Санитарно-микробиологические исследования объектов окружающей среды в связи с производством и применением бактериальных инсектицидов на основе Bacillus thuringiensis. Методические рекомендации
(утв. Минздравом СССР 17.07.1979 № 2037-79)
17 июля 1979 г. № 2037-79
САНИТАРНО-МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ В СВЯЗИ С ПРОИЗВОДСТВОМ И ПРИМЕНЕНИЕМ БАКТЕРИАЛЬНЫХ ИНСЕКТИЦИДОВ НА ОСНОВЕ BACILLUS THURINGIENSIS
Разработаны 2-м Московским ордена Ленина Государственным медицинским институтом им Н.И. Пирогова (д.м.н., профессором Ю.П. Пивоваровым, К.Н. Дабуровым, В.В. Короликом, к.м.н., доцентом А.Д. Дериглазовым).
Рекомендованы к утверждению лабораторным советом Главного санитарно-эпидемиологического управления Министерства здравоохранения СССР.
Методические рекомендации предназначены для использования бактериологическими лабораториями санитарно-эпидемиологических станций в целях осуществления контроля за производством и применением бактериальных инсектицидов на основе Bac. thuringiensis, сотрудниками научно-исследовательских учреждений, изучающих влияние биологических средств защиты растений на состояние окружающей среды, а также производственными лабораториями пищевых предприятий для оценки качества растительного сырья, выращенного с применением бактериальных инсектицидов.
В связи с отрицательным экологическим воздействием ядохимикатов в последние годы в нашей стране и за рубежом широкое развитие получило производство бактериальных инсектицидов на основе Bac. thuringiensis для биологической борьбы с насекомыми — вредителями сельскохозяйственных огородных и садовых культур, парковых и лесных насаждений.
Бактериальные инсектициды и входящие в их состав микроорганизмы могут оказывать неблагоприятные воздействия на организм человека, вызывая пищевые токсикоинфекции при приеме массивно обсемененных продуктов питания, аллергические заболевания и воспалительные процессы в органах дыхания, поражение печени и изменение иммунобиологической реактивности организма при производстве и использовании данных препаратов.
Учитывая перспективы применения бактериальных инсектицидов на основе Bac. thuringiensis в сельском и лесном хозяйстве, с целью проведения контроля за производством и их применением возникает необходимость разработки единых методов выделения и идентификации данных микроорганизмов из объектов внешней среды. К таким объектам в основном относятся растительные продукты, выращенные с применением бактериальных препаратов; воздух производственных помещений; воздушные выбросы и сточные воды предприятий, производящих эти препараты; атмосферный воздух вблизи этих предприятий и над полями, подвергшимися обработке бактериальными препаратами; почва вблизи этих предприятий и обработанных полей, а также водоемы, расположенные вблизи этих полей и предприятий микробиологического синтеза.
I. Биологическая характеристика Bac. thuringiensis
Положение Bac. thuringiensis как вида не установлено. По морфологическим и физиологическим свойствам он очень близок к Bac. cereus. Единственным отличием Bac. thuringiensis от Bac. cereus является их способность образовывать кристаллические включения, оказывающие энтомоцидное действие. Название Bac. thuringiensis впервые было предложено как видовое на международном симпозиуме в Лондоне в 1964 г. Bac. thuringiensis по современной классификации отнесен к роду Bacillus, к группе апатогенных аэробных спорообразователей. Среди микроорганизмов вида Bac. thuringiensis имеются значительное количество разновидностей и вариантов, получивших различные наименования. В настоящее время принята схема идентификации Bac. thuringiensis, предложенная французскими учеными De Barjac и Bonnefoi. В ее основе лежит соответствие антигенного строения вегетативных форм микроорганизмов определенным биохимическим свойствам (схема 1). Согласно этой схеме различают 12 серотипов, в которые входят 17 разновидностей Bac. thuringiensis. Bac. thuringiensis представляют собой грамположительные спорообразующие микроорганизмы, факультативные аэробы. Вегетативные клетки Bac. thuringiensis имеют форму палочек с обрубленными или слегка закругленными концами, размером 2 — 7 x 0,8 — 2,0 мк. Перитрихи — имеются как подвижные, так и слабоподвижные виды. Клетки могут располагаться одиночно, чаще в виде цепочки по 4 — 10 или в виде штакетообразных скоплений. Споры Bac. thuringiensis овальной, эллипсовидной или сферической формы, расположены в клетке центрально или субтерминально. Спорангий не выпячивается. Размеры спор 0,7 — 0,9 x 1,5 — 1,9 мк. Кристаллические включения могут быть разнообразными по формам и размерам. Размеры их обычно составляют 0,4 — 0,8 x 1,0 — 1,4 мк. Чаще всего кристаллы представляют собой восьмигранники с ромбовидной поверхностью.
