Методические указания по количественному определению диэтилстильбестрола в образцах мяса, печени, мочи и фекалий с помощью тест-системы Ридаскрин дэс (ridascreEnR des) (производство фирмы Ар-Биофарм/r-biopharm, Германия)
(утв. Минсельхозпродом России 10.02.2000 № 13-7-2/1873)
Примечание
Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 № 02-03-48/563).
Утверждаю
Заместитель Руководителя
Департамента ветеринарии
В. В. Селиверстов
10 февраля 2000 г. № 13-7-2/1873
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ
ПО КОЛИЧЕСТВЕННОМУ ОПРЕДЕЛЕНИЮ ДИЭТИЛСТИЛЬБЕСТРОЛА
В ОБРАЗЦАХ МЯСА, ПЕЧЕНИ, МОЧИ И ФЕКАЛИЙ С ПОМОЩЬЮ
ТЕСТ-СИСТЕМЫ РИДАСКРИН ДЭС ( ridascreEn® des)
(ПРОИЗВОДСТВО ФИРМЫ АР-БИОФАРМ/R-BIOPHARM, ГЕРМАНИЯ)
1. Область применения методики
Методика предназначена для количественного определения диэтилстильбестрола в мясе, печени, моче и фекалиях с помощью тест-системы для иммуноферментного анализа ridascreEn® des <*>.
<*> ridascreEn® и rida® являются зарегистрированными товарными знаками фирмы r-biopharm, Германия
Стильбены, к группе которых относятся диэтилстильбестрол, диеноэстрол и гексоэстрол, являются высокоэффективными синтетическими анаболическими стероидами, обладающие также сильной эстрогенной активностью.
Было, однако, показано, что стильбены обладают выраженными канцерогенными свойствами.
Использование стильбенов в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация продуктов животного происхождения, содержащих остаточные концентрации диэтилстильбестрола и других стильбенов, запрещены в Российской Федерации и в странах Европейского союза (Указание Главного государственного ветеринарного инспектора от 4.10.99 № 12-7-1/900, Правила по организации государственного ветеринарного надзора за содержанием гормональных стимуляторов роста и тиреостатиков в продукции животного происхождения, утвержденные приказом МИНСЕЛЬХОЗПРОДА России от 18.08.99 № 604, Директивы Евросоюза 89/662/EEC, 90/425/EEC, 96/22/EC, 96/23/EC и др).
Для определения стильбенов используются инструментальные физико-химические методы анализа, такие как жидкостная хроматография высокого давления (ВЭЖХ) и хромато-масс-спектрометрия (ГХ-МС). Эти методы, однако, предусматривают использование дорогостоящего оборудования, нуждающегося в высококвалифицированном обслуживании.
В последнее время в рутинной лабораторной практике широко применяется более удобный иммуноферментный метод анализа (ИФА, elisa), являющийся официальным методом контроля продуктов животного происхождения, принятым в странах Евросоюза (Директива 93/257/EEC).
Использованы ссылки на следующие нормативные документы:
ГОСТ 12.1.007-76 ССБТ. Вредные вещества. Классификация и общие правила безопасности.
ГОСТ 12.1.018-86 ССБТ. Пожарная безопасность. Электростатическая искробезопасность. Общие требования.
ГОСТ 12.1.019-79 ССБТ. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура средств защиты.
ГОСТ 1770-74Е. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Технические условия.
ГОСТ 4025-83. Мясорубки бытовые. Технические условия.
ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия.
ГОСТ 7269-79. Мясо. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения свежести.
ГОСТ 7328-82Е. Меры массы общего назначения и образцовые. Технические условия.
ГОСТ 7702.0-74. Мясо птицы. Методы отбора образцов. Органолептические методы определения качества.
ГОСТ 24104-88Е. Весы лабораторные общего назначения и образцовые. Общие технические условия.
ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры.
ГОСТ 29169-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки с одной отметкой.
ГОСТ 29224-91. Термометры ртутные стеклянные лабораторные. Технические условия.
ГОСТ 29227-91. Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Общие требования.
В основе процедуры анализа лежит взаимодействие антигенов с антителами.
