Временные методические указания по лабораторной диагностике гемофилезного полисерозита свиней

(утв. Минсельхозом СССР 17.10.1978)

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ГЕМОФИЛЕЗНОГО ПОЛИСЕРОЗИТА СВИНЕЙ

1. Общие положения.

1.1. Гемофилезный полисерозит — инфекционное, септическое заболевание поросят послеотъемного периода, характеризующееся серозно-фибринозным воспалением плевры, перикарда, брюшины и суставов.

1.2. Возбудитель болезни — капсулообразующие штаммы Haemophilus parasuis (сем. Brucellaceae, род Haemophilus; Bergey, 1974). Это мелкая (0,2x0,5 мкм), грамотрицательная, неподвижная, не образующая спор, полиморфная палочка, обладающая резко выраженным тропизмом к серозным оболочкам. Для роста на искусственных питательных средах нуждается в специфическом ростовом факторе — дифосфопиридиннуклеотиде (У-фактор), который содержится в крови, дрожжевом экстракте и в продуктах жизнедеятельности некоторых бактерий.

1.3. Лабораторный диагноз на гемофилезный полисерозит устанавливают на основании результатов бактериологического исследования патологического материала от павших или вынужденно убитых животных, а также и биологической пробы.

2. Бактериологическое исследование.

2.1. Материал для лабораторного исследования берут не позднее 4 — 6 ч после смерти от 2 — 3 трупов поросят, павших с признаками острого полисерозита и не подвергавшихся антибиотикотерапии. Поверхность кожи в области разреза обрабатывают дезинфицирующим раствором и стерильным инструментом вскрывают брюшную и грудную полости. Затем стерильным шприцем или пастеровской пипеткой набирают экссудат из перитонеальной, плевральной, перикардиальной полостей и переносят в одну стерильную пробирку или флакон. В эту же пробирку (флакон) вносят соскобы, сделанные стерильным скальпелем с поверхности пораженных серозных оболочек (плевра, перикард, перитонеум). От каждого животного патологический материал помещают в отдельную пробирку (флакон), закрывают резиновой пробкой, маркируют и в термосе со льдом нарочным отправляют в ветеринарную лабораторию.

2.2. Исследование патологического материала заключается в выделении чистой культуры H. parasuis и складывается из микроскопии мазков из патологического материала, выделения культур возбудителя на специальных средах, их идентификации и определения патогенности на морских свинках.

2.3. Микроскопическое исследование. Доставленный патологический материал суспендируют непосредственно в пробирке (флаконе). Из суспензии готовят мазки, высушивают их на воздухе, фиксируют над пламенем горелки, окрашивают по Граму и микроскопируют. В мазках возбудитель имеет вид мелких, полиморфных, грамотрицательных палочек, диплобактерий, нитей или коротких цепочек.

2.4. Бактериологическое исследование. Высевы на питательные среды должны быть проведены не позднее 24 ч после взятия патологического материала.

2.4.1. Две-три капли суспензии из экссудата и соскобов с серозных оболочек наносят на поверхность предварительно подсушенного кровяного мясо-пептонного агара в чашке Петри. Стерильным стеклянным шпателем материал распределяют по всей поверхности агара, а затем дробно рассевают на 3 чашки с указанной питательной средой. После 20 — 30-минутного подсушивания бактериологической петлей делают крестообразный посев штрихом по диаметру чашки культуры негемолитического штамма белого стафилококка или кишечной палочки («баккормилка»). Посевы инкубируют в аэробных условиях при 37 — 38 °C в течение 24 ч.

Субкультуры негемолитических штаммов белого стафилококка или эшерихий поддерживают в лаборатории. Для исследований используют агаровую или бульонную культуры, которые хранят в холодильнике при 4 — 8 °C не более 10 дн.

2.4.2. На кровяном МПА рост гемофильных бактерий наблюдается в зоне, прилегающей к культуре «баккормилки», в виде мелких (0,1 — 0,2 мм), правильной круглой формы негемолитических колоний с гладкой, выпуклой, блестящей поверхностью, слизистой консистенции. Сателлитный рост гемофильных бактерий около «баккормилки» обусловлен диффузией в агаровую среду У-фактора, выделяемого культурой кишечной палочки или стафилококка. Микроскопически видимые колонии гемофильных бактерий растут не далее 1 — 2 см от штриха «баккормилки».

