--- title: "\"Ветеринарно-санитарный кодекс водных животных (2013)\"" issuer: "Всемирная организация здравоохранения животных" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11" --- # Статья 1.4.11 ### Статья 1.4.11 **Примеры программ надзора** В следующих примерах изложены системы надзора и подходы к анализу полученных доказательств для демонстрации свободы от болезни. Цель данных примеров: - проиллюстрировать ряд подходов, которые могут быть приемлемыми; - обеспечить практическое руководство и образцы, которые могут быть использованы для разработки специальных систем надзора; и - предоставить ссылки на имеющиеся ресурсы, полезные для разработки и анализа систем надзора. Несмотря на то, что в указанных примерах показаны способы, при помощи которых может быть успешно продемонстрирована свобода от болезни, не предполагается, что они являются директивными. Страны могут использовать разные подходы при условии, что они удовлетворяют требованиям настоящей главы. Примеры касаются использования исследований и созданы для иллюстрации различных планов исследований, схем отбора образцов, вычисления размера выборки и анализа результатов. Важно отметить, что альтернативные подходы для демонстрации свободы с использованием источников комплексных данных, не основанных на исследовании, в настоящее время разрабатываются и, возможно, скоро будут опубликованы. [<*>](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p100959) --- <*> Международная EpiLab, Дания, Тема научного исследования 1: Свобода от болезни. www.vetinst.dk/high_uk.asp?page_id=196. 1. Пример 1. - Одноэтапное структурированное обследование (сертификация фермы) a) Обстоятельства Пресноводное аквакультурное производство, выращивающее рыбу в резервуарах, утвердило схему сертификации фермы. Это включает демонстрацию свободы на уровне фермы от определенной (гипотетической) болезни (болезнь X). Болезнь не распространяется очень быстро и наиболее часто наблюдается в зимние месяцы, причем наиболее сильно поражаются взрослые особи в конце производственного цикла. Фермы состоят из ряда резервуаров для выращивания в количестве от 2 до 20, и каждый резервуар вмещает от 1000 до 5000 рыб. b) Цель Цель - осуществление надзора, способного представить доказательства, подтверждающие, что отдельная ферма свободна от болезни X. (Вопросы национальной свободы или свободы зоны в отличие от свободы фермы рассматриваются в следующем примере). c) Подход Схема аккредитации предусматривает ряд стандартных рабочих процедур и требований для объявления свободы исходя из рекомендаций, указанных в настоящей главе. Они предписывают, чтобы фермы проводили исследование, способное с 95% уверенностью показать, что болезнь была бы обнаружена в случае ее наличия. Как только фермы исследованы без обнаружения болезни, они признаются свободными от болезни при условии, что они соблюдают набор минимальных стандартов биобезопасности. Эти стандарты разработаны для предотвращения заноса болезни X на ферму (путем осуществления мер контроля, специальных для указанного метода распространения данной болезни) и для гарантии того, что болезнь будет быстро обнаружена при ее попадании на ферму (основываясь на сведениях записей санитарного учета документации и быстром расследовании необычных случаев болезни). Эффективность применения указанных мер биобезопасности оценивается в ходе ежегодного аудита на ферме, проводимого независимыми аудиторами. d) Стандарты исследования На основе рекомендаций, указанных в настоящей главе, установлен набор стандартов для проведения исследований для демонстрации свободы от инфекции, вызываемой возбудителем болезни X. Данные стандарты включают следующее: i) уровень достоверности, требуемый для данного исследования, составляет 95% (т.е. ошибка I = 5%); ii) мощность исследования произвольно устанавливается на уровне 95% (т.е. ошибка II = 5%, что означает, что существует 5% шанс прийти к заключению, что непораженная болезнью ферма инфицирована); iii) целевой популяцией является вся рыба на ферме. Учитывая паттерны болезни в данной системе производства, в которой поражается только рыба на конечных стадиях выращивания и только зимой, исследуемая популяция определяется рыбой, выращиваемой во время зимних месяцев; iv) рассматривается вопрос кластеризации. Поскольку рыба сгруппирована в резервуарах, это логический уровень, на котором можно рассматривать кластеризацию. Однако когда ферма инфицирована, болезнь часто распространяется в нескольких резервуарах, поэтому мало сведений об устойчивой кластеризации. Также небольшое количество резервуаров на одной ферме означает, что трудно установить заданную превалентность (т.