Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями

(утв. Минздравом СССР 17.12.1984 № 04-723/3)

ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ

flowchart LR
  n0["Инструкция по микробиологической диагностике... (от 11.05.1966 N 629-66)"]:::doc
  n1["Методические указания по микробиологической... (от 17.12.1984 N 04-723/3)"]:::doc
  click n1 "https://bukva.ai/docs/04-7233" "Методические указания по микробиологической диагностике заболеваний, вызываемых энтеробактериями (утв. Минздравом СССР 17.12.1984 N 04-723/3)"
  n0 --> n1
classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000;
classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000;
classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000;

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКЕ ЗАБОЛЕВАНИЙ,

Методические указания разработаны:

Центральным Ордена Ленина институтом усовершенствования врачей Минздрава СССР;

Центральным научно-исследовательским институтом эпидемиологии Минздрава СССР;

Центральным научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток имени И.И. Мечникова Минздрава СССР;

санитарно-эпидемиологической станцией Московской железной дороги.

ВВЕДЕНИЕ

За последние 15 — 20 лет в научных и практических учреждениях нашей страны предложены и апробированы эффективные и научно обоснованные методы выделения и идентификации энтеробактерий. Разработаны и частично внедрены в производство новые диагностические препараты: питательные среды, сыворотки, высокоспецифические диагностикумы, системы для ускоренной идентификации, препараты бактериофагов и некоторые другие реагенты.

В представленный документ включены методы классической бактериологической диагностики заболеваний, вызываемых энтеробактериями, ускоренные методы идентификации и выявления антигенов энтеробактерий, а также методы серологической диагностики соответствующих заболеваний и сведения о приготовлении ряда необходимых питательных сред.

«Методические указания...» преследуют цель унификации методов проведения лабораторной диагностики с применением современных приемов, позволяющих идентифицировать любые из известных в данное время представителей энтеробактерий <*>. Внедрение в практику данных Методических указаний будет способствовать повышению уровня микробиологической диагностики в стране.

<*> «Инструкцию по микробиологической диагностике кишечных заболеваний, вызванных шигеллами, сальмонеллами и энтеропатогенными кишечными палочками», утв. нач. ГСЭУ Минздрава СССР 11.05.66 № 629-66, считать утратившей силу.

В «Методических указаниях...» представлены также разделы по определению эпидемиологических маркеров штаммов энтеробактерий.

Принятые в тексте сокращения:

УПЭ — условно патогенные энтеробактерии;

ЭПЭ — энтеропатогенные эшерихии;

ЭМС — агар с эозин-метиленовым синим;

ВСА — висмут-сульфит агар;

ИХН — изотонический раствор хлорида натрия;

СПА — слабощелочной питательный агар;

СПБ — слабощелочной питательный бульон;

РПГА — реакция пассивной гемагглютинации.

Общее примечание.

1. Идентификацию выделенных энтеробактерий по биохимическим свойствам до уровня рода и вида проводят во всех бактериологических лабораториях санитарно-эпидемиологических станций и лечебно-профилактических учреждений.

2. Серологическую идентификацию шигелл до уровня сероваров (и подсероваров), сальмонелл — до сероваров, энтеропатогенных эшерихий — до OK-серогрупп проводят во всех указанных лабораториях.

3. Исследования с целью серологической диагностики заболеваний (бактерионосительства) проводят по указанию клинициста или эпидемиолога во всех указанных лабораториях.

4. Определение эпидемиологических маркеров штаммов упомянутых патогенных энтеробактерий — биоваров, сероваров (энтеропатогенных эшерихий), фаговаров, колициногеноваров, колициноваров — проводят по эпидемиологическим показаниям и наличии соответствующих условий в лабораториях республиканских, краевых, областных, городских (в городах с районным делением) санитарно-эпидемиологических станций.

5. Определение сероваров и биоваров условно патогенных энтеробактерий проводят по эпидемиологическим показаниям в лабораториях, перечисленных в п. 4.

1. КЛАССИФИКАЦИЯ И НОМЕНКЛАТУРА ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

В настоящее время определение таксономических категорий в бактериологии основано на сочетании морфологических, тинкториальных, биохимических, генетических и других биологических характеристик.

Классификация и номенклатура энтеробактерий в данных «Методических указаниях» приняты в соответствии с широко известным 8-м изданием Bergey's Manual (1974) <*>.

<*> На русском языке издан его сокращенный вариант — Краткий определитель бактерий Берги (1980).

С целью унификации и правильности написания названий бактерий Международным кодексом номенклатуры бактерий (1975) сформулированы определенные правила. В частности, наименование бактерий следует писать только по-латыни, при этом род — с заглавной буквы, а видовой эпитет — со строчной. Например: Salmonella typhi, или сокращенно S. typhi. Рекомендовано также при внутривидовой дифференциации употреблять термины фаговар вместо фаготип, серовар вместо серотип и т.д.

Семейство Enterobacteriaceae объединяет обширную группу грамотрицательных палочек, подвижных или неподвижных, образующих или не образующих капсулы, некислотоустойчивых, не образующих спор, аэробов или факультативных анаэробов. Они образуют кислоту при ферментации глюкозы, цитохромоксидазоотрицательны, восстанавливают нитраты до нитритов (кроме некоторых штаммов Erwinia). Характеристики отдельных родов и видов приведены далее.

В таблице 1 представлены основные таксономические категории и номенклатура энтеробактерий.

Классификация семейства Enterobateriaceae, предложенная Юингом (W. Ewing, 1967 - 1972) и имеющая признание до настоящего времени, по некоторым позициям расходится с Определителем бактерий Берги. Поэтому считаем необходимым указать на наиболее существенные расхождения.

Тек, в Определителе Берги не упоминается Klebsiella oxytoca, фактически представляющая биовар K. pneumoniae, отличающийся по тестам на индол и желатин. В классификации Юинга K. oxytoca рассматривают как самостоятельный вид. В роду Serratia по Берги имеется единственный вид - S. maroescens, а Юингом в этот род включены еще два вида: S. liquefaciens и позднее S. rubideae. У Берги имеется вид Proteus inconstans, по Юингу это род Providencia. В Определителе Берги в род Citrobacter включены два вида: C. freundii и C. intermedius. У Юинга имеется третий вид - C. diversus, который является биоваром C. intermedius.

Эти сопоставления приведены лишь для справок, так как в "Методических указаниях..." принята классификация по Берги.

2. БАКТЕРИОЛОГИЧЕСКАЯ ДИАГНОСТИКА

Бактериологическому исследованию на наличие энтеробактерий может быть подвергнут различный материал, получаемый от людей; показания к его исследованию, правила взятия, подготовки к посеву и выбор питательных сред различны. Однако, начиная с отбора колоний на пластинчатых средах, последующие этапы бактериологического исследования (определение родовой, видовой принадлежности выделенных культур, их серологических характеристик и др.) идентичны (см. схему 1).

          \/                                              иногда более

   часов  \/

                   \/

                   \/                                \/

<*> Для некоторых материалов (мокрота, спинномозговая жидкость, гной и т.п.) целесообразна предварительная бактериоскопия.

2.1. Материал для исследования

Обоснованные показания к проведению бактериологического исследования того или иного материала и правильное его взятие в значительной мере определяют эффективность действий бактериолога. В определении характера подлежащих исследованию материалов, сроков их взятия ведущее значение принадлежит врачам-клиницистам и эпидемиологам. Основные показания к исследованию различных клинических материалов приведены в табл. 2.

Повышению высеваемости, в частности патогенных энтеробактерий, способствует повторное (до 3 — 4 раз) исследование соответствующего материала.

Общим требованием к процедуре отбора проб клинических материалов является обеспечение условий, исключающих контаминацию (загрязнение) материала микроорганизмами из смежных областей тела и окружающей среды. Материал для бактериологического исследования целесообразно брать до начала антибиотико-(химио-)терапии. Судна, горшки и другие емкости для сбора испражнений должны быть тщательно вымыты и лишены следов дезинфицирующих средств.

Материал собирают в стерильную посуду, снабжают наклейкой с указанием фамилии обследуемого и наименования материала. В сопроводительном документе указывают учреждение, направляющее материал, анкетные данные обследуемого: фамилия, имя, отчество, возраст, место работы и должность (для детей, посещающих детские учреждения, указывают название соответствующего детского учреждения), дату заболевания, диагноз или другие показания для обследования; наименование материала, дату и час взятия пробы, цель исследования, первичность или повторность исследования (при повторных исследованиях необходимо указать дату и результат первичного обследования), фамилию и должность лица, направляющего материал.

Испражнения собирают сразу после дефекации из судна, горшка, специального лотка или с пеленки с помощью стерильной стеклянной палочки, проволочной петли или деревянного шпателя. При наличии в испражнениях патологических примесей (слизь, хлопья, гной) их следует включить в отбираемую пробу. Испражнения можно получить непосредственно из прямой кишки с помощью ректальных тампонов, ватных или ватно-марлевых, укрепленных на металлической петле или деревянной палочке, а также применяя для извлечения фекалий специальные проволочные петли.

    При   профилактических   обследованиях  здоровых  лиц  на  носительство
сальмонелл  возможно  применение солевого слабительного (25 - 30 г магнезии
сульфата  -  MgSO )  в  теплом  виде  и предпочтительно накануне дня взятия

             4

испражнений на исследование.

Испражнения, не помещенные в консервант, суспендируют в ИХН в соотношении 1:5 или 1:10 и засевают не позднее 2 часов после взятия. При использовании консервантов оптимальны те же сроки, но материал пригоден для исследования еще в течение 12 — 24 часов. Объем испражнений, вносимых в консервант, не должен превышать 1/3 его объема, после внесения в пробирку испражнения следует перемешать. Материал, помещенный в консервант, сохраняют до начала исследования при 4 — 6 °C.

В качестве консервантов (транспортных сред) используют забуференный глицериновый, фосфатно-буферный консерванты (pH 8,0), а также ИХН. При исследованиях на наличие иерсиний глицериновый консервант непригоден. По возможности исследуемый материал сохраняют при 4 — 6 °C вплоть до учета результата посевов на пластинчатые среды, а при целенаправленном исследовании на иерсинии — до 14 дней (с целью накопления).

Кровь для исследования берут стерильным шприцом с соблюдением правил асептики из локтевой вены в объеме 2 — 10 мл (в зависимости от возраста) и засевают у постели больного в соотношении 1:10 во флаконы со средой Рапопорт, 10 — 20-процентным желчным бульоном или в стерильную дистиллированную (водопроводную) воду. Использование сред с желчью предпочтительно. При взятии крови в более поздние сроки и при слабо выраженной клинической картине заболевания объем засеваемой крови увеличивают до 15 — 20 мл, сохраняя то же соотношение крови и питательной среды (1:10). У детей до 1 года кровь берут в доступных количествах из пальца, пятки или мочки уха с соблюдением правил асептики.

При необходимости исследованию могут быть подвергнуты сгустки крови (после отделения сыворотки), доставленной в лабораторию для серологических исследований. Сгусток крови измельчают в пробирке с помощью стеклянной палочки и засевают (в соотношении 1:10) в среду Рапопорт или желчный бульон.

    Рвотные  массы и промывные воды желудка берут для исследования в объеме
до  100  мл  материала.  При  кислой  реакции  рвотные  массы перед посевом
нейтрализуют 10-процентным раствором питьевой соды (NaHCO ).   Исследованию

                                                     3

подлежат первые порции промывных  вод,  полученные  без  использования  при
промывании дезинфицирующих средств (KMnO  или др.); перед посевом промывные

                                    4

воды центрифугируют и засевают их осадок.

Соскоб розеол исследуют при наличии хорошо выраженных розеол. Участок кожи над ними обрабатывают спиртом, промывают стерильным ИХН, осушают стерильной марлей и подвергают скарификации. На поврежденную кожу наносят 1 — 2 капли желчного бульона или ИХН, затем собирают материал пастеровской пипеткой или небольшим кусочком стерильной ваты и опускают в пробирку с желчным бульоном.

Желчь (дуоденальное содержимое). Возможность проведения дуоденального зондирования определяет врач-клицинист. Материал собирают в отдельные стерильные пробирки, порции A, B, C, соответственно — дуоденальное содержимое, пузырную желчь и желчь из желчных протоков. Дуоденальное содержимое и желчь имеют зеленовато-желтый цвет и щелочную реакцию (последнюю проверяют индикаторными бумажками). Кислая реакция, белесоватый оттенок жидкости, наличие хлопьев свидетельствуют о примеси желудочного сока, такой материал непригоден для исследования на наличие энтеробактерий.

Моча. После обмывания наружных половых органов и спускания начальных порций мочи собирают 20 — 30 мл мочи в стерильную баночку (флакон). Доставленную в лабораторию мочу перед посевом центрифугируют и засевают осадок или используют для посева нативную мочу.

Гной, пунктаты органов, экссудат получают с помощью стерильного шприца или ватного (марлевого) тампона, при возможности сразу засевают на соответствующие питательные среды или пересылают в стерильных пробирках в лабораторию.

Слизь из зева, носа, уха, отделяемое шейки матки забирают с помощью стерильного ватного (марлевого) тампона, помещают в пробирки с ИХН, с СПБ или без них и пересылают в лабораторию.

Операционный материал (кусочки органов и тканей, извлекаемые при оперативных вмешательствах, содержимое удаленного червеобразного отростка, желчного, мочевого пузыря и др.) помещают в стерильные стеклянные баночки или пробирки, отдельные для каждого материала, и доставляют в лабораторию, следуя общим правилам.

Спинномозговую жидкость получают при люмбальной пункции в объеме 3 — 5 мл и помещают в стерильную пробирку. При транспортировке предохраняют от охлаждения (может быть использован термос).

Секционный материал берут на месте вскрытия, соблюдая правила асептики. В лабораторию направляют участки кишки длиной 8 — 10 см, с целью получения которых с обоих концов намеченного участка накладывают двойные лигатуры и разрезают кишку между этими лигатурами. Кровь из сердца или синуса твердой мозговой оболочки и желчь из желчного пузыря берут в объеме 3 — 5 мл с помощью пастеровской пипетки. Место прободения пипеткой стенки соответствующего органа предварительно прижигают шпателем. Кусочки тканей и органов вырезают из глубины стерильным скальпелем или ножницами также после предварительного обжигания поверхности. Каждый образец органа, ткани и т.п. помещают раздельно в стерильную посуду. Кусочки тканей и органов могут быть использованы для посева на месте изъятия органов методом отпечатков или после получения суспензии их в ИХН или СПБ путем растирания в ступке.

2.2. Посев материала и выделение чистой культуры

Для выделения энтеробактерий в чистой культуре требуется соблюдение ряда условий: максимально ранний посев взятого материала; подбор соответствующих питательных сред для первичного посева; техника выполнения посева должна обеспечить рост изолированных колоний. Для культивирования посевов используют оптимальный по температурным условиям и сроку инкубации режим. Подлежащую изучению колонию снимают бактериологической петлей, прикасаясь к поверхности колонии в центре и не затрагивая соседние участки среды. Недопустимо охлаждать петлю прикосновением к поверхности питательной среды, визуально свободной от микробного роста, на ней могут быть невидимые микроколонии.

Выбор питательных сред определяют, исходя из характера исследуемого материала (испражнения, кровь и т.д.) и представления о возможном содержании в нем тех или иных энтеробактерий и их ассоциаций (табл. 3). При этом учитывают и данные сопроводительной документации (цель исследования, диагноз, эпидемическая ситуация и др.). Наряду с обоснованным выбором важно качественное приготовление сред, строгое соблюдение указаний на этикетках и в наставлениях к коммерческим препаратам или в рецептурных прописях. Пластинчатые среды подсушивают, на их поверхности не должна оставаться конденсационная жидкость. В набор сред должны быть включены среды как для выделения патогенных энтеробактерий, так и обеспечивающие возможность выделения УПЭ. Исключение возможно лишь при целенаправленных исследованиях в особых ситуациях.

Условное обозначение: «+» — рекомендуемая среда.