(De Barjac H., Bonnefoi A., 1968)
┌───────────┬───────┬─────────────┐
│Эстеразный │Серотип│Систематичес-│
│ тип │ │кое название │
├───────────┼───────┼─────────────┤
<pre class="legal-pre"> ┌ ┐ │ │ │ │
│Манноза > + │berliner │1 │thuringiensis│
│Крахмал│ + │ │ │ │
┌ │ ┘ │ │ │ │
┌ │Эскулин +++ < ┐ │ │ │ │
│Сахароза + │ │Манноза > - │finitimus │2 │finitimus │
│Пленка - < │Крахмал│ - │ │ │ │
│Уреаза - │ └ ┘ │ │ │ │
│ │ ┌ ┐ │ │ │ │
┌ ┌ │ │Эскулин + < Манноза > - │tolworthi │9 │tolworthi │
│Салицин + < Протеолиз + < └ │Крахмал│ + │ │ │ │
│ │Пигмент - │ └ ┘ │ │ │ │
│ └ │ ┌ ┌ ┐ │ │ │ │
│ │ │Эскулин + < Манноза > - │galleriae │7 │alzawae │
│ │Сахароза - │ │Крахмал│ + │ │ │ │
│ │Пленка - < └ ┘ │ │ │ │
│ │Уреаза ++ │ ┌ ┐ │ │ │ │
│ └ │Эскулин +- < Манноза > - │kenyae │4a, 4c │kenyae │
│ └ │Крахмал│ +- │ │ │ │
┌ │ └ ┘ │ │ │ │
│Леци- │ ┌ ┐ │ │ │ │
│тиназа + < │Саха- │ │ │ │ │
│ │ │роза │ + │ │ │ │
│ │ │Манноза > - │sotto │4a, 4 │sotto │
│ │ │Крахмал│ + │ │ │ │
│ │ │Целло- │ │ │ │ │
│ │ ┌ ┌ ┌ │биоза │ - │ │ │ │
│ │ │Протеолиз +++ < Пленка - < Эскулин + < ┘ │ │ │ │
│ │ │Пигмент - │Уреаза - │ │ ┐ │ │ │ │
│ │ │ └ └ │Саха- │ │ │ │ │
│ │ │ │роза │ - │ │ │ │
│ │ │ │Манноза > - │dendrolimus│4a, 4 │dendrolimus │
Ацетил- < │ │ │Крахмал│ + │ │ │ │
метил- │ │Салицин - < │Целло- │ │ │ │ │
карби- │ └ │ │биоза │ + │ │ │ │
нол │ │ └ ┘ │ │ │ │
│ │ ┌ ┐ │ │ │ │
│ │ ┌ ┌ │Саха- │ │ │ │ │
│ │Протеолиз +++ < Пленка - < Эскулин + < роза > - │alesti │3 │alesti │
│ │Пигмент - │Уреаза - │ │Манноза│ - │ │ │ │
│ └ └ └ │Крахмал│ ++ │ │ │ │
│ └ ┘ │ │ │ │
│ ┌ ┌ ┌ │ │ │ │
│ │Салицин + │Протеолиз + │Сахароза - ┌ ┌ ┐ │ │ │ │
│Леци- │ < Пигмент - < Пленка - < Эскулин +++ < Манноза > - │galleriae │5 │galleriae │
│тиназа - < └ │Уреаза + │ │Крахмал│ ++ │ │ │ │
└ │ └ └ └ ┘ │ │ │ │
│ ┌ ┌ │ │ │ │
│Салицин - │Протеолиз + │Сахароза + ┌ ┌ ┐ │ │ │ │
└ < Пигмент - < Пленка + < Эскулин + < Манноза > - │morrisoni │8 │morrisoni │
└ │Уреаза + │ │Крахмал│ +- │ │ │ │
└ └ └ ┘ │ │ │ │
┌ ┌ │ │ │ │
│Протеолиз + │Сахароза + ┌ ┌ ┐ │ │ │ │
│Пигмент - < Пленка + < Эскулин ++ < Манноза > + │entomocidus│6 │subtoxicus │
Ацетил- ┌ ┌ │ │Уреаза - │ │Крахмал│ + │ │ │ │
метил- < Леци- < Салицин - < └ └ └ ┘ │ │ │ │
карби- │тиназа - │ │ ┌ │ │ │ │
нол └ └ │Протеолиз + │Сахароза + ┌ ┌ ┐ │ │ │ │
│Пигмент - < Пленка - < Эскулин + < Манноза > + │entomocidus│6 │entomocidus │
└ │Уреаза - │ │Крахмал│ + │ │ │ │
└ └ └ ┘ └───────────┴───────┴─────────────┘</pre>
Размножаются Bac. thuringiensis путем деления. Споры и кристаллы освобождаются из лизирующей клетки через 24 — 36 часов после начала роста на плотных питательных средах и представляют собой обычно отдельные друг от друга образования.