е. долю инфицированных резервуаров, которую должно выявить исследование на ферме) на уровне резервуара. По этим причинам решено рассматривать всю популяцию, выращиваемую на каждой ферме, как одну однородную популяцию; v) рассматривается также вопрос стратификации. Для гарантирования полной репрезентативности решено стратифицировать размер выборки по резервуару, пропорционально популяции каждого резервуара; vi) заданная превалентность на уровне животного определяется исходя из эпидемиологии болезни. Болезнь не распространяется быстро, однако в определенной целевой популяции сообщалось, что в случае инфицирования популяции она поражает как минимум 10% рыбы. Для того чтобы выбрать наиболее консервативный подход, используется произвольно низкая заданная превалентность в 2%. Могла быть использована превалентность в 10% (и это привело бы к намного более меньшему размеру выборки), но компетентные органы не были убеждены в том, что популяция может быть инфицирована, скажем, на уровне 5%, а болезнь тем не менее не обнаружена; vii) используемый тест включает отбор образцов с разрушением образца от рыбы, и в его основе лежит твердофазный иммуноферментный анализ (ELISA) для обнаружения антигена. Болезнь X присутствует в некоторых частях страны (значит, необходима программа аккредитации на уровне фермы). Это дает возможность оценить чувствительность и специфичность ELISA в популяциях сходных с таковыми на фермах. В ходе недавнего исследования (с использованием гистологии и культивирования в качестве золотого стандарта) установлено, что чувствительность ELISA составляет 98% (95% доверительный интервал 96,7 - 99,2%), а специфичность - 99,4% (99,2 - 99,6%). Из-за относительно узких доверительных интервалов было решено использовать точечные оценки чувствительности и специфичности, а не сложные вычисления с учетом неопределенности в данных показателях. e) Размер выборки Размер выборки, необходимый для соответствия целям исследования, вычисляется с учетом размера популяции, эффективности теста, требуемого доверительного уровня и заданной превалентности. Поскольку популяция на каждой ферме относительно большая, то различия в общей численности популяции на каждой ферме оказывают незначительное влияние на рассчитанный размер выборки. Для всех ферм установлены другие параметры для расчета размера выборки. Поэтому рассчитывается стандартный размер выборки (на основе использования данного конкретного ELISA в этой популяции). Расчет размера выборки производится с помощью компьютерной программы FreeCalc. Исходя из описанных выше параметров рассчитано, что требуемый размер выборки составляет 410 рыб на одну ферму. Также согласно расчетам, произведенным программой при указанной недостаточной специфичности, по-прежнему существует возможность того, что при тестировании неинфицированной популяции будут выявлены пять ложноположительных реакций при использовании данного размера выборки во время теста. Органы власти не удовлетворены наличием особей с ложноположительной реакцией, поэтому решено изменить систему тестирования, включив в нее подтверждающий тест для всех особей с положительной реакцией. В качестве наиболее подходящего теста выбрано культивирование, т.к. считается, что специфичность этого теста составляет 100%. Однако его чувствительность составляет только 90% ввиду трудностей выращивания организма. Поскольку теперь используются два теста, необходимо вычислить эффективность данной системы тестов и повторно рассчитать размер выборки, исходя из эффективности системы тестов. При использовании данной комбинации тестов (в которой образец считается положительным, только если он положительный в обоих тестах) специфичность двух объединенных тестов может быть вычислена по формуле: $Sp_{\text{объединенная}} = Sp1 + Sp2 - (Sp1 \times Sp2),$ которая дает объединенную специфичность в 1 + 0,994 - (1 x 0,994) = 100%. Чувствительность можно вычислить по формуле: $Spe_{\text{объединенная}} = Se1 \times Se,$ которая дает объединенную чувствительность в 0,9 x 0,98 = 88,2%. Указанные новые показатели используются для расчета размера выборки для исследования, в результате таких вычислений получаем показатель, равный 169 особям рыб. Следует отметить, что попытки повысить эффективность теста (в данном случае - повышение специфичности) обычно приводят к снижению эффективности другого аспекта в эффективности теста (в данном примере - чувствительности). Однако в данном случае потеря чувствительности более чем компенсируется сниженным размером выборки ввиду повышенной специфичности. Также стоит отметить, что при использовании системы тестирования со 100% специфичностью эффективная мощность исследования будет всегда 100% независимо от чисел, используемых в плане. Причина состоит в том, что невозможно сделать ошибку II и прийти к выводу, что ферма инфицирована, когда она не инфицирована. Целесообразно проверить влияние размера популяции на рассчитанный размер выборки. Расчет размера выборки производился исходя из того, что популяция бесконечно большая. Если размер популяции меньше, то его влияние на размер выборки показано в [таблице](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p100988) ниже: | Размер популяции | Размер образца | | --- | --- | | 1000 | 157 | | 2000 | 163 | | 5000 | 166 | | 10000 | 169 | Исходя из этих расчетов ясно, что рассматриваемые размеры популяции оказывают незначительный эффект на размер выборки. Для упрощения используется стандартный размер образца, равный 169, независимо от количества рыбы, выращиваемой на ферме. f) Отбор образцов Отбор отдельных особей рыбы для включения в образец должен производиться таким образом, чтобы сделать все, чтобы указанный образец был репрезентативным для исследуемой популяции. Более полное описание того, каким образом этого можно достичь в различных обстоятельствах, предоставлено в компьютерной программе Survey Tool Box [<*>](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p101002). Для иллюстрации некоторых аспектов будет использован пример единичной фермы. --- <*> Инструменты для