Общим правилом является использование при посеве материала, содержащего смешанную микрофлору (испражнения, гной и т.п.), пластинчатых сред высоко селективного действия (Плоскирева, ВСА, с добавлением антибиотиков и др.). Материал, обычно стерильный (кровь, спинномозговая жидкость и т.п.), сеют на слабо селективные дифференциальные среды (ЭМС, Эндо) или СПА.

С целью накопления сальмонелл при исследовании испражнений или другого материала, содержащего обильную сопутствующую флору, могут быть использованы такие среды, как магниевая, селенитовая, Кауфмана или Мюллера, а при исследовании крови, спинномозговой жидкости и соскоба с розеол — желчный бульон, среда Рапопорт или (для крови) дистиллированная и водопроводная вода. Для накопления иерсиний при исследовании всех материалов применяют буферную среду или ИХН, а для клебокелл и энтеробактеров при исследовании крови — глюкозный бульон.

Прямой посев исследуемой пробы материала на пластинчатые селективно-дифференциальные среды и посев (при необходимости) в пробирку с жидкой средой обогащения проводят одновременно. При посеве на плотные среды исследуемый материал наносят с помощью бактериологической петли, стеклянной палочки, ректального тампона или пипетки с последующим втиранием материала шпателем или петлей по всей поверхности среды. На высоко селективные среды посевной материал вносят в большем объеме (в 3 — 5 раз), чем на слабо селективные. В средах с антибиотиками, приготовленных «методом градиентной чашки» или с использованием бумажных полосок, посевной материал вносят в зону среды с антибиотиком и распределяют его далее, как описано. Посев в среды для «метода подвижного роста» проводят в соответствии с «Методическими рекомендациями по выделению сальмонелл из испражнений методом „подвижного роста“ (МЗ СССР, 1978).»

Все указанные посевы (кроме целенаправленных посевов для выделения иерсиний) инкубируют при 37 °C в течение 18 — 20 часов (до 48 часов на ВСА). Инкубация засеянной селенитовой среды не должна превышать 18 часов. По окончании инкубации из сред обогащения для сальмонелл делают высевы на ВСА (при исследовании материала, содержащего сопутствующую микрофлору), а при исследовании крови, спинномозговой жидкости и соскоба с розеол — на среды Эндо (ЭМС), СПА, на последние делают высев также из сред обогащения для иерсиний и клебокелл (энтеробактеров), соблюдая правила посева и инкубации, как при прямом посеве.

При целенаправленном исследовании для выделения иерсиний лучше использовать среду Эндо, чем ЭМС. Посевы на этих средах инкубируют при 22° — 25 °C в течение 18 — 48 часов, просматривая чашки повторно через 48 часов инкубации. Засеянную буферную среду или ИХН сохраняют в холодильнике (4° — 6 °C), первый высев на пластинчатую среду проводят через 24 — 36 часов инкубации, а при отрицательных результатах высевы повторяют на 5, 7, 11 и 14 дни инкубации.

Помимо указанных общих правил, требуется соблюдение особенностей посева с учетом характера исследуемого материала.

Испражнения, если они доставлены без консерванта, суспендируют в ИХН в соотношении 1:5 или 1:10, после чего используют для посева на пластинчатые среды. Неразведенные испражнения вносят в среду обогащения в соотношении 1:5 и тщательно перемешивают. При взятии материала ректальным тампоном его погружают в среду обогащения после посева на пластинчатые среды.

При посеве в селенитовую среду обогащения испражнений, доставленных в лабораторию в фосфатно-буферном консерванте (но не в глицериновом), возможно применение среды двойной концентрации с соблюдением соотношения посевного материала и среды 1:1.

Кровь. Через 18 — 20 часов после посева, выполненного, как указано в предыдущем разделе, и инкубации при 37 °C делают высев на одну из слабо селективных пластинчатых сред или на СПА, при отрицательных результатах высевы повторяют на 3, 4, 6 и 10 сутки.

Рвотные массы и промывные воды желудка, не подвергавшиеся центрифугированию, засевают с целью обогащения в соответствующие накопительные среды двойной концентрации, соблюдая соотношения засеваемого материала и среды 1:1, при посеве центрифугата применяют среды обогащения обычной концентрации.

Желчь (дуоденальное содержимое) засевают во флаконы с 50 мл СПБ в соотношении 1:10 и на пластинчатые среды (Эндо, ЭМС). Оставшуюся желчь также помещают в термостат, делая из нее высев через 18 — 20 часов и на 3, 5, 7 сутки (в случае отрицательных результатов предыдущих высевов) на пластинчатые среды подобно высевам со сред обогащения.

Мочу после центрифугирования (или без него) сеют на пластинчатые среды (ЭМС, Эндо), а также в среды обогащения, нецентрифугированную мочу — в среды двойной концентрации в соотношении 1:1.

Гной, пунктаты органов, экссудат, слизь из зева и носа, мокроту, отделимое цервикального канала <>, женское грудное молоко <> засевают в жидкие среды обогащения и на плотные питательные среды (табл. 3).

<*> Женское грудное молоко исследуют при наличии специальных показаний.

Спинномозговую жидкость засевают в жидкие питательные среды для обогащения и на пластинчатые среды (табл. 3).

Соскоб с розеол, полученный, как указано в предыдущем разделе, засевают в среду обогащения с последующим высевом на пластинчатые среды.

Операционный материал — содержимое червеобразного отростка, желчного и мочевого пузыря исследуют как испражнения, желчь и мочу соответственно, а биоптаты органов или тканей засевают аналогично секционному материалу.

Секционный материал засевают, как указано в разделе «Материал для исследования» либо непосредственно на пластинчатые среды путем прикосновения (отпечатка) поверхности среза кусочков органов к агару, либо после получения взвеси засевают на плотные среды и, если это необходимо, в среды обогащения. Кровь, мочу, желчь исследуют, как указано для этих материалов.

После культивирования посевов, просмотра чашек и отбора выросших колоний для дальнейшего исследования руководствуются их характеристиками, приведенными в соответствии с родовой принадлежностью энтеробактерий (табл. 4). Следует помнить, что колонии, подозрительные на принадлежность к шигеллам или сальмонеллам, подлежат первоочередному отсеву и изучению (не менее 3 колоний). При их отсутствии и показаний к исследованию с целью выделения других представителей энтеробактерий снимают для изучения по 2 — 3 колонии с различными морфологическими характеристиками.

Для получения количественных показателей обсеменения исследуемого материала УПЭ в случаях их выявления в отсутствие патогенных энтеробактерий и решения вопроса об этиологической значимости могут быть проведены дозированные посевы из проб материала на пластинчатые среды.

Для жидких субстратов (клинический материал) разведения готовят объемным методом, разводя 0,1 — 1,0 мл исследуемой пробы в соотношении 1:10 -1

(разведение  10  ) в ИХН. Далее в двух пробирках, содержащих по 9,9 мл того
                                                  -3      -5
же раствора, последовательно готовят разведения 10   и  10  ,  перенося  по
0,1 субстрата из предыдущего разведения. Всю работу  проводят с соблюдением
правил   асептики,   со  сменой  градуированных  пипеток  при  переходе  от
предыдущего   разведения   к  последующему.  При  исследовании  испражнений
предварительно   следует  приготовить  навеску  в  пределах  от  нескольких
дециграмм  до  одного  грамма,  разведения  готовят, как указано ранее. Для

количественного учета УПЭ на пластинчатые дифференциально-селективные среды

                                         -3       -5
высевают  по  0,1  мл  из  разведений  10    и  10    и тщательно растирают
нанесенный  на  поверхность  среды  материал.  На  последующих  этапах  при
подсчете выросших колоний их число умножают на  соответствующее  разведение
(из которого проводили высев на чашку) и на 10, т.к. была высеяна доза  0,1

                                     -3

мл.  Например:  высев  из  разведения  10   привел  к  развитию  в чашке 30
колоний,   однородных   по   своим  характеристикам  и  отнесенных  к  роду
Citrobacter. Для  определения  содержания  их  в  1  грамме  исследованного

                                                                    5

материала 30 умножают на 1000 и на 10 (30 х 1000 х 10 = 300000 = 3 х 10 ). 5 Таким образом устанавливают, что в 1 грамме материала содержалось 3 х 10 бактерий рода Citrobacter.

Отобранные для дальнейшего изучения колонии пересевают в одну из сред для первичной идентификации. При целенаправленном исследовании на ЭПЭ первичный отбор колоний (не менее 2 — 3 каждой разновидности) проводят с помощью реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки OKA (к большому числу наиболее распространенных сероваров ЭПЭ). Остаток колонии, давшей агглютинацию с указанной сывороткой, отсевают в среду для первичной идентификации и на скошенный агар (для дальнейшего серологического изучения).

2.3. Идентификация энтеробактерий

Идентификация энтеробактерий включает три этапа: а) первичную идентификацию; б) установление рода (дифференциацию родов) и в) идентификацию вида и внутривидовую дифференциацию.

Выполнение первого типа предусматривает определение биохимических признаков изучаемой культуры с использованием сред для первичной идентификации (комбинированных сред), а при необходимости и тестов для дифференциации энтеробактерий от других грамотрицательных бактерий. На втором этапе применяют тесты минимального дифференцирующего ряда в наборе, необходимом для установления рода (дифференциации от сходных родов), а также вида у тех родов энтеробактерий, которые представлены единственным видом. Третий этап идентификации предполагает использование дополнительных биохимических тестов для внутривидовой дифференциации — определение видов, внутривидовую дифференциацию, а при необходимости и наличии соответствующих коммерческих диагностических сывороток и серологическую внутривидовую дифференциацию.

При выделении шигелл, сальмонелл и ЭПЭ три этапа идентификации, а при исследовании с целью выделения других энтеробактерий — первые два этапа идентификации и частично третий этап (до вида) осуществляют все бактериологические лаборатории. Внутривидовую дифференциацию энтеробактерий, не относящихся к шигеллам, сальмонеллам и ЭПЭ, проводят в соответствующих лабораториях (см. «Общее примечание»).

2.3.1. Первичная идентификация

Для этой цели применяют, как указывалось, комбинированные среды — Олькеницкого или Клиглера, на которых наряду с получением культуры для дальнейшего изучения выявляют одновременно несколько ее признаков: способность образовывать сероводород и отношение к глюкозе, лактозе (а также сахарозе и мочевине — на среде Олькеницкого). Посев материала из колонии на комбинированную среду проводят бактериологической петлей вначале по скошенной части штрихом и заканчивают уколом в толщу агарового столбика, не достигая дна пробирки. Посевы инкубируют при 37 °C в течение 18 — 20 часов, а при целенаправленных исследованиях на иерсинии — в течение того же времени, но при 22° — 25 °C.

    О  ферментации  лактозы (и сахарозы) в среде Олькеницкого и ферментации
лактозы  в  среде  Клиглера  судят  по появлению желтой окраски в скошенной

части агара, а о ферментации глюкозы — по такому же окрашиванию в столбике. Газообразование устанавливают по появлению пузырьков, разрывам агара или его отслоению от стенок пробирки. Образование сероводорода устанавливают по

почернению  среды   обычно  в  средней  части  столбика,  при  значительной
продукции  H S  можно наблюдать почернение всей среды. В среде Олькеницкого

        2

при  росте  культуры,  гидролизующей  мочевину,  происходит подщелачивание,
вследствие  чего среда приобретает диффузный яркий красно-малиновый цвет. В
этом   случае   учет  ферментации  углеводов  невозможен.  При  интенсивном

образовании сероводорода, когда чернеет целиком вся среда, учет ферментации

углеводов  в  средах  Клиглера  и  Олькеницкого  затруднен.  Однако следует
помнить,  что  образование  сероводорода  может  происходить  лишь в кислой
среде,  которая  создается  за  счет  ферментации  глюкозы,  присущей  всем
энтеробактериям.  Кроме  того,  при  просмотре  среды  в проходящем свете в
столбике  обычно  видны  на  общем  черном фоне участки пожелтевшего агара,

свидетельствующие о ферментации углеводов.

По совокупности биохимических свойств, выявленных на комбинированной среде, делают предположительное заключение о возможной родовой принадлежности культуры. Далее выбирают дифференциально-диагностические тесты, необходимые для установления рода энтеробактерий, т.е. проводят дифференциацию родов (табл. 5). Для эшерихий, эдвардсиелл, гафний и серраций это совпадает с определением вида.

<*> Сведения по роду Erwinia не включены, так как при обычном (37 °C) культивировании посевов на пластинчатых средах указанные энтеробактерии не растут или дают замедленный скудный рост.

<**> При использовании среды Олькеницкого.

<***> При использовании среды Клиглера проводят параллельный посев в среду с мочевиной (по Преусу или по Кристенсену).

Условные обозначения: «+» — положительная реакция, указывающая на ферментацию лактозы и (или) сахарозы, образование сероводорода, гидролиз мочевины; «-» — отрицательная реакция по тем же тестам; «к» — ферментация глюкозы без газообразования; «кг» — ферментация глюкозы с газообразованием; «.» — учет реакции невозможен.

В связи с тем, что набор определяемых с помощью комбинированных сред биохимических признаков не является достаточным для установления рода энтеробактерий, серологическую идентификацию исследуемой культуры на данном этапе не проводят, кроме постановки серологических проб с поливалентными сыворотками к сальмонеллам и шигеллам, помогающих выбору биохимических тестов для дальнейшей идентификации. Исключение возможно при чрезвычайных эпидемических ситуациях, при этом к серологическому исследованию культуры приступают после проведения пересевов с этой среды на необходимые среды минимального дифференцирующего ряда, а полученные результаты серологической идентификации рассматривают как сугубо ориентировочные, требующие подтверждения на этапе завершенной биохимической идентификации.

При возникновении сомнений в принадлежности изучаемой культуры к семейству Enterobacteriaceae (см. табл. 5) следует использовать тесты, позволяющие дифференцировать энтеробактерии от других грамотрицательных микроорганизмов. В числе этих тестов: изучение морфологических (палочка, кокк) и тинкториальных свойств микроорганизмов путем микроскопии мазков, окрашенных по Граму (+ или -); OF-тест, т.е. тип утилизации глюкозы — окисление (O), ферментация (F) или отсутствие активности (-); определение таких ферментов, как цитохромоксидаза, нитратредуктаза (редукция нитратов в нитриты), см. табл. 6.

<*> При росте на твердых питательных средах образуют колонии желтого, оранжевого, красного или коричневого цвета; оттенок пигмента зависит от состава среды и температуры культивирования.

<**> Кроме F. meningosepticum, дающих отрицательную реакцию.

<***> За исключением единичных штаммов Acinetobacter calcoaceticum.

Обозначения: «+» — положительная реакция; «-» — отрицательная реакция; X — разные реакции; O — окисление; F — ферментация.

Микроскопию окрашенных по Граму мазков из сомнительных культур следует считать первоочередной, так как при этом могут быть выявлены особенности (например, кокковая форма), исключающие необходимость использования других тестов. Нечеткие результаты окраски по Граму (у некоторых штаммов микроорганизмов родов Acinetobacter, Moraxella и Bacillus) могут быть уточнены при использовании пробы с KOH. Для этого культуру суспендируют в капле 3-процентного раствора KOH на предметном стекле. При положительной реакции, свойственной грамотрицательным микроорганизмам, жидкость в капле становится вязкой, нити тянутся за петлей на 0,5 — 2 см. Учет этой пробы более удобен на черном фоне.

Для постановки OF-теста изучаемую культуру засевают уколом в столбик среды Хью-Лейфсона (одновременно в две пробирки), в одну из которых затем вносят стерильное вазелиновое масло (0,5 — 1 мл). Посевы делают небольшой петлей, не доводя ее до дна пробирки на 5 — 6 мм, инкубируют при 37 °C в течение 1 — 4 суток. Изменение цвета среды на желтый в обеих пробирках указывает на расщепление глюкозы путем ферментации (F), появление желтой окраски среды только в открытой пробирке, не залитой вазелиновым маслом, — об окислительном процессе (O), а сохранение исходного неизменного цвета в обеих пробирках — об отсутствии активности в отношении глюкозы (-).

