод выявления бактерий рода Salmonella, Listeria, E. coli O157:H7 и веротоксинов энтерогеморрагических штаммов E. coli основан на визуальном определении наличия линий в тестовой и контрольной зонах Singlepath и Duopath тестов при исследовании предварительно обогащенного образца.
7. Методы отбора и подготовки проб
Отбор и подготовку проб проводят в соответствии с ГОСТ 26668, ГОСТ 26669 и другими действующими ГОСТ и НД на анализируемый вид образцов. Биоматериал — в соответствии с МУ № 04-23/3.
8. Выявление бактерий Listeria monocytogenes
8.1 Используемые тесты и питательные среды
8.1.1 Singlepath-Listeria тест (4.12).
8.1.2 Бульон Фразера (п. 4.13).
8.1.3. Забуференный бульон для обогащения листерий (BLEB) (п. 4.14).
8.1.4 ПАЛКАМ агар (п. 4.15).
8.1.5 ОКСФОРД агар (п. 4.16).
Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.
8.2 Предварительное селективное обогащение.
Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см3 вносят в 225 см3 бульона Фразера половинной концентрации (п. 8.1.2). При необходимости анализа других масс (объемов) образца их посев проводят в бульон Фразера половинной концентрации в соотношении 1:9 по объему.
Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).
Посевы инкубируют при температуре (30 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч.
8.3 Селективное обогащение
0,1 см3 обогащенной культуры после инкубирования по п. 8.2, перенести в 9,9 см3 бульона Фразера (п. 8.1.2) или забуференного бульона для обогащения листерий (BLEB) (8.1.3).
Посевы инкубировать при температуре (30 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч.
8.4 Инактивация
1 — 2 см3 культуры, полученной после селективного обогащения по п. 8.3 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 80 °C в течение 20 мин.
Оставшуюся после селективного обогащения культуру (п. 8.3) использовать для подтверждения положительных результатов.
8.5 Singlepath-тестирование
Инактивированную культуру по п. 8.4. охладить до комнатной температуры. Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 8.1.1).
Примечание: тестирование провести не позднее 2 часов после вскрытия индивидуальной упаковки теста.
Считать результаты через 20 минут. Проверить наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.
Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Примечание: нижний предел чувствительности метода — 104 — 106 бактерий/см3.
Положительные результаты подтвердить, используя дифференциально-диагностические среды — ПАЛКАМ агар (п. 8.1.4) или ОКСФОРД агар (п. 8.1.5), в соответствии ГОСТ Р 51921 или МУК 4.2.1122.
Испытания проводить по схеме № 1.
Выявление Listeria monocytogenes с использованием экспресс-тестов Singlepath
9. Выявление бактерий рода Salmonella
9.1 Используемые тесты и питательные среды
9.1.1 Singlepath-Salmonella тест (п. 4.17)
9.1.2 Забуференная пептонная вода (п. 4.18).
9.1.3 Среда Раппапорт-Василиадис (магниевая) (п. 4.19).
9.1.4 Селенитовая среда (4.20).
9.1.5 Тетратионатная среда (4.21).
9.1.6 РАМБАХ-агар (п. 4.22).
9.1.7 Salmosyst (п. 4.23).
9.1.8 Salmosyst селективная добавка (п. 4.24).
Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.
9.2 Неселективное обогащение
Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см3 вносят в 225 см3 забуференной пептонной воды (п. 9.1.2). При необходимости анализа других масс (объемов) образца их посев проводят в забуференную пептонную воду в соотношении 1:9 по объему.
Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).
Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч
9.3 Селективное обогащение
0,1 см3 обогащенной культуры после инкубирования по п. 9.2 перенести в 9,9 см3 среды Раппапорт-Василиадис (п. 9.1.3).
Посевы инкубировать при температуре (41 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч
9.4 Инактивация
1 — 2 см3 культуры, полученной после селективного обогащения по п. 9.3 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 100 °C в течение 15 мин.
Оставшуюся после обогащения по п. 9.3 культуру использовать для подтверждения положительных результатов.
9.5 Singlepath-тестирование
Инактивированную культуру по п. 9.4. охладить до комнатной температуры.
Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 9.1.1).
Примечание: тестирование провести не позднее 2 часов после вскрытия индивидуальной упаковки теста.