надзора за болезнями водных животных - Практическое руководство и пакет программного обеспечения. Cameron A.R. (2002). Австралийский центр международных научных исследований в сфере сельского хозяйства (ACIAR), Монография N 94, стр. 375 ISBN 1 86320 350 8. Печатная версия доступна на сайте ACIAR (www.aciar.gov.au). Бесплатная электронная версия доступна на www.ausvet.com.au. Одна ферма имеет всего восемь резервуаров, четыре из которых используются для выращивания. Во время исследования (во время зимы) в четырех резервуарах для выращивания находится 1850, 4250, 4270 и 4880 особей рыбы, соответственно, общая численность популяции выращиваемой рыбы составляет 15250 особей. При простом случайном отборе образцов от этой всей популяции, по-видимому, размеры выборки из каждого резервуара будут приблизительно пропорциональными количеству рыбы в каждом резервуаре. Однако пропорциональная стратифицированная выборка будет гарантировать, что каждый резервуар будет представлен пропорционально. В этом случае размер выборки просто делится между резервуарами пропорционально их популяции. В первом резервуаре 1850 рыб из общей численности в 15250, что составляет 12,13%, поэтому из первого резервуара следует отобрать 12,13% выборки (21 рыба). При использовании такого же подхода размер выборки для других резервуаров составит 47, 47 и 54 особи соответственно. После определения размера выборки для каждого резервуара остается проблема: каким образом выбрать 21 особь рыбы из резервуара, содержащего 1850 особей так, чтобы они были репрезентативными для популяции. Существует несколько вариантов: i) если можно производить манипуляции с каждой особью рыбы, то можно использовать случайную систематическую выборку. Например, образцы могут быть отобраны при конечном вылове или время обычных мероприятий по содержанию, включающих манипуляции с рыбой (таких как сортировка или вакцинация). При проведении манипуляций с рыбой систематический отбор образцов просто включает выбор одной особи рыбы через регулярные промежутки времени. Например, для отбора 21 рыбы из 1850 рыб интервал выборки должен составлять 1850 / 21 = 88. Это означает, что в качестве образца должна быть отобрана каждая 88-ая рыба из данного резервуара. Для гарантирования случайности рекомендуется использовать произвольное число от 1 до 88 (в данном случае) при выборе первой особи рыбы (т.е. использовать таблицу случайных чисел), а затем после этой рыбы отбирать каждую 88-ую особь; ii) если манипуляции с отдельными особями рыбы невозможны (наиболее часто встречающееся и более трудное обстоятельство), то тогда для отбора образца рыба должна быть выловлена из резервуара. Вылов рыбы должен производиться наиболее эффективным и практичным способом, который возможен; однако следует предпринять все возможное, чтобы постараться обеспечить репрезентативность образца. В данном примере нормальным методом для вылова рыбы является использование подъемной сети. При использовании подъемной сети удобный способ отбора образцов будет включать вылов 21 особи посредством повторного погружения сети в одном месте и вылова той рыбы, которую легче всего поймать (возможно, более мелкого размера). Использование данного подхода не рекомендуется. Метод, повышающий репрезентативность, - отбор образцов в разных местах резервуара: несколько в одном конце, несколько у боковых сторон, несколько у другого конца, несколько - в середине, несколько у края. Кроме того, если между рыбами есть какие-либо различия, следует попытаться произвести вылов рыбы таким образом, чтобы обеспечить вылов различных групп рыбы (т.е. не стараться вылавливать только маленьких особей, но также включать и крупных особей). Данный метод сбора образцов далек от идеальной случайной выборки, но из-за практических трудностей, которые возникают при осуществлении случайной выборки в виде отдельных особей рыбы, этот подход является приемлемым при условии, что усилия, предпринимаемые для повышения репрезентативности образца, являются естественными и полностью документированы. g) Тестирование Сбор, обработка и тестирование образцов производится в соответствии со стандартизированными процедурами, разработанными в рамках программ по сертификации и спланированными с соблюдением требований Руководства по водным животным. Протокол тестирования указывает, чтобы все образцы, которые при тестировании с помощью ELISA показали положительные результаты, подвергались культивированию, и что любой положительный результат при культивировании показывает, что это истинно положительный образец (т.е. что ферма не свободна от болезни). Важно точно следовать данному протоколу. При выявлении положительной культуры недопустимо повторно тестировать ее, если в исходном протоколе тестирования проведение дальнейшего тестирования не указано и роль такого тестирования не учитывается в вычисленных показателях чувствительности и специфичности (и поэтому в размере выборки) системы тестов. h) Анализ Если используется расчетный размер выборки, равный 169, и не выявлено особей с положительной реакцией, то доверительный уровень исследования будет составлять 95%. Это может быть подтверждено посредством анализа результатов с помощью указанной выше FreeCalc компьютерной программы (которая показывает, что доверительный уровень составляет 95,06%). Иногда может так случиться, что исследование проводится не так точно, как планировалось, и фактический размер выборки меньше, чем целевой размер выборки. Однако размер фермы также может быть меньше. В таких случаях рекомендуется проанализировать данные о фермах, двигаясь от фермы к ферме. Например, если было собрано только 165 образцов на ферме, где содержится 2250 особей, получаемый доверительный уровень по-прежнему будет составлять 95%. Если было собрано 160 образцов, то доверительный уровень составит только 94,5%. Если используется строгая цель - доверительный уровень 95%, то данное исследование не смогло бы достичь поставленной цели и потребовалось бы больше фактических данных. 