Тест на цитохромоксидазу можно проводить по методу Эрлиха, для чего на поверхность роста 18 — 20-часовой агаровой культуры наносят каплю 1-процентного водного раствора диметил-пара-фенилендиамина и добавляют каплю 1-процентного спиртового раствора альфа-нафтола. При положительной реакции через 1 — 3 минуты появляется ярко-синее окрашивание. Тест можно воспроизвести также с помощью диска на цитохромоксидазу из коммерческой бумажной индикаторной системы (СИБ) в соответствии с наставлением к нему. Наличие цитохромоксидазы можно выявить по методу Ковача (известен как тест на оксидазу), являющемуся модификацией метода Эрлиха. По методу Ковача на культуру наносят несколько капель 1-процентного водного раствора тетра-пара-фенилендиамина. При положительной реакции через 20 — 30 секунд появляется стойкое темно-красное окрашивание.

Тест на редукцию нитратов проводят путем посева одной петли суточной агаровой культуры в питательную среду, содержащую нитрат калия (см. «Питательные среды и реактивы»), и инкубируют при 37 °C до 4 суток с ежедневным учетом реакции. Для выявления восстановленных нитритов в пробирку с культуральной жидкостью вносят по 1 мл растворов А и Б (см. «Питательные среды и реактивы»). При положительной реакции через несколько минут появляется красное окрашивание, при отрицательной цвет среды не меняется.

2.3.2. Дифференциация родов

Небольшое число признаков, выявляемых у культур энтеробактерий на этапе первичной идентификации, не позволяет достоверно определить их родовую принадлежность. Обычно по сочетанию биохимических признаков на средах первичной идентификации (на комбинированных) можно заподозрить одновременно несколько (3 — 6) родов энтеробактерий. В связи с этим для установления родовой принадлежности изучаемой культуры следует провести дифференциацию родов, т.е. использовать соответствующие тесты из минимального дифференцирующего ряда (табл. 7). Конкретный набор тестов определяют с учетом родов, подлежащих дифференциации (табл. 5). При затруднениях в дифференциации прибегают к определению дополнительных признаков у изучаемой культуры, используя данные о биохимических характеристиках родовых групп семейства Enterobacteriaceae (табл. 8).

<*> При получении на комбинированной среде нечетких результатов эти тесты повторяют на отдельных средах (жидкие или полужидкие среды с лактозой, глюкозой).

<**> При отсутствии этого субстрата в комбинированной среде или при получении на ней нечетких результатов.

<***> Klebsiella pneumoniae.

<****> Tersinia pestis.

<*****> Erwinia herbicola.

<*> Температура указана по Цельсию (C).

<**> Приведены свойства, характерные для K. pneumoniae.

<***> Приведены свойства без T. pestis.

<****> Приведены свойства, характерные для Erwinia herbicola.

Примечание: * — не изучено.

Воспроизведение тестов минимального дифференцирующего ряда требует соблюдения известных правил.

При определении подвижности посев культуры следует делать уколом петлей или иглой по центру столбика полужидкого СПА (0,3 — 0,4%), не доходя до дна пробирки.

Индолообразование определяют путем добавления реактивов Эрлиха или Ковача к культуре, выращенной в безуглеводной среде — пептонной воде (1 — 2%), бульоне Хоттингера, бульоне на триптическом переваре казеина. Вместо растворов реактивов Эрлиха или Ковача можно использовать пропитанную одним из них полоску фильтровальной бумаги (индикаторная бумажка «на индол»), которую помещают между стенкой и пробкой пробирки с культурой, выращенной в какой-либо из указанных сред или в полужидком агаре, используемом для определения подвижности. Все указанные для определения индолообразования питательные среды следует предварительно проверять с тест-культурами, образующими индол.

    Для  выявления  фенилаланиндезаминазы делают массивный посев штрихом по
скошенной  части  соответствующей  среды и после 18 - 24 часов инкубации на
выросшую  культуру  наносят  несколько  капель  10%  раствора  железа (III)

хлорида (FeCl ). 3

При определении декарбоксилаз лизина и орнитина, дигидролазы аргинина наряду с посевами в среды с этими аминокислотами необходимо делать посев в контрольную пробирку, содержащую основу без аминокислоты. После посевов во все пробирки, включая контрольную, вносят стерильное вазелиновое масло слоем 4 — 5 мм.

Тесты со средами Симонса и ацетатной выявляют способность испытуемых культур использовать цитрат и ацетат (соответственно) как единственные источники углерода. Для посева на эти среды берут минимальную инокулирующую дозу, снимая посевной материал без прикосновения петли к среде культивирования. Более целесообразно использовать для посева на эти среды суспензию бактериологической петли культуры в 1 — 1,5 мл ИХН, не допускается высев из бульона и других жидких питательных сред.

Для постановки тестов с метиловым красным и Фогеса — Проскауэра используют среду Кларка в объеме 5 — 6 мл в пробирке, посев делают обычным способом. Первоначальный учет проводят через сутки, для чего по 1 мл культивированной жидкости переносят в две пробирки, в одну из которых добавляют 1 — 2 капли реактива метилового красного, а во вторую — последовательно 0,5 мл 6% спиртового раствора альфа-нафтола и 0,2 мл 40% раствора KOH. Оценку результатов реакций см. табл. 9. Тест с метиловым красным учитывают сразу после добавления реактива, а тест Фогеса — Проскауэра — в течение 5 — 10 минут после встряхивания или после 1 — 2 часов пребывания в термостате. Пробирку с неиспользованной культурой в среде Кларка продолжают инкубировать в термостате до 2 — 4 суток, когда указанные реакции дают более четкие результаты. Для некоторых энтеробактерий (например, гафний) результаты реакций с метиловым красным и Фогеса — Проскауэра различны при разных температурах культивирования (22° или 37 °C), что может быть использовано в качестве дополнительного дифференцирующего теста.

<*> Указаны изменения цвета при индикаторе бромтимоловый синий.

Посевы для воспроизведения других тестов не требует специальных пояснений, учет результатов см. табл. 9.

На этапе дифференциации родов могут быть использованы пробы с поливалентными сальмонеллезными и дизентерийным бактериофагами (диагностические жидкие или лечебные в таблетках). Таблетку лечебного фага перед постановкой пробы растворяют в 20 мл ИХН. Для воспроизведения пробы с фагом используют 2-х или 18-часовую бульонную культуру, можно применять также взвесь суточной агаровой культуры в ИХН. Тонко оттянутой пастеровской пипеткой или петлей диаметром 4 — 5 мм наносят две капли испытуемой культуры на хорошо подсушенный СПА в чашке Петри. На одну из капель после подсыхания наносят петлей или из очень тонкого капилляра пастеровской пипетки каплю фага, а на другую (служащую контролем) — каплю стерильного бульона. Бактериофаг применяют в неразведенном виде или в разведениях в соответствии с «Наставлением» к препарату. После постановки пробы чашки инкубируют при 37 °C в течение 18 — 20 часов. При положительной реакции на месте нанесения фага появляется четко очерченный лизис (++++), полусливной лизис (+++), большее или меньшее число отдельных негативных колоний (++, +). При отсутствии лизиса (отрицательная реакция) в местах нанесения фага, как и в контроле, наблюдают сплошной рост культуры.

Как указывалось ранее, на этапе дифференциации родов возможна постановка ориентировочных серологических проб с поливалентными агглютинирующими сыворотками к сальмонеллам и шигеллам. При этом используют соответственно поливалентную смесь к сальмонеллам групп ABCDE (при отрицательном результате пробу повторяют со смесью O-сывороток к сальмонеллам редких групп) и поливалентную смесь сывороток к S. sonnei, S. flexneri 1 — 5, S. flexneri 6. Указанные ориентировочные пробы выполняют путем постановки реакции агглютинации на стекле с культурой, выросшей на среде первичной идентификации. В ходе исследования на ЭПЭ, как указывалось ранее, при отборе соответствующих колоний, давших агглютинацию с OKA сывороткой, делают посев не только на среду первичной идентификации, но и на скошенный СПА. Серологическое изучение эшерихий проводят с культурами, выращенными на скошенном СПА. Культуры, подозреваемые на принадлежность к ЭПЭ, исследуют повторно с поливалентной сывороткой OKA и при положительном результате с OKB, OKC, OKD, OKE или соответствующими OK-иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуру засевают в среды минимального дифференцирующего ряда (табл. 7) для подтверждения принадлежности культуры к роду Escherichia (в первую очередь ацетатную, цитратную Кристенсена и на подвижность).

Помимо постановки тестов, необходимых для установления родовой принадлежности выделенной культуры энтеробактерий, со среды первичной идентификации делают также высев на скошенный СПА, используемый для дальнейшей биохимической и серологической идентификации.

2.3.3. Идентификация видов и внутривидовая дифференциация

Идентификация видов и внутривидовая дифференциация энтеробактерий составляет заключительный этап бактериологического исследования различных материалов. В большинстве случаев идентификация видов энтеробактерий предусматривает применение дополнительных к использованным на предыдущем этапе (определения рода) биохимических тестов из минимального дифференцирующего ряда.

Для патогенных, а также для некоторых условно патогенных энтеробактерий, идентификация включает, кроме биохимической, и серологическую характеристику. Последняя обеспечивает тонкую дифференциацию энтеробактерий вплоть до определения серовидов и подсеровидов (например, для Shigella flexneri).

Другие возможности внутривидовой дифференциации, основывающиеся на особенностях взаимодействия с препаратами бактериофагов, на феномене колициногении или определении биоваров реализуются при наличии соответствующих эпидемиологических показаний и изложены в следующем разделе «Методических указаний».

Род Shigella в соответствии с действующей в СССР Международной классификацией разделен на 4 подгруппы (A, B, C, D), соответствующие видам: S. dysenteriae, S. flexneri, S. boydii, S. sonnei (табл. 10).

<*> Приведена принятая в СССР Международная классификация шигелл с учетом внесенных в нее в 1982 г. Международным подкомитетом по энтеробактериям изменений и дополнений:

1. вид S. dysenteriae дополнен сероварами 11 и 12, ранее известными как провизорные (временные) серовары 3873-50 и 3341-55 соответственно;

2. серовар 3 S. flexneri включают ныне два подсеровара — 3a и 3b;

3. серовар 5 S. flexneri разделен на подсеровары 5a и 5b;

4. вид S. boydii дополнен сероварами 16, 17 и 18, ранее известными как провизорные серовары 2710-54, 3615-53 и E10163 соответственно.

<**> С конца 70-х годов в СССР стали выделяться S. flexneri 4 с антигенной формулой (IV:7,8), не предусмотренной Международной классификацией шигелл.

Основные тесты для дифференциации указанных видов представлены в табл. 11, а для их внутривидовой дифференциации в табл. 12 - 14.

<*> S. dysenteriae 5 ферментируют дульцит.

<**> S. boydii 6 и 14 могут образовывать газ, S. boydii 13 декарбоксилируют орнитин, S. boydii 9 могут замедленно ферментировать лактозу.

Серологическую идентификацию шигелл проводят с помощью адсорбированных сывороток. Исследование начинают с основной поливалентной сыворотки, содержащей антитела к S. flexneri 1 - 6 и S. sonnei. При положительном результате далее используют поливалентные сыворотки к S. flexneri 1 - 5, S. sonnei (I и II фаза) и сыворотку к S. flexneri 6 (с учетом этиологической структуры дизентерии в данной местности). Учитывают и данные о биохимических свойствах выделенной культуры шигелл: например, шигеллы, образующие индол, не следует агглютинировать в сыворотках к S. sonnei и к S. flexneri 6 (S. newcastle).

Установление антигенной формулы S. flexneri (см. табл. 10) начинают с применения сероварспецифических сывороток (к антигенам I, II, III, IV, V, VI), а затем групповых (3, 4; 6; 7, 8). Порядок исследования также зависит от пейзажа сероваров шигелл в регионе. При работе с культурами S. flexneri надо помнить, что иногда свежевыделенные штаммы слабо агглютинируются, особенно в сыворотке к групповым антигенам 3, 4. В таких случаях следует для повышения агглютинабельности провести 1 - 2 пассажа 4-часовой бульонной культуры с высевом на скошенный СПА. Если культура агглютинирует в сыворотке к S. sonnei, серологическая ее идентификация считается завершенной.

Бактерии, принадлежащие по культуральным и биохимическим свойствам к шигеллам, но не агглютинирующиеся в основной поливалентной сыворотке, испытывают с поливалентными сыворотками к другим видам шигелл: к S. dysenteriae (если они не сбраживают маннит) или к S. boydii (в случае маннитферментирующих штаммов). При положительной реакции в одной из примененных сывороток культуру испытывают с сероварспецифическими сыворотками, входящими в данную поливалентную смесь.

Некоторые шигеллы (S. dysenteriae, S. flexneri 6, S. boydii) могут иметь хорошо развитые Y-антигены, вследствие чего живые культуры не агглютинируются в соответствующих сыворотках. Взвеси таких культур в ИХН следует прогреть в водяной бане при 100 °C в течение 1 часа. При этом обязателен контроль культуры до кипячения на спонтанную агглютинацию в капле ИХН, для ее исключения.

В случаях каких-либо затруднений при серологической идентификации шигелл необходимо провести рассев штамма в чашке с дифференциальной средой (ЭМС или Эндо) с целью проверки чистоты культуры и повторно провести биохимическую идентификацию.

Род Salmonella согласно Определителю Берги (1980) состоит из четырех подродов (см. табл. 1), дифференциацию которых проводят с использованием биохимических тестов, приведенных в табл. 15.

Дальнейшую идентификацию представителей рода Salmonella проводят согласно антигенно-диагностической схеме Кауфмана-Уайта (табл. 16) с применением коммерческих агглютинирующих сывороток. Как указывалось ранее (см. схему 1) ориентировочная проба в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой к сальмонеллам O-групп ABCDE (к антигенам 2, 4, 7, 8, 9, 3, 10), а при ее отрицательном результате и с поливалентной сывороткой к сальмонеллам редких O-групп (к антигенам 11, 18, 14, 16, 17, 23 и др.) возможна еще на этапе определения рода. После подтверждения биохимическими тестами принадлежности выделенной культуры к роду Salmonella реакции с поливалентными сыворотками повторяют и переходят к определению O-групп сальмонелл (по схеме Кауфмана-Уайта) с помощью отдельных O-сывороток, входящих в соответствующую поливалентную.

<*> Объединяет два биосеровара: S. gallinarum и pullorum.

Подрод I включает большинство известных сероваров сальмонелл, к подроду II и IV относят редко встречающиеся серовары. К подроду III отнесены бактерии, ранее известные как бактерии Arizona, принадлежащие к различным сероварам.

Сальмонеллы первого подрода варьируют по некоторым биохимическим свойствам, основные из которых приведены в табл. 17.

После установления принадлежности культуры к O-группе определяют полную

структуру   ее   O-антигенов,   а   затем   испытывают   с  монорецепторами
H-сыворотками  также в реакции агглютинации на стекле, начиная исследование
с  сывороток  к  наиболее  распространенным  в  данной  местности сероварам
сальмонелл.  После  выявления  H-антигена первой фазы определяют антигенные
компоненты  второй фазы и устанавливают полную антигенную формулу (серовар)

выделенной культуры. Для определения антигенной формулы некоторых сероваров

из  групп  C   и  D   культуру  испытывают  с  vi-сывороткой  для выявления
            1      1

vi-антигена (S. typhi, S. dublin и S. paratyphi C /S. hirschfeldii/).

