---
title: "\"Временное наставление по лабораторной диагностике инфекционного ларинготрахеита кур\""
issuer: "Министерство сельского хозяйства СССР"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/vremennoe-nastavlenie-po-laboratornoy-minselhoz-sssr-ministerstvo"
---

## "Временное наставление по лабораторной диагностике инфекционного ларинготрахеита кур"

# "Временное наставление по лабораторной диагностике инфекционного ларинготрахеита кур"

(утв. Минсельхозом СССР 27.08.1980)

> [!IMPORTANT]
> Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563).


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждено<br>
Министерством сельского<br>
хозяйства СССР

</div>

<div align="center">

**27 августа 1964 года**

<a id="p100002"></a>**ВРЕМЕННОЕ НАСТАВЛЕНИЕ**

</div>

ПО ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКЕ ИНФЕКЦИОННОГО
ЛАРИНГОТРАХЕИТА КУР

<a id="p100003"></a>Возбудитель относится к группе герпес, содержит ДНК, его размер 250 нм.
<a id="p100004"></a>Материал для исследования: трупы кур, паренхиматозные органы, трахеи, гортани, выделения из трахеи и гортани, сыворотка крови.
<a id="p100005"></a>Микроскопические исследования: мазки-соскобы с конъюнктивы, гортани и трахеи павших или клинически больных кур в ранней стадии заболевания высушивают на воздухе, фиксируют спирт-эфиром в течение 20 мин и окрашивают раствором краски Гимза (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) при 37 °C в течение 2 ч или при комнатной температуре 12 ... 18 ч. Затем мазки промывают водой, обесцвечивают, быстро погружая в метиловый спирт, снова промывают водой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Ацидофильные включения обнаруживают в ядрах клеток. Ядро с включениями увеличено, с более темной окраской - стенки ядра. Цитоплазма пораженной клетки - голубая, ядро - темно-фиолетовое, а включение - красное с розовым оттенком. Вокруг включения наблюдается неокрашенная зона. Включения имеют разнообразную форму (круглую, вытянутую, треугольную).
<a id="p100006"></a>Выделение вируса инфекционного ларинготрахеита на куриных эмбрионах. При вскрытии павших или вынужденно убитых кур отбирают пораженные гортань, трахею, конъюнктиву. Собранный материал гомогенизируют с физиологическим раствором в разведении 1:10, центрифугируют при 1 ... 1,5 тыс. об/мин в течение 10 мин. Далее к надосадочной жидкости добавляют антибиотики по 1000 ЕД (стрептомицина и пенициллина) на 1 мл суспензии. Материал выдерживают в течение 3 ... 12 ч при температуре 2 ... 4 °C и заражают им 9 ... 12-дневных куриных эмбрионов.
<a id="p100007"></a>Эмбрионы заражают нанесением суспензии на хорионаллантоисную мембрану в дозе 0,2 мл по принятой методике. Зараженных эмбрионов помещают в термостат при температуре 37 °C на 5 ... 6 сут, при этом их ежедневно просматривают на овоскопе. Всех погибших эмбрионов вскрывают в день гибели, а оставшихся живыми - на 5-й день после заражения, предварительно охладив их в течение 2 ... 3 ч при температуре 4 °C. В стерильные пробирки с растертым стеклом отдельно помещают измененные хорионаллантоисные оболочки вместе с эмбриональной жидкостью. Из каждого эмбриона делают высевы одновременно на МПА и МПБ.
<a id="p100008"></a>Пораженные вирусом хорионаллантоисные оболочки после бактериологического контроля тщательно гомогенизируют в пробирках со стеклом. Гомогенат из отдельных пробирок объединяют в общий флакон, а затем расфасовывают по 1 ... 2 мл в ампулы, которые хранят при температуре 10 ... 12 °C. Вирус инфекционного ларинготрахеита вызывает на 4 ... 5-й день инкубации на хорионаллантоисной мембране зараженных куриных эмбрионов появление многочисленных беловатых узелков или крупных некротических очагов с зоной отека на месте введения.
<a id="p100009"></a>Специфичность вируса инфекционного ларинготрахеита определяют постановкой биопробы и реакцией нейтрализации на куриных эмбрионах с заведомо позитивными сыворотками.
<a id="p100010"></a>Биопробу ставят на восприимчивой птице 30 ... 40-дневного возраста нанесением вирусного материала по 0,5 мл на слизистую трахеи и слегка ее скарифицируя, а на 3 ... 5-месячной птице - путем нанесения вируса на слизистую клоаки.
<a id="p100011"></a>За птицей устанавливают ежедневное наблюдение в течение 10 ... 14 сут, отмечая клинические признаки болезни (кашель, хрипы, поражение гортани, ринит). У птиц, зараженных в клоаку, учитывают наличие "клоачной пробы".
<a id="p100012"></a>От павших и клинически больных кур в ранней стадии заболевания делают мазки-соскобы со слизистой пораженной трахеи, конъюнктивы. Мазки окрашивают краской Гимзы (1 капля краски на 1 мл дистиллированной воды) при 37 °C в течение 2 ч или при комнатной температуре в течение 12 ... 18 ч. После этого мазки промывают водой, обесцвечивают (быстрым погружением мазка в метиловый спирт), промывают водой и просматривают под микроскопом с иммерсионной системой. Ацидофильные включения обнаруживают в ядре пораженной клетки. Обычно ядро с включением увеличено, с более темной окраской стенки. Цитоплазма зараженной клетки окрашивается в голубой цвет, ядро - в темно-фиолетовый, а включения - в красный с розовым оттенком. Вокруг включения наблюдается неокрашенная зона. Включения имеют разнообразную форму (круглую, вытянутую, треугольную).
<a id="p100013"></a>Для исключения вируса оспы кур, вызывающего на хорионаллантоисной мембране поражения, сходные с поражениями вирусом инфекционного ларинготрахеита, заражают цыплят 30 ... 60-дневного возраста (ранее не привитых против оспы птиц) в гортань, перьевые фолликулы голени и гребешок. Оспенная реакция у зараженной птицы проявляется на 6 ... 8-й день припуханием и покраснением фолликул и образованием ложных дифтеритических наложений в ротовой полости. При вирусоскопии по Морозову в мазках из развившихся фолликул обычно обнаруживают оспенные элементарные тельца.
<a id="p100014"></a>Постановка реакции нейтрализации вируса инфекционного ларинготрахеита кур. Реакцию нейтрализации при диагностике на инфекционный ларинготрахеит с испытуемыми сыворотками от переболевшей птицы применяют для установления природы наблюдавшейся инфекции, дифференциальной диагностики атипичных случаев заболевания, проявляющихся клиническими признаками поражения респираторных органов.
<a id="p100015"></a>Для этого проводят типизирование выделяемых штаммов вируса инфекционного ларинготрахеита, используя различные гипериммунные кроличьи сыворотки.