Планшет, входящий в состав набора ridascreEn® des, сенсибилизирован овечьими антителами, специфичными к кроличьему иммуноглобулину igg, который, в свою очередь, получен путем иммунизации кроликов диэтилстильбестролом. Анализ выполняется следующим образом.
Исследуемые (стандартные) образцы и раствор, содержащий антитела к диэтилстильбестролу (кроличий igg) дозируются в лунки планшета. При инкубации планшета в течение определенного времени диэтилстильбестрол, содержащийся в пробе или в стандартном растворе, связывается антителами к диэтилстильбестролу. Одновременно происходит взаимодействие овечьих антител на поверхности планшета с антителами к диэтилстильбестролу.
После промывки в лунки планшета добавляется раствор, содержащий конъюгат диэтилстильбестрола с ферментом, при этом молекулы конъюгата связываются антителами к диэтилстильбестролу, сорбированными на поверхности планшета на предыдущей стадии. Очевидно, что с молекулами конъюгата способны взаимодействовать только антитела, не дезактивированные ранее молекулами диэтилстильбестрола.
На последующей стадии промывки из лунок планшета удаляются свободные молекулы конъюгата.
После промывки планшета в его лунки дозируется раствор субстрата (пероксид карбамида) и раствор хромогена (тетраметилбензидин). В процессе инкубации, при химическом взаимодействии субстрата с хромогеном, в котором ферментный фрагмент молекулы конъюгата, связанной на поверхности лунки, выступает в качестве катализатора, образуются окрашенные продукты реакции. Через определенное время развития цветной реакции, в результате которой бесцветный хромоген окрашивается в голубой цвет, в лунки добавляется стоп-реагент, при этом голубой цвет раствора меняется на желтый.
Оптическая плотность в лунках, измеренная на спектрофотометре (ридере) при 450 нм, обратно пропорциональна концентрации диэтилстильбестрола в исследуемых образцах.
6. Предел обнаружения и диапазон определяемых концентраций
6.1 Предел обнаружения диэтилстильбестрола составляет:
- 0.2 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
- 0.1 мкг/кг в мясе и фекалиях при навеске образца 5 г
- 0.1 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г
6.2 Диапазон определяемых концентрация диэтилстильбестрола составляет:
- 0.2 — 3.2 мкг/л в моче при объеме образца 0.5 мл
- 0.1 — 1.6 мкг/кг в мясе и фекалиях при навеске образца 5 г
- 0.1 — 1.6 мкг/кг в печени при навеске образца 1 г
7. Средства измерения, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
7.1 Средства измерения
Весы лабораторные общего назначения 2-го класса точности с наибольшим пределом взвешивания 200 г по ГОСТ 24104
Спектрофотометр (ридер), снабженный фильтром на 450 нм
Колбы мерные 2-го класса точности вместимостью 50, 100 и 1000 мл исп. 2 по ГОСТ 1770
Цилиндры мерные 2-го класса точности вместимостью 50 и 100 мл по ГОСТ 1770
Пипетки с одной отметкой 2-го класса точности вместимостью 1 и 5 мл по ГОСТ 29169
Пипетки градуированные 2-го класса точности вместимостью 5 и 10 мл по ГОСТ 29227
Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; цена деления 1 °C, пределы измерения 0 — 100 °C по ГОСТ 29224.
7.2 Вспомогательные устройства
Термостат с устанавливаемой температурой 37 °C
Центрифужная пробирка емкостью 20 — 50 мл с завинчивающейся крышкой
Устройство для испарения экстрактов, например испарители ротационные типа ИР-1М-2, В-580, системы tcs, «Эвапорэк» и др. или лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1)
Устройство для встряхивания проб (шейкер)
Устройство для твердофазной экстракции, например типа «Доркус», «Вакэлют» и др. или разовый шприц пластиковый объемом 5 мл
Пробирки П-2-10-14/23, П-2-5-14/23 с притертыми стеклянными пробками
Стаканы химические вместимостью 50, 100, 250 и 1000 мл по ГОСТ 25336
Воронки лабораторные типа В-36 или В-75 по ГОСТ 25336
Стеклянный бюкс (стаканчик для взвешивания) по ГОСТ 25336
7.3 Реактивы и материалы
Тест-система для иммуноферментного анализа ridascreEn® des <*> в стандартной комплектации, включая:
<*> Поставляется ООО «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05
Колонки для твердофазной экстракции марки rida® c18 <>*
<> Поставляется ООО «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05*
Вода дистиллированная по ГОСТ 6709
Глюкоронидаза/арилсульфатаза из helix promatia
Метилтретбутиловый эфир, (CH3)3COCH3 (возможна замена метилтретбутилового эфира диэтиловым эфиром)
Петролейный эфир, температура кипения 40 — 70 °C
Ортофосфорная кислота, H3PO3, концентрированная
Соляная кислота, HCl, концентрации 1 М
Уксусная кислота, CH3COOH, концентрации 20% вес.