Считать результаты через 20 минут.
Проверить наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.
Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Примечание: нижний предел чувствительности метода 104 — 107 бактерий/см3.
Положительные результаты подтвердить, используя хромогенную среду РАМБАХ-агар (п. 9.1.6), с последующей идентификацией сальмонелл по ГОСТ 30519.
Испытания проводить по схеме № 2.
Выявление бактерий рода Salmonella с использованием экспресс-тестов Singlepath
Выявление бактерий рода Salmonella в водах поверхностных водоемов и сточных водах проводить по схеме № 3.
Выявление бактерий рода Salmonella в пробах воды с использованием экспресс-тестов Singlepath
Метод выявления бактерий рода Salmonella на хромогенной среде РАМБАХ-агар (п. 9.1.6) приведен в схеме № 4.
Выявление бактерий рода Salmonella с использованием хромогенной среды РАМБАХ-агар
Ускоренный метод выявления бактерий рода Salmonella с использованием селективной добавки Salmosyst (п. 9.1.7, п. 9.1.8) приведен на схеме № 5.
Ускоренный метод выявления бактерий рода Salmonella с использованием среды Salmosyst
10. Выявление бактерий E. coli O157
10.1 Используемые тесты и питательные среды
10.1.1. Singlepath^{®} - E.coliO157 тест
10.1.2. Модифицированный EC бульон с новобиоцином — mEC (п. 4.25).
10.1.3. Модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином — mTSBN (п. 4.26).
10.1.4 Агар Мак Конки с сорбитолом — SMAC agar (4.27).
10.1.5. Агар Мак-Конки с сорбитолом усиленной селективности — CT-SMAC Agar (4.33).
Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.
10.2 Селективное обогащение
Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см3 вносят в 225 см3 модифицированный EC бульон с новобиоцином — mEC (п. 10.1.2) при исследовании мясных продуктов или модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином — mTSBN (п. 10.1.3) при исследовании молочных продуктов.
При необходимости анализа других масс (объемов) образцов их посев проводят в одну из селективных сред в соотношении 1:9 по объему.
Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).
Посевы инкубируют при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч
10.3 Инактивация
1 — 2 см3 культуры, полученной после предварительного обогащения по п. 10.2 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 100 °C 15 мин.
10.4 Singlepath-тестирование
Инактивированную культуру по п. 10.3. охладить до комнатной температуры.
Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 10.1.1).
Примечание: тестирование провести не позднее 2 часов после вскрытия индивидуальной упаковки теста.
Считать результаты через 20 минут. Проверить на наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.
Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Примечание: нижний предел чувствительности метода 104 — 106 бактерий/см3.
Положительные результаты подтвердить, используя SMAC-агар (п. 10.1.4) или CT-SMAC-агар (10.1.5), с последующей идентификацией в соответствии с МУК 4.2.992.
Испытания проводить по схеме № 6.
Выявление бактерий рода E. coli O157 с использованием экспресс-тестов Singlepath
11. Выявление бактерий рода Campylobacter
11.1 Используемые тесты и питательные среды
11.1.1. Singlepath^{®} - Campylobacter тест (п. 4.28)
11.1.2 Селективный бульон Болтона (п. 4.29)
11.1.3 Газогенерирующие пакеты — Anaerocult-C (4.30)
11.1.4 Campylobacter селективный агар (п. 4.31).
Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.
11.2 Селективное обогащение
Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см3 вносят в 225 см3 селективного бульона Болтона (п. 11.1.2);
При необходимости анализа других масс (объемов) образца их посев проводят в селективный бульон Болтона соотношении 1:9 по объему.
Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).
Объем воздуха во флаконе (пробирке) после посева не должен превышать 10 — 15%. Если объем воздушного пространства превышает 15%, то культивирование ведут в микроаэрофильных условиях, используя для этого газогенерирующие пакеты Anaerocult-C (п. 11.1.3).
Посевы инкубируют в два этапа:
- первый этап при температуре (37 +/- 1) °C в течение 4 ч.
- второй этап при температуре (41 +/- 1) °C в течение (44 +/- 2) ч
11.3 Инактивация
1 — 2 см3 культуры, полученной после селективного обогащения по п. 11.2 перенести в пробирку. Инактивировать обогащенную культуру на водяной бане при температуре 100 °C в течение 15 мин.