Споры Bac. thuringiensis обладают достаточно высокой температурной устойчивостью и могут выживать не только при обычных методах технологической обработки пищи (варка, обжаривание, кипячение), но и при стерилизации.
Bac. thuringiensis непритязателен к условиям развития. Оптимум роста для данных микроорганизмов при температуре 28 — 30 °C, однако споры могут прорастать при широком интервале температур от 10 — 12 °C до 40 — 45 °C. Bac. thuringiensis способен давать рост в широком интервале pH от 6,0 до 9,5. Достаточно устойчив Bac. thuringiensis и к действию поваренной соли и сахара. Поваренная соль задерживает размножение этого микроорганизма лишь при 8- и выше процентном его содержании; сахар — свыше 40-процентном содержании.
Bac. thuringiensis хорошо растут на обычных питательных средах. На питательном агаре образуют крупные распластанные колонии бело-серого цвета или кремового цвета без врастания в среду. Морфология колоний на желточном агаре такая же, однако они окружены зоной белого коагулята, обусловленного лецитиназной активностью микроорганизмов. На кровяном агаре колонии Bac. thuringiensis зеленовато-серого цвета и окружены зоной гемолиза разной интенсивности.
На модифицированной нами среде Мосселя колонии Bac. thuringiensis бело-розового цвета, зона коагулята и сама среда розового цвета. На модифицированной нами среде Пивоварова колонии Bac. thuringiensis мелкие, матовые, ярко-рубинового цвета на фоне зоны белого коагулята. На разработанных нами средах: а) на казеин-полимиксиновом агаре Bac. thuringiensis образует крупные распластанные колонии бело-серого цвета на фоне зоны просветления; б) на казеин-полимиксиновом агаре с феноловым красным морфология колоний Bac. thuringiensis такая же, окружены зоной просветления, подлежащая среда приобретает розовый цвет; в) на казеин-полимиксиновом агаре с ТТХ Bac. thuringiensis образует мелкие колонии ярко-розового цвета на фоне зоны просветления. Зоны просветления на указанных средах обусловлены протеолитической активностью микроорганизмов Bac. thuringiensis.
Края колоний Bac. thuringiensis, растущих на агаризованных средах, могут быть ровными, волнистыми или слаборизоидными. Формы колоний бывают различными, от круглой до неправильной конфигурации. Отмечена диссоциация колоний Bac. thuringiensis, растущих на твердых питательных средах, на шероховатую (R), гладкие (S), смешанные (O) варианты.
Поверхность колоний молодых культур блестящая, по мере старения становится матовой. Сроки роста культур Bac. thuringiensis на агаризованных средах составляют 18 — 24 часа. При росте Bac. thuringiensis на модифицированной нами среде Пивоварова и разработанном казеин-полимиксиновом агаре с ТТХ отмечается некоторая задержка до 24 — 36 часов. В жидких питательных средах Bac. thuringiensis обычно образуют равномерную муть, хлопьевидный осадок белого цвета и пленку белого цвета на поверхности.
Микроорганизмы Bac. thuringiensis разжижают желатин, гидролизуют крахмал и казеин, обладают лецитиназной и гемолитической активностью, дают положительную реакцию с метилротом и реакцию на ацетоин (реакция Фогес — Проскауэра), редуцируют нитраты, не образуют индола и сероводорода. Данные микроорганизмы ферментируют до кислоты глюкозу, фруктозу, рибозу, мальтозу, глицерин, трегалозу, растворимый крахмал; не образуют кислоты из арабинозы, ксилозы, галактозы, сорбозы, рамнозы, эритрита, сорбита, маннита, дульцита, рафинозы, лактозы и инулина.