Ацетат натрия, тригидрат, CH3COONa x 3H2O
Трис-(гидроксиметил)-аминометан (трис), (CH2OH)3CNH2
Дигидрофосфат натрия, дигидрат, NaH2PO4 x 2H2O
Гидрофосфат натрия, безводный, Na2HPO4
Замечания по использованию и хранению тест-системы ridascreEn® des
Не используйте тест-систему с истекшим сроком годности.
Разбавление или замена реагентов может привести к потере чувствительности определения.
Не заменяйте реагенты в составе одного набора реагентами из другого набора с другим номером партии.
Храните набор при температуре 2 — 8 °C. НЕ ЗАМОРАЖИВАЙТЕ НАБОР.
Для хранения неиспользованных стрипов (лунок) упакуйте их в фольгированный пакет с силикагелем и плотно закройте пакет.
Поскольку стандартные растворы и раствор хромогена светочувствительны, избегайте попадания прямых солнечных лучей на флаконы с растворами.
Признаки порчи реагентов: В случае окрашивания раствора хромогена не рекомендуется использовать раствор, поскольку окрашивание раствора хромогена является признаком его порчи.
В случае, если величина оптической плотности, измеренной в лунке с нулевым стандартом, не превышает 0.6, это также может быть признаком порчи реагентов
8.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007, требования пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.018 и электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019, а также требования, указанные в технической документации на весы, спектрофотометр и вспомогательные устройства.
8.2. Помещение, в котором производится выполнение измерений, должно быть снабжено приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с органическими растворителями необходимо проводить в вытяжном шкафу с использованием резиновых перчаток.
9. Требования к квалификации персонала
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают специалиста, имеющего высшее или среднее специальное химическое образование или опыт работы в химической лаборатории, владеющего техникой иммуноферментного анализа и освоившего метод в процессе стажировки.
10. Условия выполнения исследований
При выполнении измерений в лаборатории должны быть соблюдены следующие условия:
11. Порядок отбора проб и подготовки к проведению исследований
11.1. Отбор проб осуществляют по ГОСТ 7269, ГОСТ 7702.0 и согласно действующей нормативной документации.
Пробы доставляют в лабораторию немедленно после их отбора.
11.2. Анализ необходимо начать в день доставки пробы в лабораторию. При отсутствии такой возможности допускается хранение образцов не более чем 2 суток с момента отбора при температуре 2 — 8 °C, либо 5 — 6 месяцев при температуре -20 °C.
11.3 Приготовление вспомогательных растворов.
11.3.1 Приготовление раствора фосфорной кислоты концентрации 6М.
В химическом стакане на 50 мл взвешивают 29.4 г концентрированной ортофосфорной кислоты. С помощью стеклянной воронки кислоту переносят в мерную колбу на 50 мл. Стакан омывают двумя порциями дистиллированной воды по 5 мл. Смывы последовательно переносят в мерную колбу с кислотой и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.2 Приготовление раствора гидрооксида натрия концентрации 1Н.
В химическом стакане на 100 мл взвешивают 4.0 г гидрооксида натрия. В стакан наливают 50 мл дистиллированной воды и перемешивают раствор до полного растворения щелочи. С помощью стеклянной воронки раствор переносят в мерную колбу на 100 мл. Стакан омывают двумя порциями дистиллированной воды по 10 мл. Смывы последовательно переносят в мерную колбу с раствором и разбавляют раствор дистиллированной водой до метки.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.3 Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.5 М, pH 4.8
Навеску 6.8 г тригидрата ацетата натрия переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения ацетата натрия и переливают в химический стакан на 250 мл.