<div align="center">

<a id="p100016"></a>Для постановки реакции нейтрализации требуется следующая лабораторная посуда и компоненты: пробирки Флоринского, бактериологические пробирки, резиновые пробки N 12 и 14, градуированные пипетки, штативы 100- и 40-гнездные, антибиотики (пенициллин и стрептомицин), 9 ... 12-дневные куриные эмбрионы.<br>
<a id="p100017"></a>В штативе расставляют несколько рядов стерильных пробирок, закрытых стерильными пробками, причем количество рядов должно соответствовать числу испытуемых сывороток, а количество пробирок в одном ряду - числу разведений вируса.<br>
<a id="p100018"></a>Сухими стерильными пипетками в стерильные пробирки разливают испытуемые сыворотки в дозе 0,5 мл в каждую пробирку. Параллельно для контроля разливают нормальную сыворотку (кроличья или куриная в той же дозе). Предварительно все сыворотки инактивируют при 56 °C 30 мин. После того как испытуемые сыворотки разлиты, к ним и контрольным сывороткам добавляют в разном объеме (по 0,5 мл) разведения вируса: 1:10, 1:100, 1:1000, 1:10 000. Вирус можно добавлять одной пипеткой при условии, если начинать разливать с наибольшего разведения.<br>
<a id="p100019"></a>Реакцию нейтрализации вируса инфекционного ларинготрахеита кур ставят по таблице 45.