II. Санитарно-микробиологическое исследование объектов окружающей среды
Микроорганизмы Bac. thuringiensis хорошо растут на обычных питательных средах. Однако проведение широких исследований по санитарно-микробиологическому контролю за производством и применением бактериальных инсектицидов на их основе потребовало разработки новых питательных сред, позволяющих выделить данные микроорганизмы из сильно загрязненных микрофлорой объектов, например из почвы и продуктов питания. Предложен ряд питательных сред, характеристика которых по основным показателям представлена в таблице 1.
ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ BAC. THURINGIENSIS
| Наименование среды | Для каких исследований предназначены | Морфология колоний | Время роста в часах при t 30 °C |
|---|---|---|---|
| Питательный агар | вода, воздух, продукты питания | Крупные серые распластанные колонии с изрезанными краями, расположенные на поверхности среды без врастания в нее | 18 — 24 |
| Желточный агар | почва, воздух | Крупные серо-белые распластанные колонии со слегка изрезанными краями, окруженные зоной белого коагулята | 18 — 24 |
| Среда | продукты | Крупные колонии розово-белого цвета, | 18 — 24 |
| Мосселя | питания, вода | окруженные зоной коагулята, среда | |
| (модификация) | бесцветная или слабо-розовой окраски | ||
| Среда | продукты | Крупные серо-белые распластанные | 18 - 24 |
| Донован | питания | колонии со слегка изрезанными краями, окруженные зоной белого коагулята | |
| Среда Ю.П. | продукты | Мелкие красно-рубиновые колонии на | 24 - 48 |
| Пивоварова с | питания, | фоне зоны белого коагулята, в первые | |
| ТТХ | почва, вода, | сутки роста округлые, затем | |
| (модификация) | воздух | распластанные | |
| Казеинполимиксиновый агар | продукты питания, почва, вода, воздух | Крупные серо-белые распластанные колонии на фоне зоны просветления | 18 - 24 |
| Казеинполимиксиновый | продукты питания, | Мелкие красно-рубиновые колонии на фоне зоны просветления, крупные - на | 24 - 48 |
| агар с ТТХ | почва, вода, воздух | 2-е сутки | |
| Казеинполимиксиновый агар с феноловым красным | продукты питания, вода | Крупные розово-белые колонии, окруженные зоной просветления, подлежащая среда розового цвета | 18 - 24 |
Из представленных сред лишь модифицированная среда Пивоварова и разработанные нами казеин-полимиксиновый агар и казеин-полимиксиновый агар с ТТХ могут быть использованы для исследования исключительно всех объектов. Для исследования продуктов питания рекомендуются модифицированная среда Мосселя, среда Донован и разработанный нами казеин-полимиксиновый агар с феноловым красным. Что же касается других сред, представленных в таблице, то использовать их можно лишь при отсутствии компонентов, необходимых для приготовления предлагаемых сред, но в этом случае необходимо предварительно перед посевом прогреть исследуемый материал.
Отбор проб объектов внешней среды производится в зависимости от целей исследования в различные сроки. Подготовка проб для бактериологического анализа осуществляется по общепринятым методикам (отбор растительных продуктов производить согласно инструкциям, изложенным в Методических указаниях N 286-69, утвержденных МЗ СССР 5 мая 1969 г., ГОСТам 1724-67, 1725-68 и т.д.; отбор готовых продуктов производить согласно ГОСТам 8756.0-70, 12001-66, 12231-66 и т.д.; отбор проб воды производить согласно ГОСТам 18963-73 и 2874-73; отбор проб почвы производить в соответствии с Методическими указаниями N 1446-76, утвержденными МЗ СССР 4 августа 1976 г., отбор проб воздуха производить серийным прибором ПОВ-1 (прибор для отбора проб воздуха) в стерильный 0,85-процентный раствор хлористого натрия.
В зависимости от предполагаемого загрязнения делают стерильно в 0,85% растворе хлористого натрия посевные разведения. Полученные разведения выдерживают при 80 - 85 °C в течение 15 - 20 минут для освобождения от посторонней микрофлоры. В случае исследования продуктов питания, подвергнувшихся кулинарной обработке, пастеризацию производить нельзя, т.к. Bac. thuringiensis находится в вегетативной форме вследствие его размножения.
Первый этап. Производится посев разведений исследуемого материала на агаризованные питательные среды согласно данным таблицы 2. Из каждого разведения делают 2 - 5 параллельных посевов. После равномерного распределения посевного материала посредством втирания стерильным шпателем чашки с посевом инкубируют при температуре 30 - 32 °C. Срок инкубации - в зависимости от используемой среды (табл. 1).