Для реакции агглютинации с O-сывороткой следует брать культуру с верхней части скошенного агара, для H-сывороток — конденсат или из нижнего участка роста (наиболее подвижные особи). При отсутствии четкой реакции агглютинации с O-сывороткой проводят пассажи культуры (4 — 5 раз) на 10-процентном желчном бульоне и скошенном СПА с последующим рассевом на чашки с СПА и отбором отдельных колоний. При серологической идентификации возможны трудности в определении H-антигена или одной из его фаз, что может быть связано с угнетением или утратой H-антигена (утрата подвижности), либо с преобладанием в популяции особей с преимущественным содержанием какой-либо одной фазы. Для некоторых сальмонелл характерно отсутствие H-антигена (S. gallinarum — S. pullorum) или отсутствие первой фазы H-антигена (S. choleraesuis var. kunsendorf и др.).

Для выявления искомой фазы H-антигена используют феномен роения по Гарду, для чего применяют мягкий (0,8 — 1%) СПА в чашках. В центре чашки с СПА наносят 1 — 2 капли агглютинирующей сыворотки, соответствующей выявленной фазе, после подсыхания сыворотки на тот же участок сеют «бляшкой» (диаметр 3 — 4 мм) 18 — 20-часовую агаровую культуру. Распространение бактерий, богатых H-антигеном этой фазы, будет угнетено, в то время как особи бактерий, содержащие преимущественно другую (не выявленную) фазу, будут распространяться на поверхности мягкого агара за пределом «бляшки» (макроколонны). С периферии такой макроколонны берут бактериологической петлей материал и испытывают в реакции агглютинации на стекле с различными H-сыворотками.

Для определения невыявленной фазы H-антигена можно использовать также U-образную трубочку, заполненную полужидким (0,2 — 0,4%) СПА, смешанным с H-сывороткой подавляемой фазы. Для выявления наиболее подвижных особей в слабоподвижной или неподвижной культуре используют также U-образную трубочку с полужидким агаром, но без добавления сыворотки. Для отбора подвижных особей исследуют культуру из противоположного (от посева) колена трубочки.

В некоторых случаях для дифференциации биоваров Salmonella с одинаковой антигенной формулой необходимо определение дополнительных биохимических свойств (табл. 18).

Род Escherichia представлен одним видом E. coli, объединяющим все ранее известные биовары, включая Alcalescens — Dispar. Особенность рода состоит в том, что непатогенные разновидности эшерихий являются постоянными обитателями кишечника человека, животных, птиц и широко распространены в природе.

Патогенные эшерихии, входящие в этот же род, не отличаются от непатогенных по морфологическим и культуральным свойствам, поэтому при исследованиях на наличие патогенных эшерихий (включая ЭПЭ) изучению подлежат разнообразные по морфологическим характеристикам колонии эшерихий, выросшие на пластинчатых средах.

Основные биохимические свойства вида Escherichia coli приведены в табл. 19.

<*> Последовательность обозначений реакций соответствует наблюдаемой частоте.

При исследовании на эшерихии ход анализа различен в зависимости от поставленной задачи (поиск ЭПЭ или возбудителей парентеральных эшерихиозов).

При выделении и идентификации (определение сероваров) ЭПЭ, как уже указывалось ранее, поиск и первичный отбор колоний, выросших на чашках первичного посева, проводят серологическим методом в реакции агглютинации на стекле с использованием поливалентной сыворотки OKA (табл. 20). Оставшуюся часть колонии, давшей положительную реакцию агглютинации с сывороткой OKA, отсевают на скошенный агар и на одну из комбинированных сред для первичной идентификации. Культуры, «подозрительные» на принадлежность к роду Escherichia (по данным комбинированной среды), на следующие сутки повторно проверяют в реакции агглютинации на стекле с поливалентной сывороткой OKA и при положительном результате испытывают с поливалентными сыворотками (OKB, OKC, OKD, OKE) или OK-иммуноглобулинами. При наличии положительной реакции культуру засевают со скошенного агара в питательные среды для воспроизведения тестов минимального дифференцирующего ряда, необходимых (с учетом результатов, полученных на комбинированной среде) для подтверждения принадлежности культуры в роду Escherichia (табл. 7). Тест для определения подвижности ставят не обычным порядком (уколом в столбик полужидкого агара), а в пробирках по Крейджи (до стерилизации в бактериологическую пробирку с полужидким агаром помещают трубочку — отрезок стеклянного дрота длиной 3 — 4 см). Посев делают в верхний конец трубочки, выступающий над поверхностью агара в пробирке. Это дает возможность одновременно «накопить» материал для исследования H-антигена.

При получении на следующий день результатов (учет дифференциальных биохимических тестов), подтверждающих принадлежность культуры к роду Escherichia, проводят дальнейшую серологическую идентификацию для определения сероваров ЭПЭ (O-, K-, H-антигенов). Для исследования O-, K-антигенов используют суточную культуру на скошенном СПА, для исследования H-антигена с поверхности агара из пробирки Крейджи культуру засевают на скошенный глицериновый агар. Культуры эшерихий, давшие реакцию агглютинации с одной из поливалентных OK-сывороток (OKB, OKC, OKD, OKE) или иммуноглобулинами, испытывают в реакции агглютинации на стекле с отдельными групповыми OK-сыворотками, входящими в данную поливалентную смесь (табл. 20), или OK-иммуноглобулинами.

Полученный ориентировочный положительный результат с отдельной OK-сывороткой необходимо подтвердить в реакции агглютинации на стекле (табл. 21) с OK-иммуноглобулином (живые бактерии) и адсорбированными групповыми и факторными O-сыворотками (бактерии, прогретые при 100 °C в течение 30 минут).

Ответ об обнаружении определенной OK-группы ЭПЭ выдается при наличии реакции агглютинации живой культуры с соответствующим OK-иммуноглобулином или OK-сывороткой и гретой культуры с адсорбированной O-сывороткой. Исключение составляет E. coli 0151, когда положительный отчет выдают по результату агглютинации живой культуры на стекле с адсорбированной сывороткой 0151:K-. OK-иммуноглобулины как более специфичные препараты следует использовать взамен отдельных OK-сывороток. При наличии необходимого ассортимента иммуноглобулинов серологическую идентификацию ЭПЭ проводят с этими препаратами после получения положительного результата в какой-либо из поливалентных сывороток (или поливалентных иммуноглобулинов), исключая этап «ориентировочного положительного результата» с OK-сывороткой.

При отсутствии OK-иммуноглобулинов и адсорбированных O-сывороток для реакции агглютинации на стекле определение OK-группы эшерихий проводят обычным способом при помощи OK-сывороток в пробирочной реакции агглютинации с живой и прогретой (при 100 °C — 1 час) культурами. Для постановки пробирочной реакции агглютинации в объеме 1 мл делают два ряда возрастающих двукратных разведений сывороток в стерильном ИХН, начиная о разведения 1:50 до O-титра, указанного на этикетке, не принимая во внимание титр K-антител. Во все пробирки первого ряда вносят по 1 капле взвеси живых бактерий в ИХН, а второго ряда — по 2 капли той же взвеси бактерий, предварительно прогретой и охлажденной.

Контролем антигенов являются взвеси живых и прогретых бактерий в пробирках с ИХН в том же объеме, что и в разведениях сыворотки. Учет результатов проводят через 18 — 20 часов инкубации при 37 °C невооруженным глазом (живая культура) и в агглютинскопе (прогретая культура). Для живой культуры характерно образование крупнохлопчатого K-агглютината, для прогретой — мелкозернистого O-агглютината. Результат оценивают как положительный при одновременном наличии K-агглютината до титра или половины титра K-антител, указанного на этикетке, а также O-агглютината до титра или половины титра O-антител, указанного на этикетке, либо O-агглютината в обоих рядах пробирок до титра или половины титра O-антител. Последнее указывает на отсутствие K-антигена (E. coli 0151:K-) или на его потерю у штамма, принадлежащего к определенной серогруппе.

После установления OK-серогруппы у подвижных штаммов E. coli определяют серовар по H-антигену. Штаммы, предварительно пассированные на полужидком агаре в пробирке Крейджи <*>, могут быть испытаны двумя способами: в реакции агглютинации на стекле и методом иммобилизации в полученном агаре в пробирках. В обоих случаях используют коммерческие H-сыворотки, которые выпускают для метода иммобилизации. Вначале применяют поливалентные, при положительном результате — моновалентные H-сыворотки, входящие в смесь. В реакции агглютинации на стекле используют взвесь культуры, выросшей на глицериновом агаре после пассажа в пробирке Крейджи. Для получения взвеси в пробирку наливают ИХН (до верхнего края скошенного глицеринового агара), осторожно смывают культуру бактерий, вращая пробирку между ладонями. Каплю взвеси бактерий пипеткой вносят в каплю сыворотки на стекле и смешивают при покачивании. Образование агглютината указывает на положительный результат.

<*> Как указывалось, посев делают уколом петли через выступающий над средой конец трубочки до дна пробирки, а высев — из верхнего слоя среды в пробирке.

Для постановки реакции иммобилизации среду готовят заранее: сыворотку смешивают с предварительно растопленным и охлажденным до 45 — 50 °C полужидким (0,3-процентным) СПА в соответствии с наставлением по применению препаратов. Не допуская застывания, среду разливают по 2,5 мл в стерильные пробирки. Для контроля стерильности пробирки со средой помещают в термостат на 48 часов при 37 °C. Стерильная среда может быть использована для работы (при сохранении ее в холодильнике) в течение месяца. Культуру подвижных штаммов (с верхнего слоя полужидкого агара в пробирке Крейджи) засевают уколом в пробирки с приготовленной средой, инкубируют (20 — 37 °C) в течение 18 — 20 часов. При соответствии H-антигена испытуемого штамма и H-сыворотки бактерии растут вдоль линии укола (положительный результат). При несоответствии H-антигена и H-сыворотки наблюдают рост в виде диффузного помутнения среды в пробирке (отрицательный результат). В случаях определения H-антигена у слабоподвижных штаммов проводят многократное пассирование на полужидком агаре в пробирках Крейджи, после чего определяют H-антиген по указанной методике. Антигенно-диагностическая схема известных ЭПЭ представлена в табл. 22.

<*> Неподвижные штаммы (H-) могут быть и в других серогруппах и являются самостоятельными сероварами.

<**> Объединены обе разновидности — 0128ab:K67 и 0128ac:K67.

Во всех случаях, включая поиск возбудителей парентеральных эшерихиозов, исследование проводят обычным бактериологическим методом, начиная с определения вида E. coli по биохимическим признакам с последующим серологическим типированием.

Среди культур, выделяемых при этом, могут быть штаммы с K-антигеном типа A, который не разрушатся при кипячении. Поэтому в случае O-инагглютинабельности бактерий после кипячения их следует автоклавировать при 120 °C в течение 2,5 часа, после чего повторно испытывать в реакции агглютинации с O-сыворотками. Серологическое типирование эшерихий, не относящихся к ЭПЭ, проводят по O- и H-антигенам в соответствии со схемой (табл. 23) и при наличии диагностических препаратов.

Примечание: среди возбудителей парентеральных эшерихиозов могут встречаться эшерихии и других O-групп и сероваров.

Штаммы, принадлежащие по биохимическим свойствам к виду E. coli (см. табл. 7), испытывают в реакции агглютинации на стекле. Для этого суточный рост культуры на скошенном СПА смывают 2 мл ИХН. Полученную густую взвесь переносят в пробирки и прогревают на водяной бане при 100 °C в течение 30 минут. Одну каплю гретого диагностикума соединяют с каплей сыворотки на предметном стекле путем многократного покачивания, после чего учитывают результат при помощи лупы или вогнутого зеркала. Реакция может быть замедленной, в связи с чем отрицательный результат наблюдают 3 — 5 минут. В положительном случае образуется мелкозернистый O-агглютинат.

После установления O-антигена у штамма определяют H-антиген в пробирочной реакции агглютинации, для чего можно использовать H-сыворотки, выпускаемые для реакции иммобилизации. Сыворотку с этой целью используют в том же или в 2 раза большем разведении по сравнению с указанными для реакции иммобилизации. Для приготовления H-диагностикума исследуемый штамм пассируют в полужидком 0,3-процентном СПА в пробирках Крейджи по меньшей мере трехкратно. После пассирования штамм засевают в пробирку с бульоном, выращивают до следующего дня в термостате при 25 — 30 °C, при отсутствии этих условий можно выращивать при 37 °C. В бульонную культуру добавляют 0,5% (по объему) формалина и оставляют при комнатной температуре до следующего дня. Реакцию агглютинации ставят в узкой или лучше конусообразной пробирке, содержащей 0,5 мл разведенной сыворотки с добавлением равного объема приготовленного формалинизированного диагностикума. Инкубируют 2 часа при 37 °C и 30 минут при комнатной температуре. Результат учитывают невооруженным глазом, избегая встряхивания пробирки. В случае положительных результатов образуется рыхлый придонный агглютинат, легко разрушающийся при встряхивании. При наличии H-сывороток для реакции агглютинации H-антиген определяют в реакции агглютинации на стекле согласно наставлению по применению препаратов без предварительного многократного пассирования штамма через полужидкий агар.

Род Citrobacter включает два вида: Citrobacter freundii и Citrobacter intermedius. Дифференциация видов возможна при использовании тестов, приведенных в таблице 24.

<*> Даны дифференцирующие тесты для биовара diversus, рассматриваемого в некоторых классификациях как вид.

Для эпидемиологических целей бактериям рода Citrobacter могут быть даны серологические характеристики в соответствии с антигенно-диагностической схемой (см. соответствующий раздел «Методических указаний»).

Род Klebsiella. Характерной особенностью представителей рода является их неподвижность, способность образовывать капсулы. Род представлен тремя видами (см. табл. 1), дифференциацию которых осуществляют с помощью тестов, приведенных в табл. 25

<*> K. pneumoniae, образующие индол, а иногда и замедленно разжижающие желатин, именуют биоваром oxytoca (по некоторым классификациям этот биовар расценивают как самостоятельный вид K. oxytoca).

Определение K-сероваров — см. соответствующий раздел «Методических указаний».

Род Enterobacter объединяет подвижные, иногда образующие капсулы энтеробактерии, представленные двумя видами: E. cloacae и E. aerogenes. Дифференциации видов проводят с помощью биохимических тестов, приведенных в табл. 26.

Антигенно-диагностическая схема для рода Enterobacter не разработана.

Род Hafnia. Характерным свойством гафний является изменение ферментативной активности при различной температуре культивирования (реакции с метиловым красным и Фогеса — Проскауэра, газообразование в среде Гисса с глюкозой, утилизация цитрата в среде Симонса).

Род Hafnia представлен одним видом Hafnia alvei, основные биохимические свойства которого с учетом влияния на некоторые из них температурного режима инкубации приведены в табл. 27.

Примечание. В рамках указаны свойства, изменяющиеся в зависимости от температуры культивирования.

Род Serratia. Представители рода подвижны, иногда образуют капсулу; обращает на себя внимание способность некоторых штаммов образовывать пигмент фуксиново-красного или розового цвета. Род представлен одним видом Serratia marcescens, объединяющим ряд биоваров (табл. 28), расцениваемых в некоторых классификациях как самостоятельные виды (S. liquefaciens, S. rubidaea).

<*> Слабое газообразование.

Род Proteus. В состав рода входят 5 видов (см. табл. 1), из которых по крайней мере двум видам (P. vulgaris и P. mirabilis) свойственна способность к роению (вуалеобразный рост на плотных средах). Идентификацию видов осуществляют с использованием биохимических тестов, приведенных в табл. 29, а определение подгрупп A и B вида Proteus inconstans (Providencia) — в соответствии с табл. 30.

Для серологической идентификации двух видов Proteus (P. vulgaris, P. mirabilis) разработана антигенно-диагностическая схема и выпускаются коммерческие агглютинирующие сыворотки (см. соответствующий раздел «Методических указаний»). Для P. inconstans (Providencia) разработана антигенно-диагностическая схема, но нет выпуска коммерческих сывороток. При отсутствии диагностических агглютинирующих H-сывороток и необходимости установления однородности выделенных штаммов протея по H-антигену используют феномен Дикоса (см. раздел «Определение эпидемиологических маркеров»).

Род Edwardsiella представлен одним видом Edwardsiella tarda, биохимические свойства которого приведены в табл. 31.