С помощью pH-метра измеряют значение pH и при необходимости доводят pH до 4.8 +/- 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20% раствор уксусной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 — 8 °C — 4 недели.
11.3.4 Приготовление ацетатного буферного раствора концентрации 0.05 М, pH 4.8
В мерную колбу на 100 мл переносят 10 мл ацетатного буферного раствора концентрации 0.5М. Дистиллированной водой доводят объем раствора до метки. Раствор тщательно перемешивают и переливают в химический стакан на 250 мл.
С помощью pH-метра измеряют значение pH и при необходимости доводят pH до 4.8 +/- 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 20% раствор уксусной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 — 8 °C — 4 дня.
11.3.5 Приготовление фосфатного буферного раствора, pH 7.2
Взвешивают 7.67 г безводного гидрофосфата натрия и 2.02 г дигидрата д и гидрофосфата натрия. Навески переносят в мерную колбу на 1000 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения осадка и переливают в химический стакан на 1000 мл.
С помощью pH-метра измеряют значение pH и при необходимости доводят pH до 7.2 +/- 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 6М раствор ортофосфорной кислоты.
Срок хранения раствора при температуре 2 — 8 °C — 4 дня.
11.3.6 Приготовление буферного раствора трис/метанол (20%), pH 8.5
Навеску 0.242 г трис-(гидроксиметил)-аминометана переносят в мерную колбу на 100 мл и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают до растворения осадка и с помощью pH-метра измеряют значение pH. При необходимости доводят pH до 8.5 +/- 0.1 осторожно, по каплям и при постоянном перемешивании добавляя 1М раствор соляной кислоты. Раствор с установленным значением pH переносят в колбу на 250 мл и смешивают с 25 мл метанола.
Срок хранения раствора при температуре 2 — 8 °C — 4 дня.
11.3.7 Приготовление 40% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 40 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.8 Приготовление 70% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 70 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
11.3.9 Приготовление 80% раствора метанола
В мерную колбу на 100 мл помещают 80 мл метанола и доводят объем раствора до метки дистиллированной водой. Раствор тщательно перемешивают.
Срок хранения раствора при комнатной температуре — 4 недели.
12.1 Пробы мочи
12.1.1. Исследуемая проба мочи объемом 0.5 мл смешивается с 3 мл ацетатного буферного раствора концентрации 0.05М (pH 4.8).
12.1.2. В смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в термостате при температуре 37 °C в течение 3-х часов.
Гидролизат может хранится 2 — 3 дня при температуре 2 — 8 °C, либо 3 — 4 недели при температуре -20 °C.
12.1.3 Очистка пробы методом твердофазной экстракции.
12.1.3.1. С помощью устройства для твердофазной экстракции, руководствуясь инструкцией по его эксплуатации, промойте колонку rida® c18 3 мл метанола со скоростью 1 капля в секунду. При отсутствии устройства для твердофазной экстракции для создания давления воздуха на входе в колонку используйте разовый пластиковый шприц на 5 мл.
12.1.3.2. Пропустите через колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), pH 8.5 со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.3. Пропустите через колонку весь объем подготовленного раствора исследуемой пробы со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.4. Промойте колонку 2 мл буферного раствора трис/метанол (20%), pH 8.5 со скоростью 1 капля в секунду.
12.1.3.5. Промойте колонку 3 мл 40% раствора метанола со скоростью 1 капля в секунду.
После удаления из колонки остатков жидкости, колонка высушивается в токе воздуха или азота в течение 2-х минут.
12.1.3.6. Адсорбированные на сухой колонке вещества осторожно, со скоростью 15 капель в минуту, элюируют 1 мл 80% раствора метанола в чистую пробирку, объемом 10 мл.
Элюаты в герметично закрытых пробирках могут храниться в течение 3 — 4 месяцев при температуре -20 °C.