2. Пример 2 - Двухэтапное структурированное исследование (национальная свобода) a) Обстоятельства Цель страны - объявить себя свободной от болезни Y ракообразных. Основой производства в этой страны являются пруды мелких собственников, сгруппированные близко друг от друга в деревнях или вокруг них. Болезнь - достаточно высоко контагиозная и вызывает массовую смертность с середины и до последних стадий производственного цикла, пораженные животные заболевают и умирают в считанные дни. У пораженных животных наблюдаются некоторые характерные признаки, однако в инфицированном пруду почти всегда будет происходить массовая гибель, если заблаговременно не произвести вылов. Это чаще всего случается поздним летом, но может произойти и в другое время года. Это также иногда происходит на ранних стадиях производственного цикла. В данной стране наблюдается некоторый недостаток лабораторных мощностей и транспортной инфраструктуры. Однако имеется относительно крупная правительственная структура и обширная сеть рыбинспекторов. b) Цель Целью является установление национальной свободы от болезни Y. Система надзора должна соответствовать требованиям настоящей главы, но также необходимо, чтобы она была практически применима в данной производственной системе мелких собственников. c) Подход Органы власти, занимающиеся вопросами аквакультуры, решили использовать исследование для сбора доказательств, подтверждающих свободу, с использованием плана двухэтапного исследования (отбор образцов в деревнях на первом уровне и в прудах на втором уровне). Лабораторное тестирование образцов из большого количества ферм считается практически неосуществимым, поэтому разработана система комбинированных тестов для минимизации потребности в дорогостоящих лабораторных тестах. Единицей наблюдения и анализа в этом случае является пруд, а не отдельное животное. Это означает, что диагностика будет проводиться на уровне пруда (инфицированный пруд и неинфицированный пруд), а не на уровне животного. В связи с этим обследование представляет собой обследование для демонстрации того, что деревни не инфицированы (используется случайная выборка деревень и диагностика проводится на уровне деревни). Тест, используемый для проведения диагностики на уровне деревни, по факту представляет собой еще одно обследование, на этот раз для демонстрации того, что ни один пруд в деревне не поражен. Затем проводится тест на уровне пруда (наблюдения фермерами с последующим дополнительным лабораторным тестированием по необходимости). d) Стандарты исследования i) Доверительный уровень, достигаемый при данном исследовании, составляет 95%. Мощность исследования устанавливается на уровне 95% (но вероятно она фактически составляет 100%, если используемая система тестирования позволяет достичь почти 100% специфичности, как показано в предыдущем [примере](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p100960)). ii) Целевая популяция - все пруды, заселенные креветками в стране в период исследования. Исследуемая популяция - та же самая, за исключением отдаленных районов, доступ в которые невозможен. Вспышки могут происходить в любое время года и на любой стадии производственного цикла, поэтому решено более не уточнять дефиницию популяции, устанавливая конкретное время или возраст. iii) Используются три теста. Первый - наблюдение, осуществляемое фермером, для определения наличия массовой смертности в конкретном пруду. Если результаты в первом тесте пруда положительные (т.е. выявлена массовая смертность), проводится второй тест. Второй тест представляет собой полимеразную цепную реакцию (ПЦР). Случаи, показавшие положительные результаты в ПЦР, подвергаются дальнейшему тестированию с использованием экспериментов по передаче. iv) Наблюдения, осуществляемые фермером, можно рассматривать в качестве теста, равного любому другому тесту. В этом случае наблюдение массовой смертности используется в качестве теста на наличие болезни Y. Поскольку существует множество других болезней, которые могут вызвать массовую смертность, данный тест не является очень специфичным. С другой стороны, достаточно необычно, если болезнь Y присутствует и не приводит к массовой смертности, следовательно, тест достаточно чувствительный. Для массовой смертности установлена стандартная дефиниция случая (например, более чем 20% популяции креветок в пруду во время проведения наблюдения найдены мертвыми в течение менее одной недели). Исходя из данной дефиниции фермеры, могут "диагностировать" массовую смертность в каждом пруду. Некоторые фермеры могут быть слишком впечатлительными и решить, что присутствует массовая смертность, когда лишь небольшая часть креветок найдена мертвыми (ложноположительные результаты, приводящие