Род Yersinia включает три вида (см. табл. 1), из них Y. pestis подлежит изучению в специальной сети лабораторий. Характерной особенностью Y. enterocolitica и pseudotuberculosis является более низкий оптимум температуры культивирования (22 — 25 °C) и рост на пластинчатых средах в виде мелких колоний-росинок, нередко с выраженным полиформизмом, усугубляющимся при 37 °C и менее выраженным при 22 — 25 °C.

По совокупности биохимических тестов (табл. 32) может быть проведена дифференциация видов Y. pseudotuberculosis и Y. enterocolitica.

<*> Без вида Y. pestis.

Определение серологических характеристик иерсиний в практических лабораториях не проводят в связи с отсутствием производственного выпуска диагностических сывороток.

Дополнительным тестом для идентификации Y. pseudotuberculosis служит достаточно специфичный бактериофаг (<...>), выпускаемый как коммерческий препарат. Большинство свежевыделенных штаммов Y. pseudotuberculosis хорошо лизируется этим бактериофагом; методика постановки пробы обычная, с использованием цельного и разведенного фага.

Род Erwinia по совокупности биохимических и других биологических свойств делят на три группы (см. табл. 1), объединяющие <...> видов. Оптимум роста 27 — 30 °C. Из клинических материалов от человека и животных выделяют Erwinia herbicola. Оптимальной температурой для E. herbicola является 25 — 27 °C. Некоторые представители обладают способностью образовывать желтый пигмент. Биохимические свойства Erwinia herbicola приведены в табл. 33.

Таблица 33

2.3.4. Ускоренная идентификация и выявление антигенов энтеробактерий

Эти методы направлены либо на ускорение этапов обычного бактериологического анализа, либо на индикацию бактерий без выделения чистой культуры возбудителя.

2.3.4.1. Системы индикаторные бумажные (СИБ)

Системы состоят из индикаторных бумажек, представляющих собой пропитанные необходимыми для дифференциации субстратами индикаторные диски или полоски хроматографической бумаги, стабилизированные полимерным покрытием. Системы СИБ выпускают в виде наборов разного назначения: набор № 1 (13 наименований) предназначен для идентификации вибрионов; № 2А — малый набор, включающий 9 наименований, — для межродовой дифференциации энтеробактерий. Он позволяет определять ферментацию лактозы, образование сероводорода и индола, утилизацию цитрата и малоната, гидролиз мочевины, дезаминирование фенилаланина, декарбоксилирование лизина и наличие бета-галактозидазы. Набор № 2Б — расширенный, включающий 25 наименований, предназначен для дальнейшей дифференциации энтеробактерий. В него включены, помимо субстратов, содержащихся в наборе № 2А, оркитин, желатин, реактив для определения цитохромоксидазы и широкий набор углеводов. Набор № 3 предназначен для ускоренного определения обсемененности воды E. coli и состоит из двух компонентов, обеспечивающих определение ферментации глюкозы и цитохромоксидазы.

Работа с СИБ требует наличия чистой 18 — 24-часовой агаровой культуры.

Для определения цитохромоксидазы суточную агаровую культуру растирают петлей на соответствующей индикаторной бумажке, помещенной в чашку Петри. Цитохромоксидазоположительные культуры (не энтеробактерии) вызывают синее окрашивание через 30 — 60 секунд. Цитохромоксидазоотрицательные не изменяют окраски.

Образование индола определяют в пробирках с 0,2 — 0,3 мл ИХН, pH 7,2 — 7,4, куда вносят полную петлю агаровой культуры и затем стерильным пинцетом опускают в пробирку сложенную вдвое «индольную» бумажку так, чтобы короткий конец, имеющий желтоватую окраску, находился над поверхностью суспензии. Пробирки помещают в термостат на 2 часа, однако положительный результат (красно-малиновое окрашивание) зачастую проявляется уже через 30 — 40 минут.

Фенилаланиндезаминазу определяют также в микробной взвеси. В пробирку погружают диск с фенилаланином, выдерживают 1 час при 37 °C и затем погружают в суспензию другой диск с хлоридом железа. При положительном результате через 10 — 15 секунд появляется зеленое окрашивание.

Наличие бета-галактозидазы определяют, помещая в суспензию на 4 — 8 часов (при 37 °C) соответствующий диск. Предварительный учет возможен через 1 час. В случае положительной реакции диск желтеет.

Определение желатиназы проводят также в микробной взвеси, помещая в нее диск засвеченной и проявленной фотопленки, с последующей инкубацией при 37 °C в течение 18 — 24 часов. Предварительный учет возможен через 4 — 5 часов. При положительной реакции фотопленка просветляется, а на дне пробирки выпадает черный осадок.

Образование сероводорода определяют в чашках Петри на СПА или в пробирках с полужидким агаром (0,4 — 0,6%). На поверхностях агара в чашке делают посевы петлей в виде площадок (примерно 0,5 куб. см). В полужидкий агар культуру засевают уколом. Индикаторные бумажки помещают на засеянные площадки или на поверхность полужидкого агара в пробирку. Посевы инкубируют 18 — 24 часа при 37 °C. Предварительный учет возможен через 5 часов. При положительной реакции диски чернеют. В пробирках можно учитывать также и подвижность бактерий.

При определении отношения к аминокислотам, утилизации цитрата и малоната суточную агаровую культуру суспендируют в 0,2 — 0,3 мл забуференного раствора ИХН с pH 5,4 — 5,6. В суспензии помещают (стерильным пинцетом) соответствующие индикаторные диски и выдерживают при 37 °C 18 — 24 часа. Пробирки с «аминокислотными» дисками до инкубирования заливают стерильным вазелиновым маслом (0,1 — 0,2 мл). При положительном результате в тестах с аминокислотами появляется синее или интенсивно зеленое окрашивание. В тестах с цитратом окрашивание малиново-красное, при этом возможен предварительный учет через 5 часов.

Ферментацию углеводов определяют на СПА в чашках Петри или в пробирках, содержащих 0,2 — 0,3 мл ИХН или 1% пептонной воды. Посевы делают, как уже было сказано ранее. «Углеводные» диски помещают на засеянные площадки агаровой поверхности или в пробирки с микробной взвесью. Для определения газообразования на диск с глюкозой в чашке наносят 4 — 5 капель расплавленного и охлажденного до 45 °C полужидкого (0,6 — 0,8-процентного) агара, а в пробирку с «глюкозным» диском помещают маленький кусочек стерильной ваты. Чашки и пробирки выдерживают в термостате при 37 °C 5 часов. При положительном результате диски на агаровых культурах изменяют первоначальный красный цвет на желтый, в пробирках среда приобретает желтую окраску. В чашках результаты следует учитывать точно через 5 часов (позднее возможна редукция); в пробирках учет результатов возможен и через 18 — 20 часов.

Подробности работы с системами СИБ изложены в наставлениях, прилагаемых к наборам.

В отдельных случаях системы СИБ могут давать нечеткие результаты, что зависит, в основном, от ряда нарушений (работа со смешанными культурами, недостаточная концентрация микробных клеток в суспензии, нарушение режима pH, какие-либо отклонения от правил, изложенных в наставлении) и некоторых других факторов.

2.3.4.2. Метод иммунофлуоресценции

Метод применяют для обнаружения энтеробактерий в испражнениях, рвотных массах и другом материале от больных или из объектов окружающей среды в качестве экспресс-метода индикации.

Для учета реакции используют люминесцентный микроскоп: МЛ-1, МЛ-2, МЛ-3 или МЛД-1 (последний предназначен для работы в полевых условиях), «Люмам» (Р-1, Р-2, Р-3). При люминесцентной микроскопии применяют специальные осветители: ОИ-18, ОИ-17, ОСЛ-1 или ОИ-28 (портативный).

Препараты для исследования готовят путем непосредственного нанесения материала на предметное стекло (в случаях предположения о массивном обсеменении) или с предварительным подращиванием на питательных средах. В первом случае при исследовании жидкого материала делают тонкий мазок, при оформленном стуле или исследовании пищевых продуктов готовят 20-процентную суспензию в ИХН. Для мазка используют верхнюю часть суспензии после ее отстаивания в течение 20 минут или центрифугирования при 1000 об./мин. в течение 5 — 10 минут. При подращивании в соответствующих средах обогащения их выдерживают при 37 °C в течение 18 — 20 часов, на плотных дифференциально-селективных средах — 4 часа, после чего готовят мазки или отпечатки. Лучшие результаты — сочетание исследования прямых мазков и мазков после подращивания. Иммунофлуоресценцию можно использовать при обычном ходе бактериологического анализа, сделав мазки из подозрительных колоний, выросших на плотной среде (Эндо, ЭМС-агар, среда Плоскирева, ВСА).

Для выявления энтеробактерий используют прямой и непрямой люминесцентно-серологический методы.

Прямой метод — мазки исследуемого материала подсушивают на воздухе и фиксируют 96° этиловым спиртом (можно смесью Никифорова) в течение 15 минут (или путем трехкратного проведения через пламя горелки). Фиксированные препараты немедленно помещают во влажную камеру (чашки Петри, кюветы, эксикаторы с увлажненной ватой или фильтровальной бумагой), наносят на них пастеровской пипеткой каплю люминесцирующей сыворотки в рабочем разведении на срок, указанный в наставлении по применению люминесцирующей сыворотки. После экспозиции мазки тщательно промывают ИХН или 0,15 М раствором NaCl в течение 10 минут, дважды меняя раствор в стаканчике, или под текущей струей, ополаскивают дистиллированной водой и подсушивают на воздухе. В случае необходимости фиксированные мазки можно хранить несколько дней в минусовом отсеке холодильника.

При необходимости корректирования рабочего разведения заведомо известный штамм подвергают окрашиванию люминесцирующей сывороткой, взятой в нескольких разведениях (выше и ниже указанного на этикетке). Максимальное разведение, которое обеспечивает яркое специфическое свечение микробов в данном микроскопе, оценивают как «красящий титр». В качестве рабочего разведения принимают удвоенный «красящий титр».

Мазки исследуют в темной комнате. При использовании иммерсионной системы применяют специальное нелюминесцирующее масло. Для получения достоверных результатов необходимо просматривать не менее 20 — 25 полей зрения.

Бактерии, окрашенные люминесцирующей сывороткой, имеют яркое зеленоватое свечение периферии клетки, по морфологии соответствующей энтеробактериям. Такое свечение называют специфическим в отличие от неспецифического, характеризующегося равномерным свечением всего тела клетки.

Для оценки интенсивности свечения используют систему 4-х плюсов: «++++» — очень яркая флуоресценция на периферии клеток, четко контрастирующая с темным телом бактерий; «+++» — яркая флуоресценция периферии клетки; «++» или «+» — слабое свечение периферии клетки, не контрастирующее с телом клетки.

Положительными результатами считают реакции на «++++» и «+++» при наличии 2 — 5 специфически светящихся клеток в каждом поле зрения. В отношении антигенно обособленных энтеробактерий, например S. sounei, для положительного ответа достаточно обнаружить в препарате единичные ярко светящиеся палочковидные микробы.

Прямая микроскопия мазка из нативного материала от больных при высокой концентрации возбудителя (500 тысяч — 1 млн. клеток в 1 г) позволяет дать положительный ответ через 45 — 60 минут. При использовании метода накопления и при незначительной концентрации возбудителя (тысячи — десятки тысяч клеток) результаты могут быть получены в период от 5 до 20 часов.

Непрямой метод — на препарат, содержащий антиген, наносят капли диагностической немеченной сыворотки и оставляют при комнатной температуре на 10 — 20 минут (во влажной камере), затем промывают 0,15 М раствором NaCl (pH 7,2 — 7,4) дважды по 10 минут для удаления несвязавшейся сыворотки. Мазки подсушивают на воздухе и на 10 — 20 минут наносят капли люминесцирующей антивидовой сыворотки против глобулинов того вида животного, от которого получена примененная иммунная сыворотка. Мазки промывают и просматривают, как при прямом методе. Для непрямого метода обязателен контроль: изучаемый антиген, обработанный люминесцирующей сывороткой.

2.4. Формулировка ответов, сроки выдачи

1. В отчете о выделении патогенных энтеробактерий название микроорганизма следует давать в латинской транскрипции, указывая его род, вид, серологическую характеристику; в случаях определения эпидмаркеров эти данные указывают после названных.

Наименование сероваров эшерихий приводят по их антигенным формулам с указанием O-, K-, H-антигенов (для энтеропатогенных разновидностей); O- H-антигенов — для возбудителей парентеральных эшерихиозов.

Например: «Выделены S. flexneri (Shigella flexneri) 4a (биовар 7)»

«Выделены S. typhi (Salmonella typhi)»

«Выделены E. coli (Escherichia coli) 055:K59:H2» или

«Выделены E. coli (Escherichia coli) 01:H4».

2. При выделении УПЭ в отсутствие патогенных энтеробактерий вначале следует указать: «Патогенные энтеробактерии не выделены, выделены _________».

Для УПЭ правила написания рода и вида выделенных бактерий те же, что в пункте 1.

В случаях проведения количественных определений УПЭ после их названия 7 указывают: «______ 10 КОЕ/г (мл)» <*>.

<*> КОЕ — колониеобразующая единица.

Если дозированные посевы не применяли (количественные определения не проводили), однако в прямом посеве на пластинчатых средах очевидно преобладание однородных колоний названного вида (при исследованиях материалов, имеющих собственную микрофлору), следует указать: «_______ обильный рост <**> » или « абсолютное преобладание ________».

<**> Сплошной рост не поддающихся подсчету колоний установленного вида.

3. Отрицательный ответ при бактериологических исследованиях на выделение патогенных энтеробактерий может быть выдан в следующие сроки: при исследовании крови — на 10-й день исследования после четырех высевов на пластинчатые среды;

при исследовании желчи (дуоденального содержимого) — на 8-й день исследования после 4-х высевов на пластинчатые среды;

при исследовании мочи, испражнений, секционного материала без использования сред обогащения (при отсутствии «подозрительных колоний» на пластинчатых средах первичного посева) — на 2-й день исследования;

то же с использованием сред обогащения (при отсутствии «подозрительных колоний» на пластинчатых средах, засеянных со сред обогащения) — на 3-й день исследования;

при отсутствии в прямых посевах на пластинчатые среды колоний, дающих агглютинацию на стекле с OKA-сывороткой эшерихий, — 2-й день исследования — выдают ответ об отсутствии эшерихий серологических групп, представленных в OKA поливалентной агглютинирующей сыворотке.

При оценке этиологической значимости выделения УПЭ из клинических материалов, обладающих в норме собственной микрофлорой, могут быть использованы следующие данные:

а) количественный показатель — наличие установленных УПЭ при высевах на

                          -5     -6
пластинчатые  среды  из 10   - 10   разведения исследуемого материала, т.е.

               6

содержание УПЭ — 10 КОЕ и более на 1 г исследованного субстрата;

б) повторность выделения идентичных микроорганизмов в значительных, особенно нарастающих количествах и исчезновение в период реконвалесценции;

в) ответная реакция макроорганизма — нарастание титра антител к обнаруженным УПЭ при исследовании в динамике («парных» сывороток) в период до 10 — 14 дней от начала заболевания.

<*> Для приготовления питательных сред используют химически чистые реактивы.

3.1. Консерванты

    Состав: Натрий хлорид (NaCl), 0,85-процентный раствор         - 1000 мл
            Глицерин нейтральный                                  - 500 мл

Натрий гидрофосфат, безводный (Na HPO ),

                                             2   4
            20-процентный раствор                                 - 150  мл

Приготовление: смешивают первые два ингредиента и добавляют раствор гидрофосфата натрия в таком количестве, чтобы довести pH до 7,8 — 8,0, затем разливают в пробирки или флаконы по 10 мл, стерилизуют в автоклаве при 112 °C в течение 15 минут или текучим паром 3 дня подряд. После стерилизации pH 7,6 — 7,8.