ПОСЕВ МАТЕРИАЛА ПРИ ИССЛЕДОВАНИИ НА BAC. THURINGIENSIS
| Объект исследования | Питательные среды | Разведения материала и посевная доза в мл | ||||||
| 1 10 | 2 10 | 3 10 | 4 10 | 5 10 | 6 10 | 7 10 | ||
| Продукты питания, вода | Среда Пивоварова с ТТХ (модификация), среда Мосселя (модификация), среда Донован, питательный агар, казеинполимиксиновый агар, казеинполимиксиновый агар с ТТХ, казеинполимиксиновый агар с феноловым красным | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
| Почва | Желточный агар, питательный агар, среда Пивоварова с ТТХ, казеин-полимиксиновый агар, казеин-полимиксиновый агар с ТТХ | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | - |
| Воздух | Желточный агар, питательный агар, среда Пивоварова с ТТХ, казеин-полимиксиновый агар, казеин-полимиксиновый агар с ТТХ | - | - | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 | 0,1 |
Второй этап. Просматривают выросшие колонии. Морфологические признаки колоний Bac. thuringiensis на различных агаризованных питательных средах приведены в таблице 1. На данном этапе можно дать предварительный количественный учет микроорганизмов Bac. thuringiensis по количеству выросших на чашках типичных колоний с пересчетом на засевавшиеся на данную чашку разведения исследовавшегося материала.
Третий этап. Определяют окончательную принадлежность выделенных микроорганизмов к группе Bac. thuringiensis. Подозрительные колонии (морфология колоний Bac. thuringiensis приведена в таблице 1) пересевают на косой столбик мясо-пептонного агара и инкубируют сутки при 30 °C. Идентификация Bac. thuringiensis производится на основании наличия подвижности (в висячей капле), наличия кристаллов и спор, положительной протеолитической активности (разжижение желатина и гидролиз казеина), положительной реакции на лецитиназу (по наличию зоны коагулята на средах с желтком) и положительной реакции на ацетоин (реакция Фогес - Проскауэра). В качестве дополнительных тестов изучаются уреазная активность, гидролиз крахмала, образование эскулитина и ферментация сахаров и спиртов на средах Гисса (сахароза, салицин, манноза, целлобиоза). Могут быть использованы также и серологические реакции, в частности реакции агглютинации по Н-антигену. Характеристику выделенных культур сопоставляют с признаками разновидностей Bac. thuringiensis, представленных в таблице 3. В случае необходимости дифференциации Bac. thuringiensis от других аэробных спорообразующих микроорганизмов используется разработанный нами код-определитель аэробных бацилл (схема 2 - не приводится), составленный в соответствии с определителем Берджи (1974). В данном коде использованы кардинальные признаки отдельных микроорганизмов этого рода.
(De Barjac H., Bonnefoi A., 1973)
| Разновидности Bac. thuringiensis, | Образование | Кислота из | Гидролиз | Протеолиз | Образование | Жгутиковый антиген | ||||||||
| var | ацетоина | лецитиназы | сахарозы | салицина | маннозы | целлобиозы | крахмала | уреазы | эскулитина | пигмента | пленки | экзотоксина | ||
| thuringiensis finitimus alesti kuretaki dendrolimus sotto kenyae galleriae entomocidus subtoxicus alzawae morrisoni tolworthi darmstadiensis caucasicus thompsoni toumanoffi | + + + + + + + + - - + + + + + + + | + + + + + + + - - - + - + - + + + | + + - - - + - - + + - + + - +- + - | + + - + - - + + - - + - + - - - - | + - - - - - - - + + - - - - - + + | + + + + + - + + + + + + + + + + 0 | ++ - ++ ++ + + +/- ++ + ++ +- +- + + + + + | + + +++ +++ +++ +++ + + +++ + + + + + + + + | - - - + - - ++ + - - ++ - - - - + + | +++ +++ + +++ + + +/- +++ + ++ + + + 0 0 +++ 0 | - - + - - - - - - - - - - - + - - | + + - - - - - + - + - + + - 0 - 0 | +/- - - - - - +/- - - - - + + + 0 - + | H 1 H 2 H 3a H 3a.3b H 4a.4b H 4a.b H 4a 4c H 5 H 6 H 6 H 7 H 8 H 9 H 10 H 10 H 11 H 12 |
Примечание: -, +-, +, ++, +++ - степени проявления свойства; +/- - культура проявляет или не проявляет данного свойства; 0 - исследователи этого свойства не упоминают.
