--- title: "\"МУК 4.2.2123-06. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.2123-06" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-2-2123-06" --- ## "МУК 4.2.2123-06. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Методические указания" # "МУК 4.2.2123-06. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 17.08.2006) > [!IMPORTANT] > Документ [введен](#p100002) в действие с 17 августа 2006 года. > Взамен РД 42-28-14-88 "Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм".
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
17 августа 2006 года
#### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. **БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА** **НА ПРИСУТСТВИЕ ПОСТОРОННИХ ВИРУСОВ И МИКОПЛАЗМ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.2.2123-06**
Дата введения:
с момента утверждения
1. Разработаны ФГУН "Государственный научно-исследовательский институт стандартизации и контроля медицинских биологических препаратов им. Л.А. Тарасевича" Роспотребнадзора (Н.В. Шалунова, З.Е. Бердникова, Е.М. Петручук). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол N 2 от 11.07.06). 3. Утверждены и введены в действие Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Г.Г. Онищенко 17 августа 2006 г. 4. Введены взамен: РД 42-28-14-88 "Контроль сыворотки крови крупного рогатого скота на отсутствие вирусов-контаминантов и микоплазм".
**1. ОБЛАСТЬ ПРИМЕНЕНИЯ**
1.1. Методические указания устанавливают методы контроля коммерческой сыворотки крови крупного рогатого скота (далее - сыворотка) на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. Сыворотка широко применяется при культивировании органов и тканей животных, используемых для приготовления профилактических и диагностических иммунобиологических препаратов и в научных исследованиях. Сыворотка является одним из компонентов питательных сред, используемых для культивирования первичных и перевиваемых клеточных культур. 1.2. Методические указания предназначены для специалистов органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, выпускающих и контролирующих медицинские иммунобиологические профилактические препараты. 1.3. Методические указания также могут использоваться организациями, зарегистрированными в Российской Федерации, выпускающими и контролирующими медицинские иммунобиологические профилактические препараты, и специалистами научных лабораторий.
**2. ОБЩИЕ ПОЛОЖЕНИЯ**
Контроль сыворотки на присутствие посторонних вирусов предусматривает использование первично-трипсинизированных и перевиваемых клеточных культур, являющихся высокочувствительными и доступными для выявления наиболее часто встречающихся вирусов-контаминантов. В этих культурах хорошо размножаются с развитием цитопатических изменений вирусы парагриппа, инфекционного ринотрахеита, диареи и аденовирусы. Продолжительность контроля 28 сут. Контроль сыворотки на присутствие микоплазм предусматривает проведение двух методов: 1. Микробиологический метод. Метод основан на выявлении роста микоплазм при внесении испытуемой сыворотки в питательные среды. Продолжительность контроля 21 сут. 2. Метод индикаторной клеточной культуры (цитохимический метод). Метод основан на выявлении ДНК микоплазм, окрашенных флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной клеточной культуре Vero. Продолжительность контроля 3 - 5 сут.