12.1.3.7. В пробирку с элюатом добавляют 3 мл 80% раствора метанола и 4 мл дистиллированной воды. Содержимое пробирки перемешивают.
12.1.3.8 Для анализа используют 20 мкл раствора.
12.2 Пробы мяса.
12.2.1. Исследуемые образцы мяса должны быть свободны от жира и соединительной ткани.
12.2.2. Пробу мяса измельчают с помощью мясорубки либо другим способом.
12.2.3. Навеску 5 г фарша переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и гомогенизируют в течение одной минуты с 10 мл раствора фосфатного буфера, pH 7.2.
12.2.4. Навеску 3 г гомогената переносят в центрифужную пробирку на 20 — 50 мл, снабженную завинчивающейся крышкой.
12.2.5. В центрифужную пробирку с гомогенатом добавляют 8 мл метилтретбутилового (диэтилового) эфира и энергично встряхивают содержимое в течение 20 мин. при помощи устройства для встряхивания проб либо вручную.
12.2.6. Центрифужную пробирку помещают в центрифугу и центрифугируют при ускорении 3000 g в течение 10 мин
12.2.7. Проверьте эффективность разделения фаз. В случае недостаточно эффективного разделения процедуру центрифугирования повторяют.
12.2.8. С помощью пипетки Пастера и груши эфирный слой переносят в пробирку устройства для испарения экстрактов либо, при отсутствии такого устройства, в грушевидную колбу лабораторного микроиспарителя (см. Приложение 1). При заборе эфирного слоя в пипетку Пастера избегайте попадания в пипетку водной фазы.
12.2.9. Повторите процедуру экстракции согласно пп. 12.2.5. - 12.2.8.
12.2.10. Объедините эфирные экстракты и испарите их досуха в вытяжном шкафу.
Примечание: для испарения экстрактов можно использовать специализированное устройство для испарения экстрактов, лабораторный микроиспаритель (см. Приложение 1), либо водяную баню и подходящий к имеющейся центрифуге стеклянный флакон на 30 мл с завинчивающейся крышкой, материал которой устойчив к использующимся реагентам. При выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира — 55.5 °C, температура кипения диэтилового эфира — 34.5 °C).
12.2.11. После испарения эфирного слоя досуха в сосуд с сухим остатком (в случае использования лабораторной установки — в грушевидную колбу) поместите 1 мл 70% раствора метанола и тщательно омойте стенки сосуда.
12.2.12. Для обезжиривания метанольного раствора поместите в сосуд 3 мл петролейного эфира, закройте герметичной крышкой (притертой стеклянной пробкой) и энергично встряхивайте сосуд в течение 15 секунд.
12.2.13. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 5 мл, центрифугируйте при 3000 g в течение 5 мин (если испарение эфирного экстракта проводилось в стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется непосредственно в этом флаконе).
12.2.14. С помощью пипетки Пастера отберите из центрифужной пробирки (либо из стеклянного флакона) верхний слой петролейного эфира и отбросьте его. Нижний метанольный слой перенесите в сосуд, в котором проводилось испарение эфирного экстракта и выпарите раствор досуха, руководствуясь п. 12.2.10 (температура кипения метанола — 64.5 °C).
12.2.15. Поместите в сосуд 1 мл дихлорметана, растворите сухой остаток, тщательно омывая стенки сосуда. Поместите в сосуд 3 мл 1Н раствора гидрооксида натрия, закройте герметичной крышкой и энергично встряхивайте в течение 5 мин.
12.2.16. Перенесите содержимое сосуда в центрифужную пробирку на 5 мл, центрифугируйте при 3000 g в течение 5 мин (если испарение метанольного раствора по п. 12.2.14 проводилось в стеклянном флаконе, центрифугирование выполняется непосредственно в этом флаконе).
12.2.17. С помощью пипетки Пастера отберите верхний щелочной слой и перенесите его в другую чистую пробирку.
12.2.18. С помощью дозатора добавьте в пробирку с щелочным экстрактом 300 мкл 6М раствора фосфорной кислоты.
12.2.19. Следуйте процедуре очистки пробы методом твердофазной экстракции, описанной в разделе 12.1.3.