III. Определение основных свойств Bac. thuringiensis
Тест подвижности. Каплю 18-часовой бульонной культуры микроскопируют в темном поле или фазовоконтрастным методом - отмечено быстрое перемещение бактерий Bac. thuringiensis в поле зрения.
Образование ацетоина (реакция Фогес - Проскауэра). Исследуемую культуру засевают на глюкозо-фосфатный бульон Кларка. Инкубируют 24 часа при температуре 30 - 32 °C. Затем к 1 мл культуры добавляют 0,6 мл альфа-нафтола (6% раствор в абсолютном спирте) и 0,2 мл 40% раствора едкого калия (KOH). Пробирки хорошо встряхивают и помещают на 1 час в термостат. При положительной реакции наступает розовое или рубиново-красное окрашивание среды вследствие образования ацетоина.
Продуцирование лецитиназы. Исследуемую культуру засевают на плотную питательную среду с яичным желтком. Инкубируют 18 - 24 часа при температуре 30 - 32 °C. Зона побеления вокруг колоний на плотной среде свидетельствует о положительной реакции.
Образование эскулитина. Исследуемую культуру засевают точечным посевом на эскулиновый агар. Инкубируют 18 - 24 часа при температуре 30 - 32 °C. В случае положительной реакции наблюдается зона почернения вокруг колоний.
Расщепление углеводов. Для изучения сахаролитической активности изучаемых культур засевают на среды Гисса (сахароза, салицин, целлобиоза, манноза). Инкубируют при температуре 30 - 32 °C 18 - 24 часа. При положительной реакции цвет среды изменяется.
Гидролиз крахмала. Исследуемую культуру засевают точечным посевом на агаризованную среду с крахмалом. Инкубируют при температуре 30 - 32 °C 18 - 24 часа. Зоны гидролиза проявляются при капании на сформировавшиеся колонии раствором Люголя.
Образование уреазы. Исследуемую культуру засевают на среду Христенсена. Посев делают в пробирки с косым столбиком штрихом. Инкубируют при температуре 30 - 32 °C в течение 18 - 24 часов. При положительной реакции происходит покраснение среды.
Тесты протеолитической активности: а) разжижение желатина - исследуют путем посева изучаемой культуры уколом в столбики желатина строго по оси пробирки. Инкубируют в течение 18 - 24 часов при 30 - 32 °C, затем пробирки помещают в холодильник на 20 минут одновременно с контрольной незасеянной пробиркой. При положительном результате в засеянной пробирке желатин становится жидким, а в контрольной загустевает; б) гидролиз казеина - изучают путем точечного посева исследуемой культуры на казеиновый агар. Инкубируют в течение 18 - 24 часов при температуре 30 - 32 °C. При положительной реакции вокруг выросших колоний образуется гидролиз казеина.
IV. Окраска кристаллов бактерий группы Bac. thuringiensis
Кроме перечисленных тестов для идентификации Bac. thuringiensis следует обязательно производить микроскопию мазков на наличие кристаллов и спор. Выявленные кристаллы будут единственным отличительным признаком от Bac. cereus. Для микроскопического исследования петлей снимают через 48 часов инкубации из типичных по морфологическим признакам колоний часть материала и помещают на предметное стекло в каплю 0,85% раствора хлористого натрия. Содержимое капли распределяют по стеклу на площади 1 кв. см, высушивают на воздухе и фиксируют над пламенем горелки. Полученный мазок окрашивают одним из перечисленных ниже способов:
а) метод Шеффера и Фултона. Фиксированный на пламени мазок окрашивают 5% водным малахитовым зеленым при подогреве до появления паров. Затем препарат промывают водой и докрашивают 30 сек. 0,5% карболовым эозином. Препарат рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой. При данном методе окраски споры получаются зеленого цвета, а кристаллы - красного цвета;
б) метод Пешкова (модификация Моторной). Фиксированный мазок покрывают метиленовой синью Леффлера и в течение 3 мин. держат над пламенем горелки до появления паров, затем смывают водопроводной водой и добавляют сафронин (пиронин) и держат в течение 1 мин. без огня, затем смывают водопроводной водой. Препарат рассматривают под микроскопом с иммерсионной системой. При данном методе окраски споры - голубые, а кристаллы - красного цвета;
в) метод люминесцентной микроскопии. Люминесцентная микроскопия благодаря высокой чувствительности значительно повышает эффективность диагностических исследований. Мазок культуры на предметном стекле после высушивания фиксируется 5 минут 5% карболовой кислотой. После промывания йодом препарат флуорохромируется акридиновым оранжевым в течение 5 минут. Раствор красителя готовится на фосфатном буфере с pH 5,29 в концентрации 1:50000. При просмотре препаратов в падающих сине-фиолетовых лучах люминесцентного микроскопа наблюдается ярко-красное свечение вегетативных бактериальных клеток, светло-желтое - кристаллов и зеленое - спор.