**3. СРЕДСТВА ИЗМЕРЕНИЙ, ВСПОМОГАТЕЛЬНЫЕ УСТРОЙСТВА,**
**ОБОРУДОВАНИЕ, РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ**
3.1. При выполнении контроля должны быть применены следующие средства измерений, оборудование и вспомогательные устройства: весы аптечные от 1 до 20 г, погрешность +/- 20 мг ТУ 64-1-2834-80 колбы стеклянные, конические вместимостью 50 мл, 100 мл ГОСТ 25336-82Е стакан химический вместимостью 1000 мл ГОСТ 25336-82Е пипетки градуированные от 1,0 до 10,0 мл ГОСТ 29227-91 пробирки бактериологические вместимостью от 10,0 до 20,0 мл ГОСТ 25336-82Е стакан химический вместимостью 1000 мл ГОСТ 25336-82Е флаконы для культивирования из нейтрального стекла (матрасы) ГОСТ 5636-70 флаконы вместимостью 100, 500 мл МРТУ 5031-32 мешалка магнитная МРТУ 64-1-1503-67 микроскоп биологический (любой модели) микроскоп люминесцентный серии ЛЮМАМ ножницы медицинские [ГОСТ 21239-93](https://bukva.ai/docs/standart-gost-21239-93) пинцеты анатомические ТУ 64-1-37-78 пробки резиновые ТУ 38.006269-95 стекла предметные ТУ 9464-001-33016370-95 чашки Петри (однократного применения) ТУ 64-2-19-79 воронка стеклянная ГОСТ 25336-82Е камера Горяева ТУ 9443-001-11856833-94 термостат на температуру 37 °С с погрешностью измерения не более +/- 1 °С холодильник с температурой от 4 до 10 °С вместимостью 1000 мл холодильник с температурой минус (20 +/- 4) °С центрифуга ЦЛС-3 МРТУ 42.1778-65 (495). #### 3.2 При выполнении контроля должны быть применены следующие реактивы и материалы: бензилпенициллина натриевая соль ФСП 42-0048-1083-01 стрептомицина сульфат ФС 42-3726-99 версена раствор ФСП 42-0196-3274-02 вода дистиллированная ГОСТ 6709-72 гидролизат сердца крупного рогатого скота дрожжи хлебопекарные прессованные [ГОСТ 171-81](https://bukva.ai/docs/standart-gost-171-81) глицерин, чда ГОСТ 6259-75 масло иммерсионное кедровое (чистое) ТУ 81-05-79-75 мясная вода ТУ 42.14.271-82 натрия гидроокись ГОСТ 4328-77 натрия хлорид ГОСТ 4233-77 раствор Хенкса ФСП 42-0343-3541-02 спирт этиловый ректификованный 96° ГОСТ 18300-87 питательная среда ДМЕМ ФСП 42-0343-3544-02 сыворотка крови крупного рогатого скота, жидкая для культур клеток (предварительно отконтролированная на присутствие посторонних вирусов и микоплазм) ФСП 42-0196-4672-03 тестикулы эмбрионов быка (получают на мясокомбинате, срок хранения не более 1 сут. при температуре от 4 до 10 °С) трипсин (0,25%-й раствор) ФСП 42-0343-3805-03 хлороформ ГОСТ 20015-88 бумага фильтровальная ГОСТ 12026-76 вата медицинская гигроскопическая ТУ 8195-01116673801-99 марля медицинская [ГОСТ 9412-93](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-9412-93), ТУ 9390-0119-34576906-95.
**4. ТРЕБОВАНИЯ БЕЗОПАСНОСТИ**
Работу с микроорганизмами 3 и 4 групп проводят в соответствии с [СП 1.2.731-99](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-4-2) "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами".
**5. УСЛОВИЯ ПРОВЕДЕНИЯ КОНТРОЛЯ**
Подготовительные операции и испытания на присутствие посторонних вирусов и микоплазм проводят в чистых помещениях класса А/В (GMP) с ламинарным потоком воздуха при соблюдении правил асептики при температуре (20 +/- 2) °С и относительной влажности 60 - 70%.
