Методические указания по количественному определению зеранола в образцах мяса, печени и мочи с помощью тест-системы Ридаскрин зеранол (ridascreEnR zeranol) (производство фирмы Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)
(утв. Минсельхозпродом России 10.02.2000 № 13-7-2/1875)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
Департамента ветеринарии
Минсельхозпрода России
В. В. Селиверстов
10 февраля 2000 г. № 13-7-2/1875
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ ЗЕРАНОЛА В ОБРАЗЦАХ МЯСА,
ПЕЧЕНИ И МОЧИ С ПОМОЩЬЮ ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ЗЕРАНОЛ
( ridascreEn® zeranol) (ПРОИЗВОДСТВО ФИРМЫ
АР-БИОФАРМ/R-BIOPHARM, ГЕРМАНИЯ)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения зеранола в мясе, печени и моче с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа ridascreEn® zeranol'
Предел обнаружения для образцов мяса и печени: 0.016 мкг/кг (16 ppt)
для образцов мочи: 0.22 мкг/кг (220 ppt)
Сходимость результата анализа: коэффициент вариации не хуже 10%
Извлекаемость (для образцов мочи): 67%
Перекрестная чувствительность:
| зеранол | 100.0% |
|---|---|
| зеараланон | 2.4% |
| Р-зеараланол | 4.0% |
| зеараленон | 0.3% |
| ос-зеараленол | 21.1% |
| Р-зеараленол | 2.5% |
| эстрадиол-17р | < 0.02% |
| тестостерон | < 0.02% |
| кленбутерол | < 0.02% |
Зеранол является высокоэффективным синтетическим анаболическим стероидом, обладающим также эстрогенной активностью.
Использование зеранола в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация продуктов животного происхождения, содержащих остаточные концентрации зеранола, запрещены в Российской Федерации и в странах Европейского союза (Указание Главного государственного ветеринарного инспектора от 4.10.99 № 12-7-1/900, Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, утвержденные приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза 89/662/EEC, 90/425/EEC, 96/22/EC, 96/23/EC и др).
Для определения зеранола используются инструментальные физико-химические методы анализа, такие как капиллярная газовая хроматография (ГХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают использование дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммуноферментный метод анализа (ИФА, elisa), являющийся официальным методом контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/EEC).
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность. Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn® zeranol, сенсибилизирован овечьими антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину igg, который, в свою очередь, получен путем иммунизации кроликов зеранолом. Анализ выполняется следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы, раствор, содержащий антитела к зеранолу (кроличий igg) и раствор, содержащий конъюгат зеранола с ферментом, дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени молекулы зеранола, содержащегося в пробе или в стандартном растворе и молекулы конъюгата зеранола с ферментом, конкурируя между собой, связываются антителами к зеранолу в объеме раствора. Одновременно происходит иммуносорбция антител к зеранолу овечьими антителами на поверхности планшета.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата зеранола с ферментом.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации зеранола в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1 Предел обнаружения зеранола составляет:
- 0.016 мкг/кг в мясе и печени при навеске образца 1 г
6.2 Диапазон определяемых концентрация зеранола составляет:
- 0.016 — 4.0 мкг/кг в мясе и печени при навеске образца 1 г
- 0.22 — 56.0 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1 Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Дозаторы на 8, 50, 100, 250 и 500 и 1000 мкл
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 100 мл исполнения 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью 1 мл по ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 1, 5 и 10 мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1 °C, пределы измерения 0 — 100 °C по ГОСТ 29224.