V. Серологическая диагностика бактерий группы Bac. thuringiensis
Для серологической диагностики бактерий группы Bac. thuringiensis следует приготовить антифлагелярные иммунные сыворотки. Кроликов инъецируют суспензией живых подвижных культур. В качестве продуцентов живых культур следует использовать те бактериальные препараты, которые применяются или будут применяться в сельском хозяйстве данной территории (республика, область и т.д.). Подвижность бактерий увеличивают серией пересевов на пептонной воде, а затем выращивают на полужидком 0,7% агаре (МПА) при 30 °C в течение 12 - 18 часов. Непосредственно перед каждой инъекцией производят смыв агаровой культуры стерильным 0,85% раствором хлористого натрия. Доводят концентрацию микробных клеток до оптического стандарта, соответствующего 2 млрд./мл. Антигены живых бактерий вводят в ушную вену кроликов через каждые три дня по схеме: первое введение - 0,5 мл; второе введение - 1 мл; третье - 1 мл; четвертое - 2 мл; пятое - 2 мл. Кроликов через неделю после последней инъекции обескровливают. Сыворотки консервируют 0,5% раствором фенола. Реакцию агглютинации проводят пробирочным способом. К 0,9 мл подвижной бульонной культуры, убитой формалином, прибавляют 0,1 мл сыворотки в разведениях 1:20; 1:40; 1:80; 1:160; 1:320; 1:640; 1:1280. После встряхивания пробирки выдерживают в термостате при 37 °C в течение двух часов, затем в холодильнике в течение одного часа. Реакции оценивают по 4-балльной системе - по степени просветления жидкости, образованию зонтика или пуговки на дне пробирки и по степени склеенности осадка. Положительной реакцией, обозначаемой ++++, считают полное просветление и образование осадка в виде зонтика, который при встряхивании образует склеенные комочки в прозрачной жидкости. Отрицательной реакцией (-) считают отсутствие просветления и осадок в виде пуговки.
VI. Оценка полученных результатов
Полученные результаты следует оценивать с утвержденными нормативами ПДК бактериальных инсектицидов в воздухе рабочей зоны и в воде поверхностных водоемов (список N 12 предельно допустимых концентраций вредных веществ в воздухе рабочей зоны, утвержденный МЗ СССР 22 декабря 1978 г. за N 1948; Правила охраны поверхностных вод от загрязнения сточными водами, утвержденные МЗ СССР 16 мая 1974 г. за N 1166). Нормативы остаточных количеств бактериальных инсектицидов в остальных объектах окружающей среды (растительные продукты, воздух населенных мест и т.д.) разрабатываются и в нормативных документах появятся позднее.
VII. Рецепты питательных сред
Основой для приготовления плотных питательных сред, предназначенных для выделения Bac. thuringiensis, может служить любой 2,5% питательный агар.
Мясо-пептонный агар. К 1 л мясо-пептонного бульона прибавляют 20 г агара, нагревают до полного растворения, устанавливают pH 7,2 - 7,4, осветляют, фильтруют в горячем виде и разливают во флаконы. Стерилизуют при 120° в течение 30 минут. При использовании питательного агара заводского изготовления его готовят по прописи с добавлением мясо-пептонного бульона 0,5 л на 1 л среды.
Желточный агар. К 500 мл стерильного питательного агара, расплавленного и охлажденного до 45°, прибавляют эмульсию 2-х яичных желтков (в 10 мл стерильного 0,85% раствора хлористого натрия). Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Среда Донован. К 500 мл питательного агара прибавляют 2,5 г трехзамещенного цитрата натрия и 2,5 г хлористого лития. Агар стерилизуют при 120° 20 минут. После охлаждения до 45° добавляют эмульсию яичного желтка в стерильном 0,85% растворе хлористого натрия и 50 ед./мл полимиксина. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Среда Мосселя (модификация авторов) <1>. К 500 мл питательного агара добавляют 5 г маннита, 12,5 мг фенолового красного. Стерилизуют в автоклаве при 110° 30 минут. После охлаждения до 45° добавляют эмульсию яичного желтка в 0,85% растворе хлористого натрия и 50 ед./мл полимиксина.