<a id="p100020"></a>Таблица 45

<a id="p100021"></a>Постановка реакции нейтрализации

</div>



<table>
<colgroup><col width="6%"><col width="14%"><col width="18%"><col width="16%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="10%"><col width="8%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100022"></a>Ряд</td><td rowspan="2"><a id="p100023"></a>Номер пробирки</td><td rowspan="2"><a id="p100024"></a>Нормальная сыворотка крови, мл</td><td rowspan="2"><a id="p100025"></a>Иммунная сыворотка, мл</td><td colspan="5"><a id="p100026"></a>Разведение вируса</td></tr>
<tr><td><a id="p100027"></a>10-1</td><td><a id="p100028"></a>10-2</td><td><a id="p100029"></a>10-3</td><td><a id="p100030"></a>10-4</td><td><a id="p100031"></a>10-5</td></tr>
<tr><td rowspan="5"><a id="p100032"></a>1</td><td><a id="p100033"></a>1</td><td><a id="p100034"></a>0,5</td><td><a id="p100035"></a>-</td><td><a id="p100036"></a>0,5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100037"></a>2</td><td><a id="p100038"></a>0,5</td><td><a id="p100039"></a>-</td><td></td><td><a id="p100040"></a>0,5</td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100041"></a>3</td><td><a id="p100042"></a>0,5</td><td><a id="p100043"></a>-</td><td></td><td></td><td><a id="p100044"></a>0,5</td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100045"></a>4</td><td><a id="p100046"></a>0,5</td><td><a id="p100047"></a>-</td><td></td><td></td><td></td><td><a id="p100048"></a>0,5</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100049"></a>5</td><td><a id="p100050"></a>0,5</td><td><a id="p100051"></a>-</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><a id="p100052"></a>0,5</td></tr>
<tr><td rowspan="5"><a id="p100053"></a>2</td><td><a id="p100054"></a>1</td><td><a id="p100055"></a>-</td><td><a id="p100056"></a>0,5</td><td><a id="p100057"></a>0,5</td><td></td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100058"></a>2</td><td><a id="p100059"></a>-</td><td><a id="p100060"></a>0,5</td><td></td><td><a id="p100061"></a>0,5</td><td></td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100062"></a>3</td><td><a id="p100063"></a>-</td><td><a id="p100064"></a>0,5</td><td></td><td></td><td><a id="p100065"></a>0,5</td><td></td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100066"></a>4</td><td><a id="p100067"></a>-</td><td><a id="p100068"></a>0,5</td><td></td><td></td><td></td><td><a id="p100069"></a>0,5</td><td></td></tr>
<tr><td><a id="p100070"></a>5</td><td><a id="p100071"></a>-</td><td><a id="p100072"></a>0,5</td><td></td><td></td><td></td><td></td><td><a id="p100073"></a>0,5</td></tr>
</table>


<a id="p100074"></a>*Обозначения: (+) - поражения хорионаллантоисной оболочки, характерные для вируса инфекционного ларинготрахеита; (-) - отсутствие поражений хорионаллантоисной оболочки.*

<a id="p100075"></a>*Смесь встряхивают и помещают в холодильник при температуре 2 ... 4 °C на 1 ... 2 ч. После этого смесь инокулируют на хорионаллантоисную оболочку 10 ... 12-дневных куриных эмбрионов в дозе по 0,2 мл. Каждым разведением смеси вируса с сывороткой заражают по 4 эмбриона. Зараженные куриные эмбрионы инкубируют при температуре 37 °C. На 5-й день после заражения эмбрионы вскрывают и регистрируют специфические поражения хорионаллантоиса.*
<a id="p100076"></a>*Реакция нейтрализации на куриных эмбрионах считается положительной, если в эмбрионе (инокулированном смесью вируса с гипериммунной сывороткой) не будут обнаружены фокусы поражения на хорионаллантоисе, т.е. размножение вируса будет подавлено антителами. Результаты реакции нейтрализации выражаются индексом нейтрализации. Реакцию нейтрализации на куриных эмбрионах учитывают по таблице 46.*