**6. КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ НА ПРИСУТСТВИЕ ПОСТОРОННИХ ВИРУСОВ**
При выполнении контроля используют два вида клеточных культур: первично-трипсинизированные-тестикулы эмбрионов быка (ТБ) 4 - 6-месячного возраста и перевиваемые - почки быка (МДВК) или любые другие перевиваемые клеточные культуры почки крупного рогатого скота, в которые вносят исследуемые сыворотки. Принцип метода основан на появлении цитопатического действия (ЦПД) или гемадсорбции под действием вирусов-контаминантов. #### 6.1 Подготовка к выполнению контроля При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции: 6.1.1. Приготовление первично-трипсинизированной клеточной культуры тестикулов эмбрионов быка (ТБ). 6.1.2. Доставляют тестикулы эмбрионов быков 4 - 6-месячного возраста с перевязанной мошонкой с мясокомбината в любом стерильном сосуде с 250 - 270 мл раствора Хенкса с 500 ед./мл бензилпенициллина калиевой или натриевой соли. 6.1.3. Обжигают кожу мошонки над пламенем горелки и обрабатывают тампоном со спиртом. 6.1.4. Срезают ножницами кожу с кончика мошонки и, подтягивая тестикулы за семенные канатики, извлекают их. 6.1.5. Помещают тестикулы в стерильную чашку Петри и удаляют ножницами белочную оболочку. 6.1.6. Переносят тестикулы в чашку Петри с 30 - 35 мл раствора Хенкса с 100 ед./мл антибиотика. 6.1.7. Разрезают тестикулы вдоль и вылущивают ножницами содержимое в раствор Хенкса. 6.1.8. Промывают ткань тестикулов до просветления жидкости 2 - 3 раза в растворе Хенкса с 500 ед./мл антибиотика. 6.1.9. Помещают ткань тестикулов в колбу вместимостью 500 мл с перемешивающим стержнем, прилагаемым к магнитной мешалке. 6.1.10. Нагревают 0,2%-й раствор трипсина до температуры (20 +/- 2) °С и наливают 100 - 150 мл в колбу. Колбу ставят на магнитную мешалку и включают ее. Скорость вращения перемешивающего стержня должна быть такой, чтобы жидкость не пенилась и стержень не ударялся о стенки колбы. Перемешивание проводят 5 - 6 мин. 6.1.11. Сливают надосадочную жидкость после первого цикла трипсинизации в колбу для отходов. ##### 6.1.12 Проводят 4 - 5 циклов трипсинизации. 6.1.13. Сливают надосадочную жидкость после каждого цикла во флаконы вместимостью 100 мл. 6.1.14. Помещают флаконы в центрифугу и осаждают клетки при скорости 1000 - 1500 об./мин. в течение 10 - 15 мин. 6.1.15. Вынимают флаконы из центрифуги, сливают надосадочную жидкость в сосуд для отходов. 6.1.16. Добавляют в каждый флакон к осадку клеток по 10 - 15 мл среды 0,5%-го гидролизата лактальбумина на растворе Хенкса. 6.1.17. Объединяют полученные суспензии клеток в один флакон и отбирают пипеткой (0,5 +/- 0,01) мл. 6.1.18. Добавляют к 0,5 мл этой суспензии 0,5 мл 0,1%-го раствора метиленового синего и подсчитывают окрашенные клетки в х камере Горяева при увеличении 70 . Для точности результатов подсчет проводят в нескольких пробах. Количество клеток в 1 мл подсчитывают по формуле: а х 1000 х 2 Х = ------------, 0,9 где: Х - концентрация клеток в 1 мл исходной суспензии; а - среднее число клеток в нескольких пробах; 0,9 - объем камеры Горяева в куб. мм; 1000 - число куб. мм в 1 куб. см; 2 - коэффициент разведения суспензии добавленным объемом краски. ##### 6.1.19 Разводят суспензию клеток средой ДМЕМ во флаконе по 5 [п. 6.1.17](#p100094) с таким расчетом, чтобы в 1 мл содержалось 4 - 5 х 10 клеток/мл. 6.1.20. Вносят в каждый из 2 флаконов вместимостью 1000 мл по 100 - 120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки, предварительно отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. #### 6.2 Культивирование и подготовка перевиваемой клеточной
культуры почки быка (МДВК)