<1> Дабуров К.Н., Дериглазов А.Д., Королик В.В. "Среда для выделения Bac. thuringiensis из продуктов питания". Удостоверение рационализаторского предложения отраслевого значения N 0-824 от 26 мая 1978 г.
Смесь тщательно размешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Среда Пивоварова с ТТХ (модификация авторов) <1>. К 500 мл стерильного питательного агара с 0,5% содержанием поваренной соли, расплавленного и затем охлажденного до 45°, прибавляют эмульсию яичного желтка в 0,85% растворе хлористого натрия, 50 ед./мл полимиксина и 0,005% ТТХ (трифенилтетразолия хлористого). Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
<1> Королик В.В., Дабуров К.Н., Дериглазов А.Д. "Среда для выделения Bac. thuringiensis из объектов окружающей среды". Удостоверение рационализаторского предложения отраслевого значения N 0-825 от 26 мая 1978 г.
Казеин-полимиксиновый агар с феноловым красным (разработка авторов) <2>. К 500 мл голодного агара добавляют 5 г маннита, 12,5 мг фенолового красного. Стерилизуют при 110° в течение 30 минут. После охлаждения до 45° добавляют 150 мл стерильного обезжиренного молока и 50 ед./мл полимиксина. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
<2> Дабуров К.Н., Королик В.В. "Казеин-полимиксиновый агар с феноловым красным для выделения Bac. thuringiensis - продуцентов бактериальных инсектицидов из продуктов питания". Удостоверение рационализаторского предложения отраслевого значения N 0-1003 от 23 февраля 1979 г.
Казеин-полимиксиновый агар (разработка авторов) <3>. К 500 мл стерильного голодного агара, расплавленного и затем охлажденного до 45°, прибавляют 150 мл стерильного обезжиренного молока и 50 ед./мл полимиксина. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
<3> Дабуров К.Н., Королик В.В. "Казеин-полимиксиновый агар для выделения Bac. thuringiensis - продуцентов бактериальных инсектицидов из объектов окружающей среды". Удостоверение рационализаторского предложения отраслевого значения N 0-1025 от 23 февраля 1979 г.
Казеин-полимиксиновый агар с ТТХ (разработка авторов). К 500 мл стерильного голодного агара, расплавленного и охлажденного до 45°, прибавляют 150 мл стерильного обезжиренного молока, 0,005% ТТХ и 50 ед./мл полимиксина. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Эскулиновый агар (модификация авторов) <4>. К 500 мл питательного агара прибавляют 0,5 г эскулина и 0,5 лимоннокислого железа. Стерилизуют при 110° 30 минут. Среду разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
<4> Дабуров К.Н., Королик В.В. "Питательный агар с эскулином для идентификации Bac. thuringiensis". Удостоверение рационализаторского предложения отраслевого значения N 0-910 от 22 декабря 1978 г.
Казеиновый агар. К 500 мл стерильного голодного агара прибавляют 150 мл стерильного обезжиренного молока. Смесь тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение в холодильнике 7 - 10 дней.
Агар с крахмалом. К 500 мл стерильного питательного расплавленного агара прибавляют 150 мл 1% стерильного растворимого раствора крахмала. Смесь перемешивают и разливают в чашки Петри. Хранение 7 - 10 дней.
Среда Христенсена. На 100 мл воды прибавляют пептона - 0,1 г, хлористого натрия - 0,5 г, глюкозы - 0,1 г, однозамещенного фосфата калия - 0,2 г, 0,2% водного раствора фенолрота - 0,6 мл, агара - 2,0 г, мочевины - 2,0 г. Среда стерилизуется при 110° 30 минут. Среду скашивают в пробирках, хранение 7 - 10 дней.
Глюкозо-фосфатный бульон Кларка. К 100 мл дистиллированной воды добавляют пептона - 0,5 г, глюкозы - 0,5 г, K HPO - 0,5 г, 2 4
хлористого натрия — 0,5 г. Смесь стерилизуют при 110° в течение 30 минут. Разливают в стерильные пробирки.
Среда Гисса. К пептонной воде прибавляют 0,5 — 1,0% одного из углеводов, глюкозидов или многоатомных спиртов. Устанавливают pH 7,0 — 7,2 и добавляют индикатор Андреде. Затем разливают по стерильным пробиркам и стерилизуют при 110° в течение 30 минут.