к снижению специфичности), в то время как небольшая часть других фермеров не может распознать случаи смертности, что снижает чувствительность. Для того чтобы количественно определить чувствительность и специфичность наблюдения фермером массовой смертности как теста на наличие болезни Y, проводится отдельное исследование. Оно включает ретроспективное исследование ряда случаев массовой смертности в популяции, которая считается свободной от болезни, и исследование фермеров, которым показывается серия сценариев смертности с целью оценки их способностей точно определять пруд с массовой смертностью. При объединении указанных результатов определяется, что чувствительность теста на наличие болезни Y в виде случаев массовой смертности, сообщаемых фермерами, составляет 87%, тогда как его специфичность - 68%. v) При обнаружении фермером пруда с массовой смертностью отбираются образцы от умирающих креветок в соответствии с предписанным протоколом. Собираются образцы ткани от 20 креветок и объединяются в пул для тестирования с помощью ПЦР. В лаборатории проведено исследование способности метода ПЦР на пуле выявлять единичное инфицированное животное в пуле из 20 особей, и чувствительность процедуры составляет 98,6%. Такое же исследование отрицательных образцов показало, что иногда бывают положительные результаты, вероятно, из-за загрязнения лаборатории, но это также возможно ввиду присутствия нежизнеспособного генетического материала из другого источника (предположительно - кормов из креветок). Таким образом, специфичность составляет 99%. vi) Опубликованные исследования, проведенные в других странах, показывают, что чувствительность тестов по передаче (необходимо использовать тесты третьего типа) составляет 95% частично из-за вариабельности в количестве возбудителя в инокулированном материале. Согласованная специфичность составляет 100%. vii) Исходя из этих показателей вычисляется чувствительность и специфичность системы объединенных тестов по формуле, указанной в [примере 1](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p100960), сначала для первых двух тестов, а затем для объединенного эффекта первых двух тестов и третьего теста. В результате чувствительность составляет 81,5% и специфичность составляют 100%. viii) Заданная превалентность должна быть вычислена на двух уровнях. Во-первых, определяется заданная превалентность на уровне пруда (доля прудов в деревне, которые будут инфицированы в случае присутствия болезни). В соседних инфицированных странах опыт показал, что пруды, находящиеся в тесном контакте друг с другом, быстро инфицируются. Инфицированная деревня, в которой инфицировано менее 20% прудов, не является обычным наблюдением. Используется заданная превалентность в 5% с запасом. Второе значение для заданной превалентности применяется на уровне деревни или доли инфицированных деревень, которые могут быть выявлены с помощью исследования. Поскольку существует вероятность того, что инфекция может продолжаться в данной местности без быстрого распространения в другие части страны, используется значение, равное 1%. Считается, что это самое малое значение заданной превалентности, для которого практически возможно спланировать исследование. ix) Согласно официальным государственным регистрационным записям популяция в деревнях в стране составляет 65302. Популяция в местах, где есть пруды с креветками, составляет 12890 на основе регистрационных записей органов власти, занимающихся вопросами аквакультуры. Эти данные получают посредством проведения сельскохозяйственной переписи, проводимой один раз в пять лет, и обновляют ежегодно исходя из отчетов рыбинспекторов. Данные о количестве прудов в каждой из этих деревень отсутствуют. e) Размер выборки Размер выборки вычисляется для двух уровней отбора образцов, во-первых, количество деревень, в которых следует произвести отбор образцов, а затем количество прудов, в которых следует отобрать образцы. Количество деревень, в которых следует отобрать образцы, зависит от чувствительности и специфичности теста, используемого для классификации деревень на инфицированные и неинфицированные. Поскольку "тест", используемый в каждой деревне, является в действительности просто еще одним исследованием, чувствительность равна достоверности, а специфичность равна мощности обследования на уровне деревни. Можно откорректировать и доверительный уровень, и мощность, изменяя размер выборки в исследовании деревни (например, количество исследуемых прудов), что означает, что мы можем в определенных пределах определить, какую чувствительность и специфичность мы получаем. Это позволяет использовать гибкий подход к расчету размера выборки. Если желательно, чтобы размер выборки на первой стадии был меньше (маленькое число деревень), необходимо, чтобы чувствительность и специфичность были высокими, что означает, что количество прудов в каждой деревне, которые необходимо исследовать, будет больше. Меньшее количество прудов приведет к более низкой чувствительности и специфичности, что потребует исследования большего количества деревень. Подход к определению оптимальной (наименее затратной) комбинации размеров выборки для первого и второго этапов описан в Survey Toolbox. Еще дополнительно усложняет ситуацию факт, что каждая деревня имеет разное количество прудов. Чтобы добиться одной и той же (или сходной) достоверности