7.2 Вспомогательные устройства
Микроизмельчитель тканей (гомогенизатор) РТ-2 или «Ультратюракс» с частотой 8000 — 24000 об/мин
Термостат с устанавливаемой температурой 37 °C
Центрифуга с устанавливаемым ускорением 3000 g и охлаждением
Центрифужная пробирка емкостью 20 мл с завинчивающейся крышкой
Центрифужная пробирка на 10 — 15 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для испарения экстрактов, например испарители ротационные типа ИР-1М-2, В-580, системы tcs, «Эвапорэк» и др. или лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1)
Устройство для перемешивания типа «вортекс»
Устройство для встряхивания проб
Устройство для твердофазной экстракции, например типа «Доркус», «Вакэлют» и др. или разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пробирки П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
Мембранный насос (возможно использование обычного аквариумного насоса)
7.3 Реактивы и материалы
Тест-система для иммуноферментного анализа ridascreEn® zeranol в стандартной комплектации, включая:
Микротитровальный планшет на 96 лунок (12 стрипов по 8 лунок), сенсибилизированный антителами к кроличьему igg 1 шт
Комплект стандартных растворов зеранола в воде со следующими концентрациями (1 pp1 = 1 нг/кг): 0 ppt (нулевой стандарт), 31.25 ppt, 125 ppt, 500 ppt, 2000 ppt, 8000 ppt, по 1 мл, 6 x 1 шт
Конъюгат зеранола с пероксидазой, конц. (красная крышка) 1 шт
Антитела к зеранолу, конц. (черная крышка) 1 шт
Субстрат, содержит пероксид карбамида, 7 мл (зеленая крышка) 1 шт
Хромоген, содержит тетраметилбензидин, 7 мл (голубая крышка) 1 шт
Стоп-реагент, содержит 1 М раствор серной к-ты, 14 мл (желтая крышка) 1 шт
Буфер, для разбавления конц. растворов конъюгата и антител, 50 мл 1 шт
Колонки для твердофазной экстракции марки rida® C 18
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из helix promatia
Уксусная кислота ледяная, CH3COOH
Ацетат натрия, тригидрат, CH3COONa x 3H2O
Замечания по использованию и хранению тест-системы ridascreEn® zeranol
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии.
Храните набор при температуре 2 — 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет с осушителем (силикагелем) и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов.
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими растворителями необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой иммуноферментного анализа и освоившего метод в процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
Температура воздуха 20 + 5 °C;
Атмосферное давление 84.0 — 106.7 кПа (630 — 800 мм. рт. ст.);
Влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °C;
Напряжение в сети 220 +/- 10 В;
Частота переменного тока 50 +/- 1 Гц
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269 и ГОСТ 7702.0 и согласно действующей нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при температуре 2 — 8 °C, либо 5 — 6 месяцев при температуре -20 °C.
11.3 Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1 Приготовление 1М раствора гидрооксида натрия.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 4.0 г гидрооксида натрия. В стакан наливают 50 мл дистиллированной воды и перемешивают раствор до полного растворения щелочи. С помощью стеклянной воронки раствор переносят в мерную колбу на 100 мл. Стакан омывают двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят в мерную колбу с раствором и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.2 Приготовление 90% раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу на 100 мл помещают 90 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.3 Приготовление 20% раствора уксусной кислоты.
В мерную колбу на 100 мл помещают 20 мл ледяной уксусной кислоты и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.4 Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.05М, pH 4.8
Навеску 0.68 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения ацетата натрия и переливают в химический стакан на 250 мл.
С помощью pH-метра измеряют значение pH и при необходимости доводят pH до 4.8 +/- 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20% раствор уксусной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 — 8 °C — 4 дня.
11.3.5 Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.6 Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
12.1 Пробы мочи
12.1.1. Исследуемая проба мочи объемом 0.5 мл смешивается с 3 мл ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М (pH 4.8).
12.1.2. С помощью дозатора в смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в термостате при температуре 37 °C в течение 3-х часов.
12.1.3 Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
12.1.3.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку rida® c18 2 мл метанола со скоростью 1 капля в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.
12.1.3.2. Пропустите через колонку 2 мл ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М (pH 4.8) со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.3. Пропустите через колонку 0.5 мл подготовленного раствора исследуемой пробы со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.4. Промойте колонку 2 мл ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М (pH 4.8) со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.5. Промойте колонку 2 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду. Удалите из колонки остатки жидкости.
12.1.3.6. Адсорбированные на колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом 5 мл.