<a id="p100077"></a>*Таблица 46*

<a id="p100078"></a>*Реакция нейтрализации на куриных эмбрионах*


<table>
<colgroup><col width="20%"><col width="10%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="7%"><col width="19%"><col width="15%"></colgroup>
<tr><td rowspan="2"><a id="p100079"></a>Сыворотка</td><td rowspan="2"><a id="p100080"></a>Число эмбрионов</td><td colspan="5"><a id="p100081"></a>Разведение вируса</td><td rowspan="2"><a id="p100082"></a>Титр вируса в присутствии сыворотки</td><td rowspan="2"><a id="p100083"></a>Индекс реакции нейтрализации</td></tr>
<tr><td><a id="p100084"></a>10-1</td><td><a id="p100085"></a>10-2</td><td><a id="p100086"></a>10-3</td><td><a id="p100087"></a>10-4</td><td><a id="p100088"></a>10-5</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100089"></a>Нормальная кроличья сыворотка</td><td><a id="p100090"></a>1</td><td><a id="p100091"></a>+</td><td><a id="p100092"></a>+</td><td><a id="p100093"></a>+</td><td><a id="p100094"></a>+</td><td><a id="p100095"></a>-</td><td rowspan="4"><a id="p100096"></a>ИД50 = 4,0 в 0,1 мл</td><td rowspan="8"><a id="p100097"></a>1000</td></tr>
<tr><td><a id="p100098"></a>2</td><td><a id="p100099"></a>+</td><td><a id="p100100"></a>+</td><td><a id="p100101"></a>+</td><td><a id="p100102"></a>+</td><td><a id="p100103"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100104"></a>3</td><td><a id="p100105"></a>+</td><td><a id="p100106"></a>+</td><td><a id="p100107"></a>+</td><td><a id="p100108"></a>-</td><td><a id="p100109"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100110"></a>4</td><td><a id="p100111"></a>+</td><td><a id="p100112"></a>+</td><td><a id="p100113"></a>+</td><td><a id="p100114"></a>-</td><td><a id="p100115"></a>-</td></tr>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100116"></a>Гипериммунная кроличья сыворотка</td><td><a id="p100117"></a>1</td><td><a id="p100118"></a>+</td><td><a id="p100119"></a>-</td><td><a id="p100120"></a>-</td><td><a id="p100121"></a>-</td><td><a id="p100122"></a>-</td><td rowspan="4"><a id="p100123"></a>ИД50 = 1,0 в 0,1 мл</td></tr>
<tr><td><a id="p100124"></a>2</td><td><a id="p100125"></a>+</td><td><a id="p100126"></a>-</td><td><a id="p100127"></a>-</td><td><a id="p100128"></a>-</td><td><a id="p100129"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100130"></a>3</td><td><a id="p100131"></a>-</td><td><a id="p100132"></a>-</td><td><a id="p100133"></a>-</td><td><a id="p100134"></a>-</td><td><a id="p100135"></a>-</td></tr>
<tr><td><a id="p100136"></a>4</td><td><a id="p100137"></a>-</td><td><a id="p100138"></a>-</td><td><a id="p100139"></a>-</td><td><a id="p100140"></a>-</td><td><a id="p100141"></a>-</td></tr>
</table>


<a id="p100142"></a>*Титр вируса инфекционного ларинготрахеита - это доза, которая вызывает специфическое поражение хорионаллантоисной оболочки у 50% зараженных куриных эмбрионов (ИД50). Индекс нейтрализации представляет собой разность логарифмических показателей титров вируса в присутствии нормальной и иммунной сывороток.*
<a id="p100143"></a>*Как видно из [таблицы 46](#p100078), разность логарифмических показателей титра вируса в присутствии нормальной и гипериммунной кроличьих сывороток была равна 3. Найденное по таблице 2 антилогарифмов число и будет индексом нейтрализации. В данном случае оно равно 1000. Следует считать индексы нейтрализации 1 ... 9 отрицательными, 10 ... 49 - сомнительными, а от 50 и выше - положительными.*
<a id="p100144"></a>*Для определения индекса нейтрализации необходимо предварительно освоить метод статистического учета результатов титрования вируса инфекционного ларинготрахеита на хорионаллантоисе куриного эмбриона.*
<a id="p100145"></a>*Ниже приводится пример статистической обработки одного опыта титрования штамма вируса инфекционного ларинготрахеита (табл. 47).*