Фосфатно-буферный

    Состав: Калий дигидрофосфат (KH PO )                          - 0,45 г
                                   2  4
            Натрий гидрофосфат, безводный (Na HPO )               - 5,34 г
                                             2   4
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 10 мл в пробирки или флаконы, стерилизуют в автоклаве при 121 °C 30 минут.

Буферный глицерино-солевой

    Состав: Натрий хлорид (NaCl)                                   - 4,2 г
            Калий гидрофосфат (K HPO )                             - 3,1 г
                                2   4
            Калий дигидрофосфат (KH PO )                           - 1,0 г
                                   2  4
            Глицерин нейтральный                                   - 300 мл
            Вода дистиллированная                                  - 700 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют, перемешивают, смесь разливают в стерильные пробирки по 5 мл и автоклавируют при 112 °C 30 минут. Рекомендуется с целью контроля в процессе хранения раствор слабо подкрашивать феноловым красным.

Изотонический раствор хлорида натрия

    Состав: Натрий хлорид (NaCl)                                  - 6,5 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: соль растворяют при подогревании, фильтруют, разливают в пробирки по 5 — 7 мл, стерилизуют при 121 °C 30 минут.

3.2 Среды обогащения <*>

<*> Для получения сред обогащения двойной концентрации (при исследовании жидких материалов) соответственно уменьшают вдвое объем дистиллированной воды.

Селенитовая среда

Состав: Натрий гидроселенит (NaHSeO ) 3 без примеси теллура — 4 г

Пептон венгерский «Рихтер»

            или чехословацкий "Спофа"                             - 5 г
            Натрий гидрофосфат, безводный (Na HPO )               - 7 г
                                             2   4
            Натрий дигидрофосфат, безводный (NaH PO )             - 2 г
                                                2  4
            Лактоза                                               - 4 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: среду готовят из двух основных растворов.

    Раствор I. Определяют пропорцию Na HPO  и NaH PO  используемым образцом
                                      2   4      2  4
пептона  и гидроселенита натрия для установления pH в пределах 6,9 - 7,1, с
этой  целью  регулируют  соотношение фосфатов. Подтитровка нужна всегда при
изменении  серии  любого  из  входящих в среду основных ингредиентов. После
установления  соотношения фосфатов к раствору I добавляют пептон и лактозу.
Разливают  во  флаконы  по  50 мл и стерилизуют текучим паром два дня по 30
минут.  Количество  фосфатов  в  рецепте  среды дано в расчете на безводные
препараты.   При   отсутствии   таковых   заранее   заготовленные   навески

«выветривают» в термостате в течение 15 — 16 суток.

Раствор II. 10-процентный раствор гидроселенита натрия готовят на стерильной дистиллированной воде перед употреблением. Перед началом работы в каждый флакон с 50 мл основного раствора (I) добавляют 2 мл раствора гидроселенита натрия (раствора II), асептически разливают по 5 — 7 мл в стерильные пробирки и закрывают плотно пробками. Дальнейшая стерилизация не требуется.

Основной раствор (I) для среды можно хранить в холодильнике 1 — 2 месяца. Для приготовления среды следует использовать высококачественный пептон («Рихтер», «Спофа» или жидкий аминопептид — отечественный заменитель импортного пептона).

Селенитовый бульон с аминопептидом

    Состав: Бульон аминопептидный                                  - 950 мл
            Натрий гидрофосфат (Na HPO )                           - 8 г
                                  2   4
            Натрий дигидрофосфат (NaH PO )                         - 2 г
                                     2  4

Натрий гидроселенит (NaHSeO ), 3 10-процентный водный раствор — 40 мл

Приготовление: реакцию среды не устанавливают, т.к. pH колеблется в пределах 7,1 — 7,2. Стерилизуют при 112 °C 20 минут. Непосредственно перед употреблением добавляют 40 мл стерильного 10-процентного водного раствора натрия гидроселенита (pH при этом снижается на 0,1 — 0,2), среду хорошо перемешивают и асептически разливают в стерильные пробирки по 5 мл.

Примечание: фосфаты натрия могут быть заменены калийными в тех же количествах.

Приготовление аминопептидного бульона

    Состав: Аминопептид                                            - 250 мл
            Натрий хлорид (NaCl)                                   - 5,5 г
            Вода дистиллированная                                  - 750 мл

Приготовление: среду хорошо перемешивают, стерилизуют при 121 °C 20 мин. Готовый бульон можно хранить в бутылях неопределенный срок, желательно при 6 — 10 °C.

Магниевая среда

Состав: готовят три раствора.

Раствор I.

           Пептон                                                 - 4,2 г
           Натрий хлорид (NaCl)                                   - 7,15 г
           Калий дигидрофосфат (KH PO )                           - 1,48 г
                                  2  4
           Дрожжевой диализат                                     - 9 мл
           Вода дистиллированная                                  - 890 мл

Раствор II.

           Магний хлорид (MgCl  х 6H O)                           - 35,7 г
                              2     2
           Вода дистиллированная                                  - 90 мл

Раствор III.

Бриллиантовый зеленый, 0,5-процентный водный раствор — 0,9 мл

Приготовление: все три раствора в указанных количествах смешивают, разливают в необходимых объемах в колбы, флаконы или пробирки, стерилизуют при 112 °C 30 минут.

(тетратионатовый бульон Мюллера)

Состав: Мел, стерилизованный сухим жаром, — 45 г или

Кальций карбонат (CaCO ), сухой стерильный — 25 г 3

Бульон Хоттингера, содержащий 120 — 180 мг

            аминного азота                                         - 900 мл
            Раствор Люголя                                         - 20 мл
            Натрий тиосульфат (Na S O  х 5H O) <*>,
                                 2 2 3     2
            50-процентный стерильный раствор                       - 100 мл

--------------------------------

    <*>  Тиосульфат  натрия  (Na S O  х 5H O)  часто  неправильно   именуют
                                2 2 3     2

гипосульфитом.

Приготовление: в стерильные флаконы помещают по 4,5 г мела, стерилизуют сухим жаром, после чего в каждый флакон наливают по 90 мл бульона Хоттингера. Стерилизуют при 121 °C 30 минут, pH 7,2 — 7,4. Затем ex tempore асептически добавляют в каждый флакон точно по 2 мл раствора Люголя и по 10 мл раствора натрия тиосульфата, хорошо смешивают и разливают по пробиркам. Готовая среда стерилизации не подлежит.

Приготовление растворов: а) раствора Люголя

            Калий иодид (KI)                                       - 20 г
            Йод кристаллический                                    - 25 г
            Вода дистиллированная                                  - 100 мл

б) 50-процентного раствора натрия тиосульфата

В измерительный цилиндр насыпают 50 г натрия тиосульфата и добавляют воду до 100 мл, растворяют, переливают во флакон, стерилизуют текучим паром 30 минут.

Среда Кауфмана

    Состав: Среда Мюллера (стерильная)                             - 500 мл
            Желчь бычья (стерильная)                               - 250 мл

Бриллиантовый зеленый (0,1-процентный водный раствор) — 50 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, асептически разливают в стерильные пробирки по 10 мл, дополнительно не стерилизуют.

20-процентный желчный бульон

    Состав: Бульон мясопептонный или Хоттингера                    - 800 мл
            Желчь бычья нативная                                   - 200 мл

Приготовление: pH должен быть равен 7,6. Разливают в стерильные пробирки или флаконы. Стерилизуют паром 2 дня по 30 минут.

Среда Рапопорт

    Состав: Бульон мясопептонный или Хоттингера                    - 900 мл
            Желчь бычья                                            - 100 мл
            Глюкоза                                                - 20 г
            Индикатор Андреде                                      - 10 мл

Приготовление: ингредиенты смешивают, разливают по 50 мл во флаконы с поплавками. Стерилизуют текучим паром три дня по 30 минут.

Бульон с 0,2% глюкозы для клебсиелл

    Состав: Бульон питательный pH 7,2 - 7,4 (стерильный)         - 100 мл
            Глюкоза                                              - 2 г

Приготовление: в небольшом количестве теплого бульона растворяют глюкозу, раствор добавляют к остальному бульону, тщательно перемешивают, разливают в стерильные пробирки по 5 — 6 мл, стерилизуют при 112 °C 30 минут.

Буферная среда обогащения для иерсиний

    Состав. Натрий хлорид (NaCl)                                   - 8,5 г
            Натрий гидрофосфат (Na HPO  х 12H O) 1/15 М раствор    - 3 мл
                                  2   4      2
            Калий дигидрофосфат (KH PO ) 1/15 М раствор            - 7 мл
                                   2  4
            Вода дистиллированная                                  - 990 мл

Приготовление: предварительно готовят по 100 мл 1/15 М растворов указанных солей. Затем к ИХН добавляют необходимое количество приготовленных растворов, смешивают, фильтруют, разливают в пробирки по 5 — 6 мл и стерилизуют при 116 °C 10 минут или 30 минут текучим паром, pH среды 7,2.

3.3. Среды для первичных посевов материала и высевов со сред обогащения

Среды Плоскирева, ЭМС-агар, Эндо, ВСА выпускают в сухом виде. Приготовление сред из сухих препаратов в соответствии с указаниями на этикетках.

Среды с антибиотиками для выделения шигелл

Питательные среды с антибиотиками готовят путем добавления соответствующих препаратов антибиотиков к среде Плоскирева или ЭМС-агару. При выборе антибиотика исходят из результатов определения чувствительности к антибиотикам шигелл, выделяемых в данной местности. Подробности приготовления питательных сред с антибиотиками — см. «Методические рекомендации по применению селективно-дифференциальных сред с антибиотиками для выделения шигелл», МЗ СССР, 1974. Антибиотики могут быть также введены в среду путем диффузии их из вкладываемых под питательную среду в чашке Петри полосок фильтровальной бумаги, пропитанных растворами соответствующих антибиотиков («метод подосок»). Полоски размером 4 х 0,5 см готовят из фильтровальной бумаги, укладывают «ребром» по 200 штук в чашки Петри и стерилизуют в автоклаве при 121 °C 30 минут, затем подсушивают и пропитывают растворами антибиотиков (левомицетин и тетрациклин в концентрациях 250 мкг/мл, стрептомицин — 500 мкг/мл). Могут быть использованы и другие антибиотики. На смачивание 200 полосок расходуют 12,5 мл раствора антибиотика. Пропитанные раствором антибиотика полоски подсушивают при 37 °C 18 — 20 часов. Готовые полоски хранят в банках с притертыми пробками в холодильнике не более 3-х месяцев.

(для выделения эдвардсиелл)

    Состав: Экстракт кормовых дрожжей (ЭКД)                       - 20 г
            Маннит                                                - 10 г
            Глюкоза                                               - 2,75 г
            L-лизин                                               - 5 г

        или

            DL-лизин                                              - 10 г
            Желчные соли (по Олькеницкому)                        - 2,5 г
            Розоловая кислота (5-процентный спиртовой раствор)    - 2 мл
            Железо (III) - аммоний цитрат (смесь солей 1:1)       - 0,8 г

а) Железо (III) цитрат (FeC H O ) 6 5 7

б) Аммоний цитрат /(NH ) C H O / 4 3 6 5 7

            Натрий тиосульфат (Na S O  х 5H O)                    - 6,8 г
                                 2 2 3     2
            Агар                                                  - 25 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: в 20 мл воды растворяют тиосульфат натрия и смесь цитратов в указанных количествах. Все остальные ингредиенты растворяют в воде при подогревании в водяной бане до полного расплавления агара и добавляют приготовленный раствор солей, затем среду фильтруют, устанавливают pH 6,9 — 7,1. Стерилизуют при 112 °C 30 минут, разливают в чашки Петри.

3.4. Среды для первичной идентификации

Агар Клиглера

Коммерческая сухая среда готовится в соответствии с указаниями на этикетке препарата. Готовая к употреблению среда имеет красновато-бурый или оранжево-красный цвет, при скашивании следует оставлять столбик высотой 2 — 2,5 см.

Трехсахарный агар с мочевиной по Олькеницкому

    Состав: Агар питательный сухой                                - 25 г
            Лактоза                                               - 10 г
            Сахароза                                              - 10 г
            Глюкоза                                               - 1 г

Аммоний-железо (II) сульфат

            /(FeSO  х (NH ) SO  х 6H O/                           - 0,2 г
                  4      4 2  4     2
            Натрия тиосульфат (Na S O  х 5H O)                    - 0,3 г
                                 2 2 3     2
            Мочевина                                              - 10 г
            Феноловый красный (0,4-процентный водный р-р)         - 4 мл
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: соли предварительно растворяют в небольшом объеме дистиллированной воды. Углеводы и мочевину также растворяют в небольших объемах воды при подогревании на водяной бане. Сухой питательный агар расплавляют в оставшемся объеме воды при нагревании и помешивании. Затем все ингредиенты соединяют, перемешивают с расплавленным агаром, фильтруют через марлевый фильтр, устанавливают pH 7,2 — 7,4. Добавляют индикатор, хорошо перемешивают, разливают в пробирки по 6 — 7 мл. Стерилизуют текучим паром 3 дня подряд по 20 минут. Скашивают, оставляя столбик 2 — 2,5 см. Готовая среда бледно-розового цвета.

3.5. Среды для биохимической дифференциации

Цитратный агар Симонса

Коммерческая сухая среда готовится согласно указаниям на этикетке препарата. Среду разливают по 5 — 7 мл, при скашивании после стерилизации которых оставляют столбик 2 — 2,5 см.

Ацетатный агар

Коммерческая сухая среда, готовят согласно указаниям на этикетке препарата.

Цитратный агар Кристенсена

Коммерческая сухая среда, готовят в соответствии с указаниями на этикетке препарата.

Среда с малонатом

    Состав: Дрожжевой экстракт жидкий или                         - 30 мл
            Экстракт сухой                                        - 1 г
            Аммоний сульфат (NH ) SO                              - 0,2 г
                               4 2  4
            Калий дигидрофосфат (KH PO )                          - 0,4 г
                                   2  4
            Калий гидрофосфат (K HPO )                            - 0,6 г
                                2   4
            Натрий хлорид (NaCl)                                  - 2 г
            Натрий малонат (CH COOHCOONa)                         - 3 г

                          2

            Глюкоза                                               - 0,25 г
            Бромтимоловый синий (0,2-процентный водный раствор)   - 12 мл
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: в кипящей воде растворяют ингредиенты в указанной последовательности. После добавления каждого реактива среду доводят до кипения, фильтруют, доводят до первоначального объема, охлаждают и устанавливают pH 6,7, добавляют индикатор, разливают в серологические пробирки по 2 мл, стерилизуют при 112 °C 30 минут или при 121 °C 10 минут. Готовая среда имеет бледно-оливковый цвет.

Агар с фенилаланином

    Состав: Дрожжевой экстракт жидкий                             - 100 мл
            или экстракт сухой                                    - 3 г
            Натрий хлорид (NaCl)                                  - 5 г
            Натрий гидрофосфат (Na HPO )                          - 1 г
                                  2   4
            L-фенилаланин                                         - 1 г

        или

            DL-фенилаланин                                        - 2 г
            Агар                                                  - 12 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: дрожжевой экстракт вносят в холодную воду, нагревают ее, затем последовательно добавляют остальные ингредиенты и кипятят до полного расплавления агара (5 — 10 мин.), фильтруют через ватно-марлевый фильтр и разливают по 2 — 3 мл в агглютинационные пробирки. pH среды должен быть 7,0 — 7,2. Стерилизуют при 112 °C 30 минут и охлаждают в скошенном положении.

Готовая среда не окрашена.

<...> фенилаланина.

Реактив: 10-процентный водный раствор железа (III) хлорида — FeCl . 3 Хранят при 4 — 6 °C без доступа света.