и мощности (чувствительность и специфичность) для каждой деревни, возможно, потребуется другой размер выборки. Органы власти предпочитают создать таблицу размеров выборки для разного количества прудов, из которых следует отбирать образцы в каждой деревне, исходя из общего количества прудов в каждой деревне. Ниже представлен пример одного из возможных подходов для определения размера выборки: целевая чувствительность (доверительный уровень), достигаемая при проведении каждого обследования на уровне деревни, составляет 95%. Целевая специфичность составляет 100%. Используя компьютерную программу FreeCalc с заданной превалентностью в 1% (исследование способно обнаружить болезнь, если инфицировано 1% или более деревень), вычисляется размер выборки для первого этапа, который равен 314 деревням. В рамках каждой деревни используемый тест представляет собой систему объединенных тестов, описанную выше, с чувствительностью в 81,5% и специфичностью в 100%. Исходя из этих показателей разработана следующая [таблица](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p101045), в которой указано количество прудов, в которых необходимо произвести отбор образцов, для того чтобы добиться 95% чувствительности. f) Отбор образцов Отбор образцов на первой стадии (выбор деревень) производится с помощью случайных чисел и основы для построения выборки исходя из списка деревень с прудами с креветками, составленного органами по вопросам рыболовства. Деревни перечислены в сводной таблице, причем каждая деревня пронумерована от 1 до 12890. Используется таблица случайных чисел (такая, как включенная в компьютерную программу Survey Toolbox) или компьютерная программа, разработанная для выбора случайных чисел (такая как EpiCalc [<*>](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p101044)). --- <*> http://www.myatt.demon.co.uk/epicalc.htm. | Популяция | Размер выборки | | --- | --- | | 30 | 29 | | 40 | 39 | | 60 | 47 | | 80 | 52 | | 100 | 55 | | 120 | 57 | | 140 | 59 | | 160 | 61 | | 180 | 62 | | 200 | 63 | | 220 | 64 | | 240 | 64 | | 260 | 65 | | 280 | 65 | | 300 | 66 | | 320 | 66 | | 340 | 67 | | 360 | 67 | | 380 | 67 | | 400 | 67 | | 420 | 68 | | 440 | 68 | | 460 | 68 | | 480 | 68 | | 500 | 68 | | 1000 | 70 | Второй этап отбора образцов включает случайный выбор прудов в каждой деревне. Для этого необходима основа для построения выборки или список всех прудов в деревне. Органы власти по вопросам рыболовства используют подготовленных местных рыбинспекторов для координирования исследования. Относительно каждой выбранной деревни инспектор посещает деревню и проводит собрание всех фермеров, занимающихся разведением креветок. На собрании у фермеров выясняют, сколько у них прудов, и составляется список, в котором указываются имена фермеров и количество прудов. Из этого списка посредством простой случайной выборки отбирается соответствующее количество прудов (от 29 до 70, из вышеуказанной [таблицы](https://bukva.ai/docs/veterinarno-sanitarnyy-kodeks-vodnyh-zhivotnyh/statya-1-4-11#p101045), в зависимости от количества прудов в деревне). Это производится либо с использованием компьютерной программы (такой как Survey Toolbox's Random Animal Programme), либо вручную с помощью таблицы случайных чисел или игральных костей с десятичными числами, чтобы выбор числа был случайным. Этот процесс подробно описан в Survey Toolbox. В ходе данного процесса выбора определяется конкретный пруд с точки зрения имени собственника и порядкового номера среди прудов, которыми он владеет (например, третий пруд г-на Смита). Определение пруда производится исходя из системы нумерации прудов, используемой владельцем. g) Тестирование После определения прудов фактическое исследование состоит из "тестирования этих прудов". На практике это включает наблюдение фермерами прудов в течение полного производственного цикла. Местный рыбинспектор посещает каждого фермера еженедельно, чтобы проверить, не наблюдается ли в каком-либо из выбранных прудов массовой смертности. Если таковая наблюдается (т.е. первый тест является положительным), отбираются 20 умирающих креветок для лабораторного исследования (сначала ПЦР, затем, если возможно, эксперименты по передаче). h) Анализ Анализ проводится в два этапа. Сначала проводится анализ результатов, полученных из каждой деревни, чтобы гарантировать, что они соответствуют требуемому доверительному уровню. Если целевой размер выборки достигнут (и получены только отрицательные результаты), доверительный уровень в каждой деревне должен составлять 95% или выше. На втором этапе проводится анализ результатов, полученных из каждой деревни, чтобы получить доверительный уровень для страны. И снова, если достигнут целевой размер выборки (количество деревень), доверительный уровень должен превышать 95%. 