12.1.3.7. Пробирку с элюатом помещают в водяную баню, находящуюся при температуре 50 — 60 °C. Температуру бани контролируют с помощью термометра. Раствор испаряют досуха в слабом токе воздуха, подающегося в пробирку мембранным насосом через пипетку Пастера, при этом кончик пипетки Пастера должен находиться на расстоянии 2 — 3 см от поверхности метанольного раствора. Поток воздуха регулируют с помощью зажима Гофмана, стравливая избыточное давление через тройник в атмосферу.
12.1.3.8. Сухой остаток в пробирке растворяют в 0.5 мл буфера, входящего в комплект набора ridascreEn® zeranol. Для анализа используют 50 мкл раствора.
Растворы в герметично закрытых пробирках могут храниться до 3-х дней при температуре 2 — 8 °C.
12.2 Пробы мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной ткани.
12.2.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.2.3. Навеску 1 г фарша гомогенизируют с 2 мл дистиллированной воды в центрифужной пробирке на 20 мл в течение одной минуты (для этого удобно использовать гомогенизатор «Ультратюракс» с узким ножом)
12.2.4. При помощи пипетки в центрифужную пробирку с гомогенатом вносят 10 мл диэтилового эфира, закрывают пробирку герметичной крышкой и энергично встряхивают содержимое в течение 30 сек при помощи устройства типа «вортекс» либо вручную.
12.2.5. Пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 3000 д в течение 10 мин при температуре 15 °C.
12.2.6. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно эффективного разделения процедуру центрифугирования повторяют.
12.2.7. С помощью пипетки Пастера и груши перенесите эфирный слой в пробирку устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства, в грушевидную колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя в пипетку Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.
Примечание: для облегчения отделения эфирного слоя водную фазу после центрифугирования можно заморозить в криостате (60 минут при -25 °C или 30 минут при -60 °C) либо, при его отсутствии, в охлаждающей смеси сухой лед/ацетон.
12.2.8 Повторите процедуру экстракции с 5 мл диэтилового эфира согласно пп. 12.2.4. -
12.2.9. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в вытяжном шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1), либо водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 30 мл с завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам. При выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира — 55.5 °C, температура кипения диэтилового эфира — 34.5 °C).
Сухой остаток в герметично закрытой емкости при температуре -20 °C может храниться до одного месяца.
12.2.10. После испарения эфира сухой остаток растворите в 1 мл хлороформа, тщательно омывая стенки пробирки (флакона, колбы).
12.2.11. Смешайте хлороформный раствор с 3 мл 1 М раствора гидрооксида натрия, закройте пробирку (флакон, колбу) герметичной крышкой (притертой стеклянной пробкой) и энергично встряхивайте пробирку (флакон, колбу) в течение 30 секунд с помощью встряхивателя типа «вортекс» или вручную.
12.2.12. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 10 — 15 мл, центрифугируйте при 2000 д в течение 10 минут при температуре 15 °C (если испарение эфирного экстракта проводилось в стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется непосредственно в этом флаконе).
12.2.13. С помощью пипетки Пастера отберите верхний щелочной слой и перенесите его в другую центрифужную пробирку емкостью 10 — 15 мл (при использовании стеклянного флакона осторожно отберите нижний хлороформный слой и отбросьте его). Смешайте раствор с 250 мкл 90% уксусной кислоты.
12.2.14. В пробирку (флакон) с нейтрализованным водным раствором внесите с помощью пипетки 5 мл диэтилового эфира. В течение 30 секунд энергично встряхивайте пробирку (флакон) с помощью встряхивателя типа «вортекс» или вручную.
12.2.15. Поместите пробирку (флакон) в центрифугу и центрифугируйте при 2000 д в течение 10 минут при температуре 15 °C.
12.2.16. Отделите эфирный экстракт и испарите его досуха в вытяжном шкафу, руководствуясь п. 12.2.9 (при использовании стеклянного флакона испарение проводится непосредственно в этом же флаконе после отделения и отбрасывания нижнего водного слоя).
Сухой остаток в герметично закрытой емкости при температуре -20 °C может храниться до одного месяца.