6.2.1. Готовят во флаконе вместимостью 100 мл 50 мл смеси, состоящей из равных объемов 0,02%-го раствора версена и 0,25%-го раствора трипсина и нагревают ее до температуры (20 +/- 2) °С. ##### 6.2.2 Просматривают флаконы с МДВК вместимостью 1000 мл под х микроскопом при увеличении 70 и отбирают с полным монослоем клеток. 6.2.3. Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для отходов и добавляют смесь версена и трипсина. 6.2.4. Оставляют клетки в смеси версена и трипсина при температуре (20 +/- 2) °С и наблюдают за ними визуально. 6.2.5. Когда начнется "набухание" и слабое "отслоение" клеток от стекла (обычно через 15 - 20 мин.), сливают смесь версена и трипсина в сосуд для отходов. 6.2.6. Флаконы с клеточной культурой помещают при температуре (37 +/- 1) °С на 30 - 35 мин. 6.2.7. Добавляют во флаконы по 50 мл среды ДМЕМ и встряхивают их так, чтобы все клетки отделились от стекла. ##### 6.2.8 Подсчитывают клетки в камере Горяева, как указано в п. 5.1.18. ##### 6.2.9 Разводят клетки средой ДМЕМ с таким расчетом, чтобы в 1 5 мл содержалось 2 х 10 клеток/мл. 6.2.10. Вносят в каждый из 2 флаконов по 100 - 120 мл разведенной суспензии клеток и добавляют 10% сыворотки, предварительно отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. 6.2.11. Через 5 - 6 сут. просматривают флаконы под световым микроскопом и отбирают с полным монослоем клеток. #### 6.3 Выполнение контроля сыворотки
на присутствие посторонних вирусов
При выполнении контроля сыворотки на присутствие посторонних вирусов должны быть выполнены следующие операции: 6.3.1. Отбирают по 1 флакону с клеточными культурами ТБ и МДВК для проверки испытуемой сыворотки и по 1 флакону с теми же культурами в качестве контрольных. ##### 6.3.2 Сливают питательную среду из флаконов в сосуд для отходов. 6.3.3. Монослой клеток ТБ и МДВК промывают 3 раза средой ДМЕМ без сыворотки. 6.3.4. Вносят пипеткой в каждый из двух флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл испытуемой сыворотки так, чтобы разведение в среде не превышало 1:4 из расчета не менее 3 кв. см площади на 1 мл сыворотки. Одновременно вносят пипеткой в каждый из двух контрольных флаконов вместимостью 1000 мл с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл сыворотки, ранее отконтролированной на присутствие посторонних вирусов и микоплазм. 6.3.5. Инкубируют клеточные культуры ТБ и МДВК при температуре (20 +/- 2) °С (60 +/- 5) мин. 6.3.6. Сливают сыворотку и добавляют в опытные и контрольные флаконы с культурами ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ. Инкубируют при температуре (37 +/- 1) °С 14 сут. 6.3.7. С целью обнаружения цитопатогенного действия (ЦПД) просматривают опытные и контрольные клеточные культуры под микроскопом на 2, 5, 7, 10 и 14 сут. 6.3.8. Если в опытных и контрольных клеточных культурах не будет наблюдаться ЦПД, через 14 сут. их трижды замораживают при температуре минус (20 +/- 2) °С и размораживают при температуре (37 +/- 2) °С. 6.3.9. После размораживания культуры флаконы встряхивают, отбирают из каждого флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК по 25 мл суспензии и вносят во флаконы с клетками того же вида. Два флакона с клеточными культурами ТБ и МДВК оставляют для контроля. 6.3.10. Вносят в опытные и контрольные клеточные культуры ТБ и МДВК по 75 мл среды ДМЕМ. 6.3.11. Клеточные культуры инкубируют при температуре (37 +/- 2) °С в течение 14 сут. Если в течение 14 сут. в опытных и контрольных клеточных культурах не наблюдается ЦПД, их проверяют на наличие гемадсорбирующих вирусов. 6.3.12. Сливают из флаконов питательную среду и промывают культуры 3 раза раствором Хенкса. 6.3.13. Добавляют в опытные и контрольные клеточные культуры по 50 мл 0,25%-й взвеси куриных эритроцитов и эритроцитов морской свинки и инкубируют их при температуре (37 +/- 2) °С. ##### 6.3.14 Через 30 - 35 мин. эритроциты из флаконов удаляют, а монослой промывают раствором Хенкса и просматривают под х микроскопом при увеличении 70 . #### 6.4 Учет результатов 6.4.1. Если в клеточных культурах при первичной инокуляции сыворотки и в пассаже не выявлено ЦПД и не отмечено гемадсорбции, сыворотка признается пригодной. 6.4.2. Если при исследовании наблюдается ЦПД или отмечается гемадсорбция в испытуемых клеточных культурах при отсутствии в контроле, сыворотку бракуют. 6.4.3. Если ЦПД или гемадсорбция появились в контрольных и в опытных клеточных культурах, допускается однократный переконтроль сыворотки.