12.3 Пробы фекалий.
12.3.1. Навеску 5 г пробы фекалий переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и гомогенизируют с 10 мл дистиллированной воды.
12.3.2. Далее следуют процедуре пробоподготовки, начиная с раздела 12.2.4.
12.4 Пробы печени.
12.4.1. Навеску 1 г пробы печени переносят в сосуд микроизмельчителя тканей и гомогенизируют с 2 мл 0.5М раствора ацетатного буфера, pH 4.8.
12.4.2. В смесь вносят 8 мкл глюкоронидазы/арилсульфатазы и выдерживают раствор в термостате при температуре 37 °C в течение 3-х часов.
Гидролизат может хранится 2 — 3 дня при температуре 2 — 8 °C, либо 3 — 4 недели при температуре -20 °C.
12.4.3. Далее следуют процедуре пробоподготовки, начиная с раздела 12.2.4.
13. Порядок проведения измерений
13.1 Предварительные замечания по проведению измерений с помощью тест-системы ridascreEn® des
Перед использованием тест-системы доведите температуру всех реагентов до комнатной (30 — 40 минут до температуры 18 — 20 °C).
Немедленно после использования охладите все оставшиеся реагенты до температуры 2 — 8 °C.
В процессе выполнения анализа не допускайте высыхания лунок планшета.
Воспроизводимость результатов иммуноферментного анализа существенно зависит от тщательности отмывки планшета в процессе анализа. Внимательно следуйте описанной далее процедуре отмывки планшета.
На всех стадиях инкубации избегайте воздействия прямого солнечного света.
13.2 Подготовка к измерениям
13.2.1 Приготовление препарата конъюгата
Конъюгат диэтилстильбестрола с ферментом (флакон с красной крышкой) поставляется в концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат конъюгата имеет ограниченную стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата.
Перед разбавлением концентрированного препарата конъюгата осторожно встряхните содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата конъюгата разбавьте концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата конъюгата с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений).
13.2.2 Приготовление препарата антител
Антитела к диэтилстильбестролу (флакон с черной крышкой) поставляются в концентрированном виде. Поскольку разбавленный препарат антител имеет ограниченную стабильность, перед анализом следует готовить только необходимое количество препарата. Перед разбавлением концентрированного препарата антител осторожно встряхните содержимое флакона. Для приготовления готового к использованию препарата антител разбавьте концентрированный препарат буферным раствором, имеющимся в комплекте набора, в отношении 1:11 (например, в пробирке на 5 мл смешайте 200 мкл концентрированного препарата антител с 2 мл буфера — данного разведения достаточно для 4-х стрипов, то есть для 32 определений)
13.2.3 Микротитровальный планшет, сенсибилизированный антителами
Перед выполнением анализа из планшета следует извлечь необходимое количество стрипов.
Остальные стрипы следует тщательно упаковать в фольгированный пакет вместе с силикагелем (осушителем), закрыть застежку пакета и поместить на хранение при температуре 2 — 8 °C.
13.2.4 Стандартные растворы
Стандартные растворы диэтилстильбестрола поставляются готовыми для использования в следующих концентрациях:
| Стандарт 1 | 0 ppt |
|---|---|
| Стандарт 2 | 12.5 ppt |
| Стандарт 3 | 25 ppt |
| Стандарт 4 | 50 ppt |
| Стандарт 5 | 100 ppt |
| Стандарт 6 | 200 ppt |
13.3 Процедура анализа
13.3.1. Вставьте в рамку планшета лунки в количестве, необходимом для выполнения всех запланированных определений в дубле (по 2 раза). Запишите координаты лунок, предназначенных для стандартных растворов и подготовленных исследуемых растворов. Пример формы записи приведен на Рис. 1.
Рисунок 1. Пример формы записи координат лунок перед выполнением анализа (С — стандарты, П — пробы).
13.3.2. С помощью дозатора добавьте по 20 мкл стандартных и исследуемых растворов в соответствующие пары лунок.