Среда с мочевиной по Кристенсену

    Состав: Пептон                                                -  1 г
    Натрий хлорид (NaCl)                                          -  5 г
    Калий дигидрофосфат (K HPO )                                  -  2 г
                          2   4
    Агар                                                          - 20 г
    Глюкоза                                                       - 1 г
    Феноловый красный (0,2-процентный раствор)                    - 6 мл
    Мочевина (20-процентный раствор)                              - 100 мл
    Вода дистиллированная                                         - 1000 мл

Приготовление: пептон, соли и агар растворяют при нагревании, устанавливают pH, фильтруют и стерилизуют при 115 °C 20 минут. Затем добавляют глюкозу и индикатор, стерилизуют текучим паром 1 час, охлаждают до 50 — 55 °C. Раствор мочевины после стерилизации фильтрованием через фильтр Зейтца асептически добавляют к основе <*>. Готовую среду асептически разливают в стерильные пробирки и охлаждают в скошенном положении.

<*> Возможно использование 50-процентного водного раствора мочевины, выдержанного 2 — 3 суток для «самостерилизации», и добавление к среде из расчета конечного содержания мочевины в среде 2%.

Среда с мочевиной по Преусу

    Состав: Бульон Хоттингера                                     - 1000 мл
    Агар                                                          - 15 г
    Глюкоза                                                       - 5 г
    Мочевина (50-процентный водный раствор)                       - 20 мл
    Бромтимоловый синий (0,2-процентный водный раствор)           - 12 мл

Приготовление: агар расплавляют в бульоне при подогревании, фильтруют, устанавливают pH 6,9 — 7,0. Стерилизуют при 121 °C 20 минут. К стерильному питательному агару добавляют глюкозу, мочевину, индикатор. Стерилизуют текучим паром однократно 15 минут, после чего скашивают. Цвет готовой среды оливковый.

Среда Кларка

    Состав: Пептон                                                - 5 г
    Калий гидрофосфат (K HPO )                                    - 5 г
                        2   4
    Глюкоза                                                       - 5 г
    Вода дистиллированная                                         - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют в воде, кипятят 2 — 3 мин., фильтруют через бумажный фильтр, устанавливают pH 6,9 — 7,0, разливают в пробирки. Стерилизуют при 112 °C 20 минут или 3 дня текучим паром по 20 минут.

<*> Выпускаются коммерческие сухие среды с углеводами (глюкозой, лактозой, мальтозой, сахарозой и маннитом).

    Состав: Пептон                                             - 10 г
    Натрий хлорид (NaCl)                                       -  5 г
    Индикатор Андреде                                          - 10 мл
    Углевод                                                    - 5 или 10 г
    Вода дистиллированная                                      - 1000 мл

Примечание: 1) в качестве индикатора pH могут быть использованы растворы бромтимолового синего, фенолового красного или бромкрезолового пурпурного; 2) для специальных целей среду с лактозой готовят с большим содержанием сахара (2 — 10%); 3) к средам может быть добавлен агар (0,2 — 0,4%).

Приготовление: пептон растворяют в воде при подогревании, добавляют хлорид натрия и индикатор, фильтруют, устанавливают pH 7,1 — 7,2, стерилизуют при 121 °C 15 минут. К стерильной основе добавляют соответствующий углевод. Лактозу, глюкозу, маннит или сахарозу добавляют в количестве 1%, а рамнозу, ксилозу, мальтозу, арабинозу, салицин, трегалозу, рафинозу, целлобиозу, дульцит, сорбит, адонит или глицерин — 0,5%. Среду разливают в стерильные пробирки по 3 — 4 мл, в пробирки с глюкозой помещают поплавки (перевернутые бродильные пробирки Дюрхема). Стерилизуют при 110 °C 30 минут или дробно текучим паром (2 дня подряд по 30 минут).

Среда для определения индолообразования

Возможно использование: а) бульона на триптическом переваре казеина (1,2 — 1,4% аминного азота);

б) бульона на триптическом переваре Хоттингера (1,2 — 1,4% аминного азота);

в) 2-процентной пептонной воды;

г) 1-процентной пептонной воды с добавлением 0,3% L-триптофана;

д) полужидкого агара, приготовленного на бульоне Хоттингера.

Приготовление всех названных сред общеизвестно.

Среды с аминокислотами — лизином, орнитином и аргинином

    Состав: Пептон                                             - 5 г
            Дрожжевой экстракт                                 - 3 г

        или

            Аутолизат дрожжей                                  - 12 - 15 мл
            Глюкоза                                            - 1 г

Бромкрезоловый — пурпурный (1,6-процентный спиртовой раствор) — 0,6 мл

Крезоловый красный (0,1-процентный

            спиртовой раствор)                                 - 5 мл
            L-аминокислота                                     - 10 г

        или

DL-аминокислота — 20 г

Указанный в оригинальной прописи индикатор pH может быть заменен на бромтимоловый синий (1 мл 1,6-процентного спиртового раствора).

Вместо дрожжевого экстракта или аутолизата дрожжей можно брать 400 мл мясной воды, соответственно уменьшив объем дистиллированной воды до 600 мл.

Приготовление: в воде растворяют белковую питательную основу и глюкозу. Устанавливают pH 6,0 — 6,1. Затем среду делят на 4 равные части. В каждую из трех порций вносят одну из аминокислот (лизин, орнитин или аргинин) в количестве, зависящем от кристаллизационной формы реактива (L или DL). В последнюю порцию питательной основы аминокислот не добавляют, оставляя ее в качестве контрольной. Среды кипятят 5 — 10 минут и вновь устанавливают pH 6,0 — 6,1. Во все порции вносят раствор индикатора, перемешивают, разливают в агглютинационные пробирки по 2 — 3 мл. Стерилизуют при 110 °C 30 минут.

Среды с органическими кислотами: D-, L- и i-тартрат, мукат

Состав:

    Основа. Пептон                                                - 10 г
            Натрий гидроокись (NaOH) 0,1 N раствор                - 3,5 мл
            Бромтимоловый синий (0,2-процентный водный раствор)   - 12 мл
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Органические кислоты.

            D-тартрат (правовращающая соль винной кислоты)        - 10 г
            L-тартрат (левовращающая соль винной кислоты)         - 5 г

i (или мезо)-тартрат (оптически

            инертная соль винной кислоты)                         - 5 г
            Мукат                                                 - 10 г

Приготовление: готовят основу среды, стерилизуют при 120 °C 15 минут, добавляют одну из органических кислот, устанавливают pH 7,4, асептически разливают в стерильные пробирки по 5 — 6 мл и стерилизуют текучим паром 20 минут.

Готовить среду можно иначе: к указанной основе присоединить одну из органических кислот, установить pH 7,4, разлить в пробирки и стерилизовать при 112 °C 20 минут.

Глицерино-фуксиновый бульон Штерна

Состав: Бульон Хоттингера стерильный, pH 8,0 — 1000 мл

Фуксин основной, насыщенный спиртовой раствор (10-процентный) — 2,5 мл

Натрий сульфит (Na SO )

                              2  3
            (10-процентный водный раствор)                        - 16,6 мл
            Глицерин нейтральный                                  - 10 мл

Приготовление: к бульону добавляют спиртовой раствор фуксина, свежеприготовленный 10-процентный водный раствор сульфита натрия и глицерин, хорошо смешивают, разливают в пробирки по 6 — 7 мл, стерилизуют при 112 °C 15 минут. Хранить среду можно в холодильнике не более 14 дней.

Среда Ворфеля — Фергюсона

    Состав: Натрий хлорид (NaCl)                                  - 2 г
            Калий сульфат (K SO )                                 - 1 г
                            2  4
            Магний сульфат (MgSO  х 7H O)                         - 0,25 г
                                4     2
            Сахароза                                              - 20 г
            Дрожжевой экстракт сухой                              - 2 г

        или

            Дрожжевой экстракт жидкий                             - 88 мл
            Агар                                                  - 15 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Примечание: возможно применение жидкой среды (без добавления агара) согласно оригинальной прописи.

Приготовление: агар расплавляют в теплой воде, добавляют остальные ингредиенты, растворенные в малых количествах воды, хорошо перемешивают, фильтруют, pH не устанавливают, разливают в колбы или флаконы, стерилизуют при 121 °C 15 минут. Перед употреблением разливают в чашки Петри.

3.6. Полужидкий агар для определения подвижности

    Состав: Натрий хлорид (NaCl)                             - 5 г
            Гидролизат Хоттингера                            - 120 - 150 мл
            Агар                                             - 3 - 4 г
            Вода дистиллированная                            - 1000 мл

Приготовление: гидролизат Хоттингера разводят водой до содержания в среде 1,2 — 1,4% аминного азота, добавляют хлорид натрия, устанавливают pH 7,2 — 7,4, добавляют агар и полностью расплавляют его, подогревая среду при постоянном помешивании. Затем фильтруют в горячем состоянии через тканевый фильтр, проверяют прозрачность (визуально) и в случае необходимости осветляют с помощью яичного белка или путем отстаивания в узких сосудах. Среду разливают по 5 мл в пробирки при 121 °C 30 минут. Охлаждают в вертикальном положении.

Примечание: среда может быть одновременно использована для определения индолообразования.

3.7. Среды и реактивы для дифференциации энтеробактерий от представителей других семейств

    Состав: Пептон                                                - 2 г
            Натрий хлорид (NaCl)                                  - 5 г
            Калий гидрофосфат (K HPO )                            - 0,3 г
                                2   4
            Агар                                                  - 3 г
            Бромтимоловый синий (1-процентный водный раствор)     - 3 мл
            Глюкоза                                               - 10 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: среда требует особо тщательного приготовления и использования проверенных ингредиентов. Все вещества, входящие в состав среды, растворяют при подогревании в водяной бане, фильтруют, разливают в пробирки по 5 — 6 мл и стерилизуют при 118 °C 10 минут. Готовая среда имеет pH 7,1 — 7,2.

Другой способ приготовления: основу (все компоненты, кроме глюкозы) готовят, как указано выше, затем разливают в пробирки мерно по 5 мл и стерилизуют при 121 °C в течение 15 минут. Глюкозу в виде 10-процентного водного раствора подвергают стерилизующей фильтрации (через фильтры Зейтца или др.) и добавляют асептически по 0,5 мл в каждую пробирку со стерильной основой, используют после тщательного перемешивания. Допустимо хранение при 4 °C 2 — 3 дня.

Среда с KNO для определения редукции нитратов 3

а) Оригинальная пропись:

Состав: Калий нитрат (KNO ) — 0,2 г 3

            Пептон                                                - 5 г
            Вода дистиллированная                                 - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют, смешивают, устанавливают pH 7,4, разливают в пробирки по 5 мл и стерилизуют при 121 °C 15 минут.

б) Модификация:

Состав: Калий нитрат (KNO ) — 0,1 г 3

            Пептонная вода (0,5-процентная)                       - 1000 мл
            Натрий хлорид (NaCl)                                  - 2,5 г
    Приготовление:    1-процентную    пептонную    воду    разводят   вдвое
дистиллированной  водой, прибавляют хлорид натрия, вносят нитрат калия, все
ингредиенты  растворяют  и  хорошо  перемешивают,  фильтруют через бумажный
фильтр,  устанавливают  pH  7,1  -  7,2,  разливают  в  пробирки  по 5 мл и

стерилизуют при 112 °C 30 минут.

Примечание: нитрат калия (KNO ) должен быть свободен от нитритов 3 (KNO ). 2

Реактив для реакции с метиловым красным

    Состав: Метиловый красный                                      - 0,1 г
            Спирт этиловый 96°                                     - 300 мл
            Вода дистиллированная                                  - 200 мл

Приготовление: краску растворяют в спирте, затем добавляют воду до 500 мл.

Реактивы для реакции Фогеса — Проскауэра

1. <a id="p101244"></a>6-процентный раствор альфа-нафтола

       Состав: альфа-нафтол                                        - 30 г
               Спирт этиловый 96°                                  - 500 мл

2. <a id="p101247"></a>40-процентный раствор KOH

       Состав: Гидроокись калия (KOH)                              - 120 г
               Вода дистиллированная                               - 300 мл

Реактив Эрлиха на индол

    Состав: Пара-диметиламинобензальдегид                           - 1 г
            Спирт этиловый 96°                                      - 95 мл
            Кислота хлористоводородная (HCl) концентрированная      - 20 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте и добавить кислоту. Хранить в темном месте.

    Состав: Пара-диметиламинобензальдегид                           - 5 г
            Спирт амиловый                                          - 75 мл
            Хлористоводородная кислота (HCl), концентрированная     - 25 мл

Приготовление: растворить альдегид в спирте при нагревании (в водяной бане при 50 — 55 °C). Остудить и добавить кислоту. Реактив должен быть желтого цвета. Хранить при 4 °C.

<*> Индикаторные бумажки можно приготовить, используя реактив Ковача или Эрлиха.

Состав: Пара-диметиламинобензальдегид — 5 г

Ортофосфорная кислота (H PO ), очищенная,

                                    3  4
            концентрированная                                       - 10 мл
            Спирт метиловый                                         - 50 мл

Вместо метилового можно использовать этиловый спирт 96° в том же количестве.

Приготовление: в тепловатом растворе ингредиентов смачивают фильтровальную бумагу, высушивают при комнатной температуре и нарезают полосками (0,5 х 6 см). Цвет бумажек желтый. Хранить в банке темного стекла.

Раствор А. Состав: Сульфониловая кислота                          - 8 г
                   Уксусная кислота (5 N раствор)                 - 1000 мл
Раствор Б. Состав: альфа-нафтиламин                               - 5 г

               или

                   Диметил-альфа-нафтиламин                       - 6 г
                   Уксусная кислота (5 N раствор)                 - 1000 мл

Приготовление: ингредиенты растворяют при слабом нагревании. Реактивы токсичны, требуют соответствующего обращения. Хранить их необходимо в склянках темного стекла с притертыми пробками при 4 °C. Срок годности реагентов 2 — 3 месяца (при периодическом контроле на известных тест-штаммах).

Раствор А. Состав: Спирт этиловый 95°                              - 100 мл
                   альфа-нафтол                                    - 1 г
                   Диметил-пара-фенилендиамин гидрохлорид          - 1 г
                   Вода дистиллированная                           - 100 мл

Примечание: раствор А можно хранить в холодильнике до 10 дней, а раствор Б — только один день.

    Состав: Генцианвиолет или кристаллвиолет                       - 1 г
            Спирт этиловый 96°                                     - 10 мл
            Фенол                                                  - 2 г
            Вода дистиллированная                                  - 100 мл

Приготовление: в ступке растворяют краситель с фенолом, постепенно добавляя спирт и воду, сливают во флакон, выдерживают сутки и затем фильтруют через бумажный фильтр.

    Состав: Калий йодид (KI)                                       - 2 г
            Йод кристаллический                                    - 1 г
            Вода дистиллированная                                  - 300 мл

Приготовление: йод и йодид калия растворяют в 10 мл воды, оставляют на сутки в мерной колбе, после чего добавляют воду до 300 мл.

    Состав: а) Фуксин основной                                     - 10 г
               Спирт этиловый 96°                                  - 100 мл

Ингредиенты смешивают и ставят в хорошо закрытом флаконе в термостат на 18 — 20 часов.

            б) Фенол                                               - 5 г
            Вода дистиллированная                                  - 100 мл

Приготовление: 10 мл спиртового раствора основного фуксина (а) добавляют к 100 мл 5-процентного водного раствора фенола (б), получается крепкий карболовый фуксин, который для работы разводят дистиллированной водой 1:10.

4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЭПИДЕМИОЛОГИЧЕСКИХ МАРКЕРОВ ШТАММОВ ЭНТЕРОБАКТЕРИЙ

Для усовершенствования методов эпидемиологического обследования и анализа при инфекциях, вызываемых энтеробактериями, характеризующихся большой сложностью и многообразием форм проявления эпидемического процесса, особое значение имеет внутривидовая (внутрисероваровая) дифференциация возбудителей — их эпидемиологическое маркирование.

В основу дифференциации (определения эпидмаркеров) могут быть положены различные свойства микроорганизмов, характеризующиеся стабильностью: биохимические свойства (биовары), антигенная структура (серовары), чувствительность к бактериофагам (фаговары), колициногенная активность (колициногеновары) или чувствительность к колицинам (колициновары), присутствие в штаммах факторов устойчивости к химиотерапевтическим препаратам (R-плазмид определенного типа) и др. У отдельных возбудителей возможно определение ряда эпидмаркеров.