**7. КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ НА ПРИСУТСТВИЕ МИКОПЛАЗМ**
#### 7.1 Микробиологический метод контроля
сыворотки на присутствие микоплазм
Обнаружение микоплазм микробиологическим методом предусматривает внесение исследуемой сыворотки в бульонную питательную среду, инкубирование в течение 7 сут. и последующий высев на питательную среду, содержащую 0,3% агара. #### 7.2 Чувствительность микробиологического метода Микробиологический метод контроля сыворотки позволяет обнаруживать одну и более колоний микоплазм в объеме не более 100 мл сыворотки. #### 7.3 Приготовление бульонной среды 7.3.1. Для приготовления 1 л среды к 200 мл триптического гидролизата бычьего сердца (содержание сухих веществ 8 - 10%) добавляют 400 мл мясного экстракта 1:2 (содержание сухих веществ 3,0 - 3,5%), экстракт хлебопекарных дрожжей из расчета 1,5 г сухих веществ на 1 л среды и 5,0 г хлорида натрия. 7.3.2. С помощью 10%-го раствора NaOH устанавливают значение рН бульонной среды от 8,0 до 8,2. 7.3.3. Среду нагревают до кипения, кипятят 2 - 3 мин., фильтруют через складчатый бумажный фильтр. 7.3.4. Разливают по 300 - 305 мл во флаконы, закрытые ватно-марлевыми или резиновыми пробками и завальцованные алюминиевыми колпачками, и стерилизуют автоклавированием при температуре 110 °С 30 мин. С помощью 5%-го раствора соляной кислоты устанавливают рН от 7,8 до 8,0. 7.3.5. Для приготовления среды, содержащей 0,3% агара, дополнительно вносят 3,0 г агара. Готовые среды хранят при температуре от 2 до 8 °С не более 4 мес. #### 7.4 Стерильность питательной среды 7.4.1. Для испытания на стерильность отбирают не менее 2% от количества емкостей в серии. Определение проводят путем визуального просмотра каждого флакона с питательной средой после выдерживания в течение 44 - 48 ч при температуре (37 +/- 1) °С и 14 сут. при температуре 20 - 25 °С. 7.4.2. В случае пророста хотя бы в одном флаконе бракуют всю серию. Далее питательная среда не используется. #### 7.5 Определение ростовых свойств среды,
содержащей 0,3% агара
Каждую серию приготовленной среды проверяют на ростовые свойства, используя тест-штамм Mycoplasma arginini G 230 (ОСО 42-28-378-05). Среду считают чувствительной и признают годной, если результаты ее испытания соответствуют Инструкции по применению ОСО 42-28-378-05. #### 7.6 Подготовка сред для контроля 7.6.1. Перед употреблением полужидкую среду, содержащую 0,3% агара, разогревают в водяной бане до полного расплавления агара и охлаждают до температуры 40 - 45 °С. 7.6.2. Добавляют 15 - 20% нормальной сыворотки крови лошади без консерванта, предварительно проверенной на стерильность и присутствие микоплазм, и 100 ед./мл бензилпенициллина натриевой соли. 7.6.3. Разливают по 10 мл в бактериологические пробирки и закрывают ватно-марлевыми пробками. Хранят среду при температуре от 2 до 8 °С не более 7 сут. #### 7.7 Выполнение контроля сыворотки на присутствие
микоплазм микробиологическим методом