13.3.3. С помощью дозатора добавьте в каждую лунку по 50 мкл готового разбавленного препарата антител. При выполнении этой и последующих операций предпочтительно использование 8-ми канального дозатора (при этом раствор удобно отбирать из специальной ванночки или из чашки Петри). Путем осторожного постукивания по краям планшета перемешайте раствор в лунках и оставьте планшет на ночь для инкубации при температуре 2 — 8 °C (в бытовом холодильнике).
13.3.4. Вылейте жидкость из лунок и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью дозатора наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок водой еще один раз.
13.3.5. Добавьте по 50 мкл разбавленного препарата конъюгата в каждую лунку и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре.
13.3.6. Вылейте жидкость из лунок, переверните рамку планшета и тщательно выбейте капельки жидкости, оставшиеся в лунках, путем троекратного постукивания рамки с лунками по столу, накрытому фильтровальной бумагой. С помощью дозатора наполните лунки 250 мкл дистиллированной воды и вылейте воду. Выбейте капельки воды как описано выше. Повторите процедуру промывки лунок водой еще два раза.
13.3.7. Добавьте по 50 мкл субстрата и по 50 мкл хромогена в каждую лунку. Тщательно перемешайте и инкубируйте при комнатной температуре в течение 15 минут в темноте.
13.3.8. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл стоп-реагента и хорошо перемешайте. В течение 60-ти минут после добавления стоп-реагента измерьте оптическую плотность в каждой лунке при 450 нм.
14. Обработка результатов исследования
14.1. Вычисление концентрации диэтилстильбестрола в исследуемых образцах.
Средние значения оптической плотности, измеренной в лунках со стандартными и исследуемыми растворами делятся на среднее значение оптической плотности, измеренной в лунках с первым (нулевым) стандартом, результат умножается на 100. Таким образом, результат измерения оптической плотности выражается в процентах от оптической плотности лунки с нулевым стандартом, то есть:
По величинам относительного поглощения, вычисленным для стандартных растворов и соответствующим значениям концентрации диэтилстильбестрола в нг/кг (ppt) строится калибровочная кривая в полулогарифмической системе координат. Калибровочная кривая должна быть почти линейна в диапазоне 25 — 200 нг/кг (см. Рис. 2).
Концентрация диэтилстильбестрола в исследуемых растворах в нг/кг (ppt) считывается по калибровочной кривой соответственно относительному поглощению, измеренному и вычисленному для этих растворов.
Для компьютерной обработки результатов измерений рекомендуется использовать специализированное программное обеспечение, например, rida®soft <*>. При компьютерной обработке результатов следует руководствоваться инструкцией по использованию программного обеспечения.
<*> Поставляется ООО «СТАЙЛАБ» тел./факс (095) 265-44-05
Внимание: Для того чтобы вычислить концентрацию диэтилстильбестрола в исследуемой исходной пробе, величину концентрации диэтилстильбестрола, полученную по калибровочной кривой, следует умножить на соответствующий фактор разбавления. При выполнении пробоподготовки и анализа в полном соответствии с приведенной методикой фактор разбавления принимает следующие значения:
| Моча | 16 |
|---|---|
| Мясо, фекалии, печень | 8 |
Рисунок 2. Калибровочная кривая, полученная для тест-системы ridascreEn® des
ПРИМЕЧАНИЕ: При положительном результате определения исследование образцов, показавших положительный результат, повторяют. При повторном исследовании образцов рекомендуется выполнить оценку коэффициента извлечения с помощью внесения в образец добавки диэтилстильбестрола на стадии пробоподготовки в количестве, близком к найденному (см. Приложение 2).
15. Интерпретация результатов исследования
Использование диэтилстильбестрола в животноводстве и птицеводстве, импорт и реализация продукции животного происхождения, содержащей остаточные количества диэтилстильбестрола, полностью запрещены как в странах Евросоюза так и в Российской Федерации.
Чувствительность иммуноферментного метода анализа позволяет определять концентрации диэтилстильбестрола в мясе на уровне 0.1 мкг/кг и более.
Однако, поскольку в практике ветеринарно-санитарного контроля при положительном результате определения проводят подтверждающий анализ независимым методом (используется, например, хроматомасс-спектрометрия, высокоэффективная жидкостная хроматография), обладающим худшей чувствительностью, результат определения интерпретируют как положительный если величина найденной концентрации больше предела обнаружения независимого метода анализа.