2.4.3. При обнаружении в посевах сателлитных негемолитических колоний из них делают мазки, которые окрашивают по Граму и Гинсу. В мазках из культуры H. parasuis имеет вид мелких (0,2x0,5 мкм) грамотрицательных палочек и нитей различной длины. При окраске по методу Гинса в мазке на темном фоне находят мелкие, палочковидные (нитевидные) бактерии красного цвета, окруженные узкой светлой зоной (капсула).

2.4.4. Из 3 — 4 сателлитных негемолитических колоний бактерий, имеющих типичную для H. parasuis морфологию, делают пересевы в чашки Петри на шоколадный агар, на 10%-ный сывороточный МПА с последующим посевом бактерии-«кормилки». Одновременно делают высев культур на тот же сывороточный МПА без бактерии-«кормилки» (рецепты питательных сред см. в приложении). Посевы инкубируют 24 ч при 37 — 38 °C.

Культуры, которые не обладают гемолитическими свойствами, не растут на сывороточном МПА, но дают рост на шоколадном и на сывороточном МПА с бактерией-«кормилкой», относят к виду H. parasuis.

2.5. Биологическое исследование для определения патогенных свойств H. parasuis проводят на морских свинках. Для этой цели исследуемую культуру высевают на шоколадный агар и выращивают при 37 — 38 °C в течение 24 ч. Выращенную культуру смывают стерильным 0,85%-ным раствором поваренной соли и доводят концентрацию бактериальной суспензии до 20 ед. мутности по оптическому стандарту. Эту суспензию в дозе 1 мл вводят внутрибрюшинно трем морским свинкам массой 300 — 350 г.

Наблюдение за зараженными животными ведут в течение 5 сут.

Культуру признают патогенной в случае гибели одной или более морских свинок. Из перитонеального и плеврального экссудатов, а также из печени, селезенки и крови сердца каждой павшей морской свинки делают посевы на кровяной или сывороточный МПА в чашках Петри с «баккормилкой». Наличие в посевах роста сателлитных колоний бактерий с типичными морфологическими и тинкториальными свойствами свидетельствует о выделении исходной культуры H. parasuis.

2.6. Лабораторный диагноз на гемофилезный полисерозит считают установленным при выделении из патологического материала культуры H. parasuis, патогенной для морских свинок.

2.7 Срок лабораторного исследования — 8 сут.

2.8. Диагноз на гемофилезный полисерозит устанавливают на основании анализа эпизоотологических, клинических и патологоанатомических данных с обязательным учетом результатов бактериологического исследования материала от павших или вынужденно убитых животных.

Приложение

I. Этапы проведения бактериологического исследования:

1-й день — посев патологического материала на питательные среды. Микроскопия мазков из патологического материала;

2-й день — просмотр посевов, микроскопия культур из колоний, типичных для гемофильных бактерий. Отвивка субкультур;

3-й день — учет роста субкультур на питательных средах. Заражение морских свинок;

4 — 8-й дни — учет результатов биопробы.

II. Рецепты питательных сред.

1. Шоколадный агар. К расплавленному 2%-ному МПА (pH 7,2) при температуре 80 — 90 °C добавляют 10% (по объему) стерильной дефибринированной крови лошади или барана. Питательную среду тщательно перемешивают и после охлаждения до 50 — 60 °C разливают в чашки Петри. Среда пригодна для употребления в течение 10 дн. при условии хранения в темноте при 5 — 8 °C.

2. Для культивирования H. parasuis с «баккормилками» используют кровяной МПА (pH 7,2), содержащий 5% крови овцы, и сывороточный МПА (pH 7,2) с добавлением 10% сыворотки крови крупного рогатого скота, лошади или овцы, которые готовят обычным способом.

В качестве питающей бактериальной культуры («баккормилки») используют любой негемолитический штамм эшерихий или белого стафилококка. Культуру стафилококка легко получить посевом смыва кожных покровов рук на кровяной МПА.

III. Окраска по методу Гинса.

К одному объему черной туши добавляют 3 объема дистиллированной воды. Разведенную тушь центрифугируют 15 — 20 мин при 2 — 3 тыс. об/мин для осаждения крупных частиц. Надосадочную жидкость используют для работы.

На предметном стекле в капле туши суспендируют петлю исследуемой агаровой культуры, делают мазок (как мазок из крови), высушивают, фиксируют метиловым или этиловым спиртом в течение 3 — 5 мин. Окрашивают 3 — 5 мин карболовым фуксином Циля, разведенным в соотношении 1:3. Промывают водой, высушивают и микроскопируют. При микроскопировании на темном фоне препарата контрастно выделяются неокрашенные капсулы, внутри которых находятся бактерии красного цвета.

---