При выполнении контроля сыворотки микробиологическим методом должны быть выполнены следующие операции: 7.7.1. Вносят (300 +/- 2) мл бульонной среды во флакон вместимостью 500 мл. Флакон закрывают ватно-марлевой пробкой. 7.7.2. Вносят (100 +/- 2) мл исследуемой сыворотки в (300 +/- 2) мл бульонной среды. Смесь инкубируют 7 сут. при температуре (37 +/- 1) °С и относительной влажности 80 - 90%. 7.7.3. Отбирают 10 пробирок со средой, содержащей 0,3% агара, и вносят в каждую пробирку по (1,0 +/- 0,1) мл смеси исследуемой сыворотки и бульонной среды. Посев проводят прокалыванием всего столбика питательной среды, содержащейся в пробирке, концом пипетки вместимостью 1,0 мл, выпуская равномерно ее содержимое, начиная от дна до поверхности. 7.7.4. Инкубируют посевы 14 сут. при температуре (37 +/- 1) °С и относительной влажности 80 - 90%. #### 7.8 Учет результатов 7.8.1. Учет результатов проводят путем визуального просмотра засеянных пробирок в проходящем свете на 4, 7, 10, 14 сут. 7.8.2. Сыворотка считается свободной от микоплазм, если через 14 сут. не обнаруживают роста микоплазм ни в одной из засеянных пробирок. 7.8.3. В случае получения сомнительных результатов проводят повторный контроль. 7.8.4. При повторном контроле, при наличии роста микоплазм хотя бы в одной пробирке, сыворотка считается контаминированной микоплазмами.
**8. КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ НА ПРИСУТСТВИЕ МИКОПЛАЗМ МЕТОДОМ**
**ИНДИКАТОРНОЙ КЛЕТОЧНОЙ КУЛЬТУРЫ (ЦИТОХИМИЧЕСКИЙ МЕТОД)**
Метод обнаружения микоплазм с использованием индикаторной клеточной культуры Vero основан на внесении испытуемой сыворотки в клеточную культуру и обработку препарата специфическим флюоресцирующим красителем Hoechst-33258, окрашивающим ДНК клеток и микоплазм. Возможно применение другого флюорохрома, аттестованного в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. Клеточную культуру Vero (или другую чувствительную к микоплазмам) получают из банка клеток, аттестованного в соответствии с требованиями ВОЗ в ГИСК им. Л.А. Тарасевича. #### 8.1 Подготовка к выполнению контроля на присутствие
микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
При подготовке к выполнению контроля сыворотки на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры должны быть выполнены следующие операции: приготовление основного и рабочего раствора красителя Hoechst-33258, подготовка люминесцентного микроскопа, подготовка предметных стекол. ##### 8.1.1 Приготовление основного и рабочего
раствора Hoechst-33258
Соблюдая стерильность, 5 мг концентрата Hoechst-33258 растворяют в 100 мл стерильной дистиллированной воды (основной раствор). Для получения рабочего раствора добавляют концентрат красителя в раствор Хенкса без индикатора в соотношении 1:9 и используют для окраски препаратов немедленно. ##### 8.1.2 Подготовка люминесцентного микроскопа Используют для анализа препаратов фильтры: ФС1-4, СС15-2, х х БС8-2. Просматривают препараты при увеличении ок. 10 , об. 90 х х масляная иммерсия, или об. 70 или об. 85 водная иммерсия. ##### 8.1.3 Подготовка предметных стекол Промывают стекла в проточной водопроводной воде в течение 10 - 15 мин. Помещают стекла в сосуд с дистиллированной водой и кипятят 5 - 7 мин. После охлаждения до температуры 20 - 22 °С извлекают стекла с помощью пинцета и помещают в чашку Петри. Протирают каждое стекло стерильной салфеткой и помещают на 1 сут. в смесь Никифорова, состоящую из равных объемов 96° этилового спирта и эфира для наркоза. Извлекают стекла с помощью пинцета из смеси Никифорова и протирают каждое стекло стерильной салфеткой. Стерилизуют стекла (30 +/- 2) мин. при температуре (120 +/- 2) °С. #### 8.2 Выполнение контроля сыворотки на присутствие