3. Пример 3 - Пространственная выборка и использование тестов с недостаточной специфичностью a) Обстоятельства В стране есть отрасль по разведению устриц, причем разведение устриц производится в решетчатых приспособлениях в 23 эстуариях, расположенных вдоль береговой линии. В похожих регионах в других странах болезнь Z вызывает смертность поздним летом/ранней осенью. Во время вспышки поражается большая доля устриц; однако существуют подозрения, что возбудитель может присутствовать при относительно низкой превалентности и в отсутствии вспышек болезни. b) Цель Национальные органы власти желают продемонстрировать национальную свободу от болезни Z. Если болезнь будет обнаружена, вторичной целью исследования является сбор соответствующих сведений, обосновывающих зонирование на уровне эстуария. c) Подход Органы власти приходят к выводу, что клинический надзор с целью выявления вспышек болезни не является соответствующим из-за возможности наличия низкоуровневых субклинических инфекций. В связи с этим решено разработать надзор на основе двухэтапного исследования, в ходе которого отобранные устрицы подвергаются лабораторному тестированию. Первый этап данного исследования - выбор эстуариев. Однако учитывая поставленную цель по предоставлению сведений для проведения зонирования (если болезнь будет выявлена в каком-либо из эстуариев), было решено использовать подход в виде проведения переписи и провести отбор образцов в каждом из эстуариев. По существу это означает, что будет проведено 23 отдельных исследования, по одному в каждом эстуарии. Рассматривается ряд вариантов для отбора устриц в качестве образцов, включая отбор образцов при вылове или при продаже или использование ферм (участков промысла устриц) в качестве уровня выборки или стратификации. Однако период максимальной активности возбудителя не соответствует периоду вылова, а использование ферм исключит значительные количества свободно обитающих устриц, присутствующих в эстуариях, поэтому, было решено попытаться смоделировать простую рандомизированную выборку от всей популяции устриц в эстуарии с использованием подхода в виде пространственной выборки. d) Стандарты исследования i) Целевая популяция - все устрицы в каждом из эстуариев. Исследуемая популяция - устрицы, присутствующие в период максимального риска возникновения болезни: позднее лето - ранняя осень. К болезни восприимчивы свободно обитающие и выращиваемые устрицы, с ними могут быть ассоциированы различные (но неизвестные) риски заражения. Поэтому и те, и другие включены в исследуемую популяцию. Как будет описано ниже, в основе отбора образцов лежит картографирование, поэтому исследуемую популяцию можно точно охарактеризовать как популяцию, которая находится в тех картографированных районах, которые идентифицированы как места обитания устриц. ii) Значение заданной превалентности требуется только на уровне устрицы (поскольку перепись проводится на уровне эстуария). Поскольку во время вспышек болезнь часто выявляют с очень высоким уровнем превалентности, используется низкое значение, чтобы учесть вероятность продолжения существования возбудителя в отсутствие клинических признаков. Выбрано значение, равное 2%. iii) Используемый тест - гистопатология с методами иммунного окрашивания. Известно, что данный тест иногда дает ложноположительные результаты из-за неспецифического окрашивания, но тест очень чувствительный. В опубликованных исследованиях указаны значения 99,1% для чувствительности и 98,2% для специфичности. Но другие практические тесты отсутствуют. Это означает, что невозможно определенно отличить ложноположительные результаты от истинно положительных результатов и что в исследовании любого размера ожидается получение нескольких ложноположительных результатов (т.е. 1,8%). iv) Доверительный уровень установлен равным 95%, мощность - 80%. В предыдущих примерах благодаря предполагаемой 100% специфичности, достигаемой путем использования нескольких тестов, эффективная мощность составляла 100%. В данном случае при недостаточной специфичности существует риск ложного заключения, что здоровый эстуарий инфицирован, поэтому мощность не составляет 100%. Выбор относительно низкого показателя (80%) означает, что в 1 из 5 случаев можно ложно объявить эстуарий инфицированным, когда он не инфицирован, но это также значительно снижает затраты на проведение обследования путем снижения размера выборки. e) Размер выборки Основываясь на предположении, что процедура отбора образцов будет имитировать простую случайную выборку, размер выборки (количество устриц на один эстуарий) можно рассчитать с помощью компьютерной программы FreeCalc. Предполагается, что размер популяции (количество устриц в эстуарии) - очень большой. Размер выборки, рассчитанный с использованием показателей чувствительности, специфичности и заданной превалентности, указанных выше, составляет 450. FreeCalc также сообщает, что исходя из данного размера выборки и специфичности теста, можно получить 10 или меньше ложноположительных результатов в ходе теста и тем не менее прийти к заключению, что популяция свободна от болезни. Причина состоит в том, что если популяция инфицирована на 2% или выше, то прогнозируемое количество особей с положительной реакцией из выборки, равной 450, будет больше, чем 10. Действительно, мы можем ожидать, что будет 9 истинно положительных результатов (450 x 2% x 99,1%) и 8 ложноположительных результатов (450 x 98% x 1,8%) или всего 17 особей с положительными результатами, если популяция инфицирована при превалентности в 2%. Это иллюстрирует, каким образом теория вероятности и соответствующий размер выборки могут помочь отличить между истинно положительными и ложноположительными результатами, когда другой альтернативы, кроме использования теста с недостаточной специфичностью, нет. f) Отбор образцов Цель - произвести отбор образца в 450 устриц, который является репрезентативным для всего