4.1. Определение сероваров у некоторых условно-патогенных энтеробактерий

Определение сероваров цитробактеров

Определение сероваров возможно у C. freundii при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (таб. 34).

<*> H-антиген, идентичный H-1,5 сальмонелл.

Первоначально культуру испытывают поливалентными O-сыворотками: CiOA, CiOB, CiOC, CiOD, CiOG, каждая из которых включает антитела к ряду O-групп. Например, CiOA содержит антитела к группам 01, 02, 03, 04, 05, 06, 08; CiOB — 09, 010, 011, 012, 013, 014 и т.д. (см. «Наставление по применению O-сывороток для идентификации бактерий Цитробактер»).

При работе с поливалентными сыворотками целесообразно начинать с сывороток CiOA, CiOB, CiOF в связи с большей частотой распространения в стране представителей соответствующих серогрупп. При положительном результате реакции агглютинации с одной из поливалентных сывороток продолжают серологическую идентификацию культур с сыворотками к O-антигенам, входящим в состав поливалентной смеси. При наличии положительной реакции агглютинации с одной из указанных сывороток устанавливают серологическую O-группу штамма. При агглютинации культуры одновременно с двумя или тремя поливалентными O-сыворотками, содержащими общие антитела, культуру дополнительно испытывают с соответствующими факторными сыворотками и на основании полученных данных определяют антигенное строение штамма. После установления O-группы определяют H-антиген с использованием поливалентных и моновалентных H-сывороток. Для определения O- и H-антигена в реакции агглютинации на стекле используют 18 — 20-часовую культуру, на СПА проводят реакцию общепринятым способом.

Определение сероваров протеев

Определение сероваров возможно P. vulgaris и P. mirabilis при помощи специфических O- и H-сывороток в реакции агглютинации на стекле в соответствии с антигенно-диагностической схемой этих бактерий (табл. 35) и «Наставлением по применению агглютинирующих диагностических протейных O- и H-сывороток». Для реакции агглютинации применяют суточную культуру на СПА, которую испытывают вначале с поливалентными, а затем при положительной реакции агглютинации с моновалентными O-сыворотками, входящими в поливалентную. После установления O-группы определяют H-антиген, применяя вначале поливалентные, а затем моновалентные H-сыворотки.

При отсутствии диагностических H-сывороток и необходимости выяснения однородности выделенных штаммов протея по H-антигену (при выявлении источника инфекции и др.) используют феномен Динеса.

Для выявления феномена Динеса хорошо подсушенную чашку с 2-процентным СПА делят пополам, на каждую половину среды (на полюсах диаметра чашки) засевают по одной капле 4 — 5-часовой бульонной культуры. Чашки с посевами помещают при 37 °C на 18 — 20 часов или оставляют на тот же срок при комнатной температуре, после чего учитывают результаты. При наличии двух идентичных по H-антигену штаммов отмечают слияние зон роста в результате роения. При различных H-антигенах между обоими участками образуется разграничительная (демаркационная) зона шириной в 0,5 — 2 мм.

Разработана антигенно-диагностическая схема P. inconstans (Providencia), но производственный выпуск агглютинирующих сывороток отсутствует.

<*> Выпуск коммерческих K-сывороток предполагается в ближайшее время.

Установление сероваров клебсиелл проводят путем определения капсульного (K) антигена в реакции агглютинации на стекле при помощи капсульных K-сывороток. Для получения культуры в капсульной форме исследуемый штамм пассируют через углеводосодержащие среды (0,2-процентный глюкозный бульон и агаровая среда Ворфеля — Фергюсона). Культуру засевают в 0,2-процентный глюкозный бульон и инкубируют в течение 4 час. при 37 °C, после чего пересевают на среду Ворфеля — Фергюсона и инкубируют при той же температуре 18 — 20 часов.

Для реакции агглютинации петлю агаровой культуры со среды Ворфеля — Фергюсона растирают на предметном стекле рядом с каплей соответствующей капсульной клебсиеллезной сыворотки, после чего их тщательно смешивают. Капсульная агглютинация наступает обычно очень быстро и имеет вид крупных хлопьев, тяжей или с трудом разделяемого диска. В сомнительных случаях реакция может наблюдаться в нескольких сыворотках при нахождении культуры в OK- или BK-формах, результат подтверждают в развернутой (пробирочной) реакции агглютинации в разведениях сыворотки 1:2, 1:4. <*>

<*> Проведение реакции агглютинации и отбор культур в К-форме осуществляют в соответствии с «Наставлением по применению клебсиеллезных диагностических агглютинирующих сывороток».

Положительный результат этой реакции оценивают по появлению дискообразного плотного агглютината, всплывающего в виде «зонтика» при встряхивании пробирки, разбиваемого с трудом на крупные хлопья.

Определение серогрупп иерсиний

Определение серогрупп проводят в реакции агглютинации на стекле или в пробирках с кроличьими сыворотками с высокими титрами антител против соответствующих сероваров. Вид Y. pseudotuberculosis включает шесть O-групп, но наиболее часто регистрируемыми являются I и затем III и IV O-серогруппы. В связи с этим используют в первую очередь сыворотку против серогруппы O-I. В случае отрицательного результата используют сыворотки против O-серогрупп III и IV и затем II, V и VI серогрупп этих микробов.

Серологическую идентификацию Y. enterocolitica так же, как и псевдотуберкулезного микроба, начинают с использования сыворотки против наиболее распространенных серогрупп 03 и 09, затем 05.27, 08, 06 и других, которые могут встретиться у человека (табл. 36).

Из табл. 36 видно, что по принадлежности к тому или иному биовару (см. последнюю графу табл. 36) возможно предположить принадлежность штамма к той или иной O-серогруппе. Все штаммы Y. enterocolitica серогруппы 03 относятся к 4 биовару, 08 и 06 — к 1-му и 09 — ко 2-му, штаммы серогруппы 05.27 относятся к 3 биовару.

4.2. Определение биоваров

Определение биоваров шигелл

Антигенная однородность S. sonnei и S. flexneri 6 исключает их серологическую дифференциацию, поэтому дальнейшее их разделение на биовары осуществляют при использовании жидких сред с углеводами.

Неодинаковая биохимическая активность по отношению к отдельным углеводам некоторых сероваров шигелл других видов также может быть использована для дифференциации их на биовары.

Определение биоваров S. sonnei

Дифференциация S. sonnei основана на их неодинаковой биохимической активности в отношении рамнозы, ксилозы и мальтозы, что позволяет подразделять их на 7 стабильных биоваров (табл. 37). <*>

<*> Определение биоваров проводят в соответствии с «Методическими материалами по биохимическому типированию шигелл Зонне» (МЗ СССР, 1971).

Обозначения: в скобках указаны сроки ферментации (сутки), «+» — ферментация, «-» — отсутствие ферментации.

Определение биоваров S. flexneri 6

Для определения биоваров у S. flexneri 6 (S. newcastle) используют неодинаковую ферментацию ими глюкозы, маннита и дульцита, что позволяет выявить среди них 3 различных биовара (табл. 38).

Обозначения (здесь и в последующих таблицах):

«+» — ферментация с образованием кислоты;

«++» — ферментация с образованием кислоты и газа;

«-» — отсутствие ферментации;

«(+)» — замедленная ферментация.

Определение биоваров S. flexneri 1 — 5, X- и Y-variant

В зависимости от биохимической активности по отношению к мальтозе, арабинозе, сорбиту и рамнозе S. flexneri 1 — 5, X- и Y-var. можно подразделить на 15 биоваров, характеристика которых представлена в таб. 39.

Определение биоваров S. boydii

Установление биоваров S. boydii, так же как и других шигелл, основано на неодинаковой активности их в отношении отдельных углеводов (сорбит, глицерин, ксилоза, дульцит), что позволяет дифференцировать их на 8 биоваров (табл. 40).

Определение биоваров сальмонелл

В пределах некоторых сероваров сальмонелл наблюдается различная ферментативная активность в отношении отдельных углеводов. Для S. typhimurium, наиболее широко распространенного серовара, установлены четкие биовары (табл. 41).

В среды с мукатом и тартратами посев проводят петлей, используя 18 — 20-часовую бульонную или агаровую культуру. В тесте с мукатом результаты учитывают через 2 — 4 суток по изменению цвета среды. Положительный результат — изменение первоначального цвета среды (синий с зеленоватым оттенком) на зеленовато-желтый.

В тесте с тартратами результат учитывают через 2 — 4 суток по величине выпавшего осадка через 30 минут после добавления 0,5 мл насыщенного водного раствора уксусно-кислого свинца (объем среды в пробирке должен быть 3 — 4 мл). Величина осадка при положительном результате незначительная и не превышает 1/4 объема среды. При отрицательном результате осадок обычно занимает 1/2 или более объема среды. Для обеспечения возможности учета результатов реакции в разные сроки (через 48, 72 и 96 часов) культуру засевают в несколько пробирок.

Посев в остальные среды и учет результатов проводят по обычной методике.

Принимая во внимание, что многие другие серовары сальмонелл характеризуются вариабельностью биохимической активности по отношению к отдельным углеводам (арабиноза, дульцит, инозит, рамноза, ксилоза), при необходимости они также могут быть подразделены на ряд биоваров.

Определение биоваров у некоторых сероваров E. coli

Биохимические реакции E. coli в отношении отдельных субстратов вариабельны и могут быть использованы для определения биоваров у ряда сероваров (табл. 42, 43, 44).

Примечание. Цифры указывают сутки появления положительной реакции.

Определение биоваров клебсиелл

Различия в биохимической активности Klebsiella pneumoniae по отношению к дульциту, сорбиту и D-тартрату могут быть использованы для подразделения их на биовары, перечень и характеристика которых приведены в таблице 45.

Определение биоваров Y. enterocolitica

В основе определения биоваров у Y. enterocolitica лежит неодинаковая биохимическая активность этих бактерий по отношению к трегалозе, D-ксилозе, салицину (или эскулину) и способность образовывать индол, что позволяет подразделить их на 5 различных биоваров, характеристика которых представлена в таблице 46.

4.3. Фаготипирование

Определение фаговаров у микроорганизмов вообще, в т.ч. и у некоторых энтеробактерий, основано на избирательной чувствительности отдельных штаммов одного и того же серовара к набору стандартных типовых бактериофагов, при этом фаговар устанавливают в соответствии с чувствительностью штамма к одному или нескольким определенным типовым бактериофагам, входящим в набор <*>.

<*> Фаготипирование трех сероваров сальмонелл: S. typhi, S. paratyphi A, S. paratyphi B (S. schottmuelleri) проводится с использованием соответствующих наборов типовых бактериофагов, выпускаемых Тбилисским НИИ вакцин и сывороток МЗ СССР.

Определение фаговаров S. typhi

Для определения фаговаров S. typhi используют стандартную схему с применением 45 препаратов, адаптированных Vi II-бактериофагов и неадаптированного Vi I-бактериофага, предназначенного для выявления в культуре Vi-антигена. Бактериофаги и соответствующие им фаговары штаммов обозначают заглавными буквами латинского алфавита (от A до T включительно) и частично арабскими цифрами (от 27 до 46). Условием для определения фаговара культуры является наличие в ней Vi-антигена, с которым связана чувствительность ее к Vi-бактериофагам.

Если штамм дает слабую реакцию Vi-агглютинации, а результаты определения фаговара нечеткие, штамм рассевают и под контролем Vi-сыворотки отбирают колонии, наиболее богатые Vi-антигеном, которые вновь подвергают исследованию на определение фаговара. Для отбора колоний 3 — 4-часовую бульонную культуру высевают на чашку со СПА. Вторым обязательным условием для определения фаговара является использование типовых Vi II-бактериофагов в рабочих тест-разведениях, которые указывают либо в приложении к набору, либо на этикетках ампул с фагом.

Фаговар культуры определяют в соответствии с приведенной схемой (табл. 47), включающей 45 бактериофагов, позволяющих выявить такое же число фаговаров.

Обозначения: CL — сливной лизис; SCL — полусливной лизис; «+++» — отдельные негативные колонии (более 20); «++» — отдельные негативные колонии (до 20); «+/-» — единичные колонии; «-» — отсутствие лизиса.

Штаммы фаговара A лизируются всеми Vi II-фагами. Подразделение фаговара на подфаговары в группах B, C, D, E и т.д. построено таким образом, что штаммы подфаговара с порядковым номером 1 (B1, C1, D1, E1 и т.д.) лизируются не только гомологичным фагом, но и всеми другими фагами данной группы.

Для штаммов некоторых фаговаров (B1, B2, B3, C) характерна чувствительность к ряду фагов, в т.ч. и неродственных групп.

Для проведения этого исследования суточную агаровую культуру изучаемого штамма (после проверки на содержание в ней Vi-антигена с помощью Vi-сыворотки) пересевают в пробирку с 2 — 3 мл мартеновского или хоттингеровского бульона (pH 7,0 — 7,2) и инкубируют в термостате при 37 °C 3 — 4 час. Молодую бульонную культуру вносят в чашку Петри с 25 — 30 мл 1,5 — 1,7-процентного СПА, хорошо подсушенного. Чашки с агаром готовят накануне, оставляя их в термостате с закрытыми крышками, а на следующий день подсушивают с открытыми крышками в течение 20 — 30 мин. Культуру наносят на агар в чашке петлей (диаметром 5 мм) или тонко оттянутой пастеровской пипеткой в виде отдельных капель. Число капель культуры должно быть на 3 единицы больше числа используемых бактериофагов: одну из них испытывают с Vi I-фагом, вторую с O-поливалентным сальмонеллезным фагом и третья капля служит контролем культуры (вместо фага на нее наносят каплю бульона). Культуру можно засеять на чашку в виде сплошного газона, на который после подсыхания наносят петлей или тонко оттянутой пастеровской пипеткой Vi II-бактериофаги в тест-разведениях, а также Vi I- и O-фаги. После подсыхания капель фага чашки оставляют в термостате при 37° C и учитывают результаты дважды (через 5 — 6 час. и 18 — 20 час.). Учет проводят невооруженным глазом или с помощью 5-кратной лупы через дно чашки в проходящем свете. Фаговар культуры определяют в соответствии с указанной схемой. При определении фаговаров возможны результаты, отклоняющиеся от указанных в схеме: а) культура лизируется Vi-фагом, но нечувствительна ни к одному из Vi II-бактериофагов. Причина этого: выделение штамма, к которому Vi II-фаги еще не открыты или отсутствуют в используемом наборе; изучаемый штамм относится к тем культурам, к которым Vi II-бактериофаги не могут быть адаптированы (Vi I-штаммы); б) культура содержит Vi-антиген, лизируется несколькими Vi II-фагами, но спектр лизиса не соответствует ни одному из представленных в схеме (полилизабельные, деградированные штаммы), для их успешного исследования рекомендуется изучить несколько колоний (2 — 4), т.к. некоторые из них могут сохранять признаки определенного фаговара. Нередко полилизабельные культуры проявляют выраженную однотипность в спектре чувствительности к Vi II-бактериофагам, что может быть использовано как эпидемиологическая метка при выделении таких штаммов от разных лиц или других источников; в) культуры, не обладающие Vi-антигеном, хорошо лизирующиеся O-фагом и не чувствительные ни к одному из Vi-фагов, обозначают как W-форму.

Определение фаговаров S. paratyphi B

Для определения фаговаров S. paratyphi B используют международную стандартную схему Феликса и Келлоу (10 фагов), дополненную 5 фагами <*>. С помощью этой схемы удается установить 10 основных фаговаров S. paratyphi B и 19 их постоянных подфаговаров. Определение фаговаров S. paratyphi B основано на определении спектра лизиса несколькими фагами. Методика определения фаговаров та же, что для S. typhi, однако для S. paratyphi B делают две дополнительные капли культуры (одна для испытания с O-фагом, другая для контроля культуры).

<*> Выпускаются Тбилисским научно-исследовательским институтом вакцин и сывороток.