Предел обнаружения хромато-масс-спектрометрического метода определения диэтилстильбестрола составляет 1 мкг/кг.
Пробы с найденной концентрацией диэтилстильбестрола в диапазоне от 0.1 мкг/кг до 1 мкг/кг рассматривают как «подозрительные».
П1.1. При отсутствии готового устройства для испарения экстрактов соберите лабораторный микроиспаритель согласно Рис. 3. Через предохранительную склянку (можно использовать коническую колбу на 500 мл) подключите водоструйный насос.
Рисунок 3. Лабораторная установка для испарения экстрактов: 1 — колба грушевидная; 2 — водяная баня; 3 — термометр;
4 — переход; 5 — пипетка Пастера; 6 — корковая пробка;
7 — трубка соединительная (тройник); 8 — зажим Гофмана;
9 — вакуумный шланг; 10 — к предохранительной склянке
и водоструйному насосу.
Для сборки лабораторного микроиспарителя необходимо следующее оборудование:
Насос водоструйный по ГОСТ 25336
Колба грушевидная для упаривания вместимостью 25 мл типа ГР-25-14/23 по ТУ 92-891.029-91 с притертой стеклянной пробкой
Переход типа П10-14/23 (с одной горловиной и отводом) по ГОСТ 25336
Колба коническая с цилиндрической горловиной типа КН-3-500-34 по ТУ 92-891.029-91
Шланг вакуумный на отвод перехода типа П10-14/23
Зажим Гофмана на вакуумный шланг
Корковые пробки под колбу КН-3-500-34 и ГР-25-14/23
Набор ручных сверл для сверления пробок
Электроплитка с закрытой спиралью
П1.2. Выпарите эфирный экстракт досуха. При выпаривании избегайте кипения эфира. Температуру испарения контролируют с помощью термометра (температура кипения метилтретбутилового эфира — 55.5 °C, температура кипения диэтилового эфира — 34.5 °C). Отрегулируйте вакуум с помощью зажима Гофмана так, чтобы обеспечить слабую подачу воздуха в грушевидную колбу (на поверхности эфира должна быть заметна небольшая ямка, слишком сильный ток воздуха может привести к разбрызгиванию экстракта и потерям).
Фактический коэффициент извлечения рассчитывается методом внесения добавки определяемого соединения.
П2.1. Масса вносимой добавки рассчитывается по следующей формуле:
где m — масса добавки диэтилстильбестрола, нг
Cб — найденная концентрация диэтилстильбестрола в образце, мкг/кг (мкг/л при исследовании мочи)
M — масса (объем) образца, г (мл при исследовании мочи)
П2.2. Вносимый объем стандартного раствора диэтилстильбестрола рассчитывается по формуле:
где v — объем стандартного раствора диэтилстильбестрола, мкл
m — масса добавки диэтилстильбестрола, нг
Cд — концентрация стандартного раствора диэтилстильбестрола, нг/мл
П2.3. С помощью микродозатора внесите вычисленное количество добавки в исследуемый образец перед пробоподготовкой.
П2.4. Выполните определение диэтилстильбестрола в образце, руководствуясь настоящей методикой.
П2.5. Поправка на коэффициент извлечения рассчитывается по следующей формуле:
k извл. = Cс x M/(Cб x M + m),
где k извл. — коэффициент извлечения
Cс — найденная концентрация в образце после внесения добавки, мкг/кг (мкг/л для мочи)
Cб — найденная концентрация диэтилстильбестрола в образце до внесения добавки, мкг/кг (мкг/л для мочи)
M — масса (объем) образца, г (мл при исследовании мочи)
m — масса добавки диэтилстильбестрола, нг
П2.6. Выполните перерасчет найденной концентрации диэтилстильбестрола в образце с учетом коэффициента извлечения по следующей формуле:
где Cб — найденная концентрация диэтилстильбестрола в образце до внесения добавки, мкг/кг (мкг/л для мочи)
k извл. — коэффициент извлечения