эстуария. Простая рандомизированная выборка зависит от создания основы для построения выборки, в котором перечислена каждая устрица (невозможно), а систематическая выборка зависит от способности (как минимум концептуально) уравнять всех устриц (опять невозможно). Органы власти принимают решение использовать пространственную выборку, чтобы приблизиться к простой случайной выборке. Пространственная выборка включает выбор произвольных точек (определенных координатами), а затем отбор устриц возле выбранных точек. Чтобы избежать выбора многих точек, возле которых нет устриц, сначала производится картографирование эстуария (органы власти, занимающиеся вопросами рыболовства и рыбоводства, уже имеют цифровые карты, на которых указаны имеющиеся участки промысла устриц). К этим картам добавляются участки, где наблюдается значительная концентрация свободно обитающих устриц, на основе местной экспертизы. Определяются пары случайных чисел, так чтобы определенная точка находилась в пределах определенных мест обитания устриц. Рассматриваются другие схемы (включая использование каната с отметками, сделанными через равные промежутки проложенного на участке промысла, для того чтобы определить сектор исследования и сбор устриц в местах, расположенных возле каждой отметки на канате), но принят подход в виде случайных координат. Затем каждая точка посещается на лодке (используя прибор GPS (глобальная система определения местоположения) для точного определения месторасположения). Имеется в распоряжении ряд подходов для определения, какую устрицу следует выбрать из густо заселенного участка, но следует предпринять усилия для обеспечения случайности. Персонал, участвующий в исследовании, предпочитает простой подход: когда GPS ресивер показывает прибытие на место, в воздух бросается камень-голыш, и отбор устриц производится возле того места, где он упадет. Если устрицы расположены вертикально (например, свободно обитающие устрицы, растущие отвесно), то для определения глубины, на которой производится отбор устриц, используется систематический подход. Сначала - устрица на поверхности, затем на половине глубины, и третья устрица с максимальной глубины, до которой можно достать с лодки. Данный подход имеет риск смещения в сторону слабозаселенных районов, поэтому для оценки результатов используется показатель относительной плотности устриц на каждом участке, где производится отбор образцов (см. более подробное описание в Survey Toolbox). g) Тестирование Сбор, обработка и анализ образцов производятся в соответствии со стандартизированной процедурой. Результаты классифицируются как определенно положительные (демонстрируют сильное окрашивание в очень характерном паттерне, возможно с ассоциированными признаками повреждения тканей), вероятно положительные (наличие большой вероятности, но менее характерное окрашивание) и отрицательные. h) Анализ Интерпретация результатов при использовании теста с недостаточной специфичностью основывается на допущении, что для того, чтобы прийти к выводу о том, что популяция свободна от инфекции, любой положительный результат в действительности должен быть ложноположительным. При размере выборки, равном 450, можно ожидать получения до 10 ложноположительных результатов и тем не менее прийти к выводу, что популяция свободна от болезни. Однако если имеются обоснованные доказательства того, что имеется всего один истинно положительный результат, то популяция не может считаться свободной. В этом состоит причина классификации положительных результатов на определенно положительные и вероятно положительные. Если имеются какие-либо определенно положительные результаты, популяция в эстуарии должна считаться инфицированной. Вероятно положительные результаты соответствуют ложноположительным, поэтому может допускаться получение до 10 таких результатов. С помощью компьютерной программы FreeCalc можно вычислить достигнутый фактический доверительный уровень исходя из количества обнаруженных (предполагаемых) ложноположительных результатов. Например, если в эстуарии было обнаружено 8 "вероятно положительных" результатов, тогда доверительный уровень исследования составит 98,76%. С другой стороны, если было бы выявлено 15 "вероятно положительных" результатов, тогда доверительный уровень составит только 61,9%, что показывает, что эстуарий, вероятно, инфицирован. i) Обсуждение Обычно можно с уверенностью предположить, что система надзора, имеющая целью продемонстрировать свободу от болезни, является 100% специфичной. Причина заключается в том, что любое подозрение на распространение болезни расследуется до принятия какого-либо определенного решения. Если делается вывод, что данный случай действительно является случаем болезни, тогда не стоит вопрос о провозглашении свободы - установлен факт наличия болезни. Этот пример демонстрирует и другую ситуацию, когда из-за недостатка подходящих тестов система надзора не может быть 100% специфичной. Это было бы необычной ситуацией на практике, но иллюстрирует то, что существуют методы для решения такого вида проблем. На практике вывод о том, что страна (или эстуарий) свободны от инфекции, несмотря на небольшое (но статистически допустимое) количество положительных результатов, должен быть поддержан дополнительными доказательствами (такими как отсутствие клинической болезни). Глава 1.3
**АНАЛИЗ РИСКА ИМПОРТА**