Оставшуюся после обогащения по п. 11.2 культуру использовать для подтверждения положительных результатов.
11.3 Singlepath-тестирование
Инактивированную культуру по п. 11.3. охладить до комнатной температуры.
Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 11.1.1).
Примечание: тестирование провести не позднее 2 часов после вскрытия индивидуальной упаковки теста.
Через 20 минут считать результаты. Проверить наличие линий в тестовой (T) и контрольной (C) зонах Singlepath-теста.
Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (T), так и в контрольной (C) зоне.
Нижний предел чувствительности метода примерно 104 — 107 бактерий/см3.
Положительные результаты подтвердить, используя Campylobacter селективный агар (п. 11.1.4), с последующей идентификацией в соответствии с Инструкцией № 15-6/28.
Испытания проводить по схеме № 7.
Выявление бактерий рода Campylobacter с использованием экспресс-тестов Singlepath
12. Выявление веротоксинов VT1 и VT2 энтерогеморрагических штаммов E. coli.
11.2 Используемые тесты и питательные среды
11.2.1. Duopath^{®} - Verotoxins тест (п. 4.32)
11.2.2 Модифицированный EC бульон с новобиоцином — mEC Broth (п. 4.25)
11.2.3 Модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином — mTSBN (п. 4.26)
11.2.4. Агар Мак-Конки с сорбитолом усиленной селективности — CT-SMAC Agar (п. 4.33).
11.2.5 CAYE бульон (п. 4.34)
11.2.6 Раствор полимиксина 0.5% (п. 4.35)
Приготовление питательных сред проводят в соответствии с инструкциями фирмы изготовителя.
12.2 Селективное обогащение
Навеску анализируемого образца массой (25 +/- 0.1) г или объемом (25 +/- 0.1) см3 вносят в 225 см3 модифицированный EC бульон новобиоцином — mEC (п. 10.1.2) при исследовании мясных продуктов или модифицированный триптиказо-соевый бульон с новобиоцином — mTSBN (п. 10.1.3) при исследовании молочных продуктов.
При необходимости анализа других масс (объемов) образцов их посев проводят в одну из селективных сред в соотношении 1:9 по объему.
Твердые образцы измельчают в гомогенизаторе (п. 4.4).
Посевы инкубировать при температуре (41 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч
12.3 Выделение чистой культуры
После инкубирования по п. 12.2. обогащенную культуру пересеять на поверхность CT-SMAC агара (12.1.4).
Посевы инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение (21 +/- 3) ч
12.4 Индукция синтеза веротоксинов
После инкубирования по п. 12.3 внести 5 — 6 типичных колоний E. coli O157 в 1 см3 CAYE бульона (п. 12.1.5), содержащий индуктор синтеза веротоксинов.
Посевы инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение 6 часов.
12.5 Инактивация
Перенести 180 мкл культуры, полученной по п. 12.4 в пробирку-эппендорф. Добавить 20 мкл раствора полимиксина (п. 12.1.6) и перемешать.
Инкубировать при температуре (37 +/- 1) °C в течение 10 мин.
12.6 Duopath-тестирование
Инактивированную культуру по п. 12.5. охладить до комнатной температуры и перемешать с помощью миксера Vortex.
Перенести 160 мкл инактивированной культуры в лунку для внесения образца Singlepath-теста (п. 12.1.1).
Примечание: тестирование провести не позднее 2 часов после вскрытия индивидуальной упаковки теста.
Считать результаты через 20 минут. Проверить на наличие линий в тестовой (VT1 и VT2) и контрольной (C) зоне Duopath-теста.
Результат теста считается положительным, если красная линия присутствует как в тестовой (VT1 и/или VT2), так и в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается отрицательным, если красная линия присутствует только в контрольной (C) зоне.
Результат теста считается недействительным, если красная линия отсутствует как в тестовой (VT1 и VT2), так и в контрольной (C) зоне.
Испытания проводить по схеме № 8.
Выявление веротоксинов VT1 и VT2 энтерогеморрагических штаммов E. coli с использованием экспресс-тестов Duopath