<a id="p100146"></a>*Таблица 47*

<a id="p100147"></a>*Схема расчета титра ИД50 по методу Рида и Менча*


<table>
<colgroup><col width="16%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="16%"><col width="22%"></colgroup>
<tr><td rowspan="4"><a id="p100148"></a>Разведение</td><td colspan="4"><a id="p100149"></a>Число куриных эмбрионов в каждом разведении</td><td rowspan="4"><a id="p100150"></a>Специфические поражения хорионаллантоисных оболочек, %</td></tr>
<tr><td colspan="2"><a id="p100151"></a>Абсолютные данные</td><td colspan="2"><a id="p100152"></a>Кумулятивные данные</td></tr>
<tr><td colspan="4"><a id="p100153"></a>Изменения на хорионаллантоисной оболочке</td></tr>
<tr><td><a id="p100154"></a>-</td><td><a id="p100155"></a>+</td><td><a id="p100156"></a>-</td><td><a id="p100157"></a>+</td></tr>
<tr><td><a id="p100158"></a>10-1</td><td><a id="p100159"></a>0</td><td><a id="p100160"></a>4</td><td><a id="p100161"></a>0</td><td><a id="p100162"></a>12</td><td><a id="p100163"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100164"></a>10-2</td><td><a id="p100165"></a>0</td><td><a id="p100166"></a>4</td><td><a id="p100167"></a>0</td><td><a id="p100168"></a>8</td><td><a id="p100169"></a>100</td></tr>
<tr><td><a id="p100170"></a>10-3</td><td><a id="p100171"></a>1</td><td><a id="p100172"></a>3</td><td><a id="p100173"></a>1</td><td><a id="p100174"></a>4</td><td><a id="p100175"></a>80</td></tr>
<tr><td><a id="p100176"></a>10-4</td><td><a id="p100177"></a>3</td><td><a id="p100178"></a>1</td><td><a id="p100179"></a>4</td><td><a id="p100180"></a>1</td><td><a id="p100181"></a>20</td></tr>
<tr><td><a id="p100182"></a>10-5</td><td><a id="p100183"></a>4</td><td><a id="p100184"></a>0</td><td><a id="p100185"></a>8</td><td><a id="p100186"></a>0</td><td><a id="p100187"></a>-</td></tr>
</table>


<div align="center">

<a id="p100188"></a>При титровании вируса процент инфекционности его возрастает прямо пропорционально не абсолютным величинам испытуемых доз, а их логарифмам.<br>
<a id="p100189"></a>Титр вируса вычисляют по следующей формуле:

<a id="p100190"></a> $X = \frac{Y - 50}{Y - Z} ,$ 

<a id="p100191"></a>где X - титр вируса; Y - процент инфекционности при высшей критической дозе; Z - процент инфекционности при низшей критической дозе; $X = \frac{80 - 50}{80 - 20} = \frac{30}{60} = 0,5$ .

</div>

<a id="p100192"></a>В нашем примере титр вируса инфекционного ларинготрахеита равен 3,5 в 0,1 мл или 4,5 в 1 мл.
<a id="p100193"></a>Реакция преципитации в агаровом геле. В реакции используют пластинки с луночками и чашки Петри. Агар готовят по общепринятой методике. Луночки заполняют антигенами и сыворотками по 0,2 мл каждую. В одну луночку в каждой чашке наливают сыворотку, а в остальные - различные антигены, в том числе один контрольный (нормальная аллантоисная жидкость, взвесь незараженной хорионаллантоисной мембраны, раствор, на котором приготовлен антиген).
<a id="p100194"></a>Чашки оставляют при комнатной температуре или в термостате при 37 °C и ежедневно в течение 3 сут наблюдают за появлением линий преципитации.
<a id="p100195"></a>Метод флуоресцирующих антител. Мазки-отпечатки из пораженного хорионаллантоиса, культуры ткани фибробластов куриного эмбриона, мазки со слизистой трахеи, конъюнктивы больной птицы окрашивают по общепринятой методике специфическими иммунофлуоресцентными сыворотками.
<a id="p100196"></a>Результаты иммунофлуоресценции оценивают в крестах в зависимости от интенсивности свечения и количества флуоресцирующих клеток. Положительная иммунофлуоресценция в мазках от больной птицы наблюдается в остром периоде заболевания, когда обнаруживают внутриядерные включения и можно выделить вирус на куриных эмбрионах [(1)](https://bukva.ai/docs/115-6a-minselhoz-sssr-ministerstvo-8#p100200).



<a id="p100197"></a>

---