12.2.17. Сухой остаток растворяют в 0.5 мл буфера, входящего в комплект набора ridascreEn® zeranol. Для анализа используют 50 мкл раствора. Герметично закрытые растворы могут храниться до 3-х дней при температуре 2 — 8 °C.
12.3 Пробы печени.
12.3.1. Пробу печени измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.3.2. Навеску 1 г измельченной печени гомогенизируют с 2 мл дистиллированной воды в центрифужной пробирке на 20 мл в течение одной минуты (для этого удобно использовать гомогенизатор «Ультратюракс» с узким ножом).
12.3.3. В пробирку с гомогенатом вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают в термостате 2 часа при температуре 37 °C.
12.3.4. Далее следуют процедуре пробоподготовки начиная с пункта 12.2.4.
Примечание; этот метод пробоподготовки можно также использовать при исследовании почек.
При необходимости измерения высоких концентраций зеранола в образцах печени, почек и мяса (не менее 0.16 мкг/кг), раствор по п. 12.2.17 разбавляют буфером в 10 раз, при этом фактор разбавления также увеличивают в 10 раз (см. раздел 14).
13. Порядок проведения измерений
13.1 Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы ridascreEn® zeranol
- Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до комнатной (30 — 40 минут до температуры 18 — 20 °C)
- Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °C
- В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета
- Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета
- На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.
13.2 Подготовка к измерениям
13.2.1 Приготовление препарата конъюгата
Конъюгат зеранола с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется в концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат конъюгата имеет ограниченную стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата. Перед разбавлением концентрированного препарата конъюгата осторожно встряхните содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата конъюгата разбавьте концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата конъюгата с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)
13.2.2 Приготовление препарата антител
Антитела к зеранолу (флакон с черной крышкой) поставляются в концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата. Перед разбавлением концентрированного препарата антител осторожно встряхните содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата антител разбавьте концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата антител с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)
13.2.3 Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.
13.2.4 Стандартные растворы
Стандартные растворы зеранола поставляются готовыми для использования в следующих концентрациях:
| Стандарт 1 | 0 ppt |
|---|---|
| Стандарт 2 | 31.25 ppt |
| Стандарт 3 | 125 ppt |
| Стандарт 4 | 500 ppt |
| Стандарт 5 | 2000 ppt |
| Стандарт 6 | 8000 ppt |
13.3 Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на Рис. 1.
Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа (С — стандарты, П — пробы).
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 50 мкл разбавленного препарата конъюгата в каждую лунку и по 50 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок. При дозировании раствора конъюгата и выполнении последующих операций предпочтительно использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки Петри).
13.3.3. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного препарата антител. Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на инкубацию в течение 2-х часов при комнатной температуре.
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. Наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок водой еще два раза.
13.3.5. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 30 минут в темноте.
13.3.6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.
14.1 Вычисление концентрации зеранола в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации зеранола в нг/кг (ppt) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 31 — 2000 нг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация зеранола в исследуемых растворах в нг/кг (ppt) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется специализированное программное обеспечение, например, rida®soft . При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.
Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию зеранола в исследуемой исходной пробе, величину концентрации зеранола, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения:
| Мясо и печень | 0.5 |
|---|---|
| Мясо и печень | 5 (при разбавлении раствора по п. 12.2.17) |
| Моча | 7 |
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы ridascreEn® zeranol
ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном результате определения исследование образцов, показавших положительный результат, повторяют. При повторном исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента извлечения с помощью внесения в образец добавки зеранола на стадии пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см. Приложение 2).
15. Интерпретация результатов исследований
Использование зеранола в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация продукции животного происхождения, содержащей остаточные количества зеранола, полностью запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской Федерации.
Чувствительность иммуноферментного метода анализа позволяет определять концентрации зеранола в мясе и печени на уровне 0.016 мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном результате определения проводят подтверждающий анализ независимым методом (используется, например, хроматомасс-спектрометрия, капиллярная газовая хроматография), обладающим худшей чувствительностью, результат определения интерпретируют как положительный если величина найденной концентрации больше предела обнаружения независимого метода анализа.
Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического метода определения зеранола составляет 2 мкг/кг.
Пробы с найденной концентрацией зеранола, не превышающей 2 мкг/кг, рассматривают как «подозрительные».
ТЕХНИКА ВЫПАРИВАНИЯ ЭКСТРАКТОВ С ПОМОЩЬЮ ЛАБОРАТОРНОГО МИКРОИСПАРИТЕЛЯ
П1.1. При отсутствии готового устройства для испарения экстрактов соберите лабораторный микроиспаритель согласно Рис. 3. Через предохранительную склянку (можно использовать коническую колбу на 500 мл) подключите водоструйный насос.
1 — колба грушевидная; 2 — водяная баня; 3 — термометр; 4 — переход; 5 — пипетка Пастера; 6 — корковая пробка; 7 — трубка соединительная (тройник); 8 — зажим Гофмана;
9 — вакуумный шланг; 10 — к предохранительной склянке
и водоструйному насосу.
Для сборки лабораторного микроиспарителя необходимо следующее оборудование:
Насос водоструйный по ГОСТ 25336
Колба грушевидная для упаривания вместимостью 25 мл типа ГР-25-14/23 по ТУ 92-891.029-91 с притертой стеклянной пробкой
Переход типа П10-14/23 (с одной горловиной и отводом) по ГОСТ 25336
Трубка соединительная (тройник) типа ТС-Т по ГОСТ 25336
Колба коническая с цилиндрической горловиной типа КН-3-500-34 по ТУ 92-891.029-91
Шланг вакуумный на отвод перехода типа П10-14/23
Зажим Гофмана на вакуумный шланг
Корковые пробки под колбу КН-3-500-34 и ГР-25-14/23
Набор ручных сверл для сверления пробок
Электроплитка с закрытой спиралью
П1.2. Выпарите эфирный экстракт досуха. При выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира — 55.5 °C, температура кипения диэтилового эфира — 34.5 °C). Отрегулируйте вакуум с помощью зажима Гофмана так, чтобы обеспечить слабую подачу воздуха в грушевидную колбу (на поверхности эфира должна быть заметна небольшая ямка, слишком сильный ток воздуха может привести к разбрызгиванию экстракта и потерям).
ВВОД ПОПРАВКИ НА КОЭФФИЦИЕНТ ИЗВЛЕЧЕНИЯ
Фактический коэффициент извлечения рассчитывается методом внесения добавки определяемого соединения.
П2.1. Масса вносимой добавки рассчитывается по следующей формуле:
где m — масса добавки зеранола19-нортестостерона, нг
Cб — найденная концентрация зеранола в образце, мкг/кг (мкг/л при исследовании мочи)
M — масса (объем) образца, г (мл при исследовании мочи)
П2.2. Вносимый объем стандартного раствора зеранола рассчитывается по формуле:
где v — объем стандартного раствора зеранола, мкл
m — масса добавки зеранола, нг
Cд — концентрация стандартного раствора зеранола, нг/мл
П2.3. С помощью микродозатора внесите вычисленное количество добавки в исследуемый образец перед пробоподготовкой.
П2.4. Выполните определение зеранола в образце, руководствуясь настоящей методикой.
П2.5. Поправка на коэффициент извлечения рассчитывается по следующей формуле:
k извл. = Cс x M/(Cб x M + m),
где k извл. — коэффициент извлечения
Cс — найденная концентрация зеранола в образце после внесения добавки, мкг/кг (мкг/л для мочи)
Cб — найденная концентрация зеранола в образце до внесения добавки, мкг/кг (мкг/л для мочи)
M — масса (объем) образца, г (мл при исследовании мочи)
m — масса добавки зеранола, нг
П2.6. Выполните перерасчет найденной концентрации зеранола в образце с учетом коэффициента извлечения по следующей формуле:
где Cб — найденная концентрация зеранола в образце до внесения добавки, мкг/кг (мкг/л для мочи)