микоплазм методом индикаторной клеточной культуры
При проведении испытания на присутствие микоплазм методом индикаторной клеточной культуры выполняют следующие операции: 8.2.1. Вносят 1 мл испытуемого материала в чашку Петри диаметром 90 мм, содержащую стерильное предметное стекло, и 20 - 5 23 мл суспензии клеточной культуры Vero в концентрации 10 кл/мл. ##### 8.2.2 Инкубируют чашку Петри с клеточной культурой Vero в течение 3 - 5 сут. при температуре (37 +/- 1) °С в анаэробных условиях до формирования 50 - 70% монослоя. Образование монослоя х х наблюдают в световом микроскопе при увеличении ок. 10 , об. 20 . 8.2.3. Сливают культуральную жидкость, промывают препарат питательной средой или буфером (рН 7,2 - 7,4). 8.2.4. Помещают предметное стекло на 30 - 35 мин. в 96° этиловый спирт. Сливают спирт и высушивают препарат на воздухе. 8.2.5. Добавляют рабочий раствор красителя Hoechst-33258 и окрашивают в темноте при температуре (37 +/- 1) °С в течение 30 - 35 мин. 8.2.6. Сливают краситель, промывают препарат стерильной дистиллированной водой, подсушивают на воздухе и микроскопируют. #### 8.3 Учет результатов Учет результатов испытания на присутствие микоплазм методом окрашивания ДНК флюорохромом Hoechst-33258 на индикаторной культуре клеток Vero проводят путем просмотра препаратов в люминесцентном микроскопе. Микоплазмы выглядят как однородно окрашенные тела сферической формы, имеющие вид отдельных, парных, цепочечных или нитевидных образований яркого зеленоватого свечения. Диаметр обычно находится в пределах 0,1 - 0,3 микрона. Микоплазмы в виде ярко светящейся зернистости на фоне темной цитоплазмы выявляют по периферии клеток и в межклеточном пространстве. Условно интенсивность контаминации микоплазмами обозначают знаками креста: 1 крест - единичные микоплазмы в препарате; 2 креста - небольшие скопления микоплазм в поле зрения; 3 креста - отдельные микоплазмы и скопления в 20 - 50% клеток; 4 креста - максимальное количество микоплазм в виде скоплений в межклеточном пространстве в каждом поле зрения. В качестве положительных контрольных образцов используют заведомо контаминированные микоплазмами клеточные культуры. Отрицательными контрольными образцами служат клеточные культуры, в которых описанные выше светящиеся образования не выявлены. Обнаружение микоплазм в препаратах на индикаторной клеточной культуре Vero свидетельствует о контаминации испытуемого материала микоплазмами. В случае получения сомнительных результатов следует проводить повторный контроль. Окончательный ответ о присутствии микоплазм в сыворотке будет учитывать результаты двух методов: микробиологического и метода индикаторной клеточной культуры. В случае обнаружения микоплазм хотя бы одним методом сыворотка считается контаминированной и бракуется.
Приложение Таблица 1
**КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА**
**НА ПРИСУТСТВИЕ ПОСТОРОННИХ ВИРУСОВ**
Клеточные культурыРезультаты контроля
ЦПДГемадсорбция
Первично-трипсинизированная клеточная культура ТБне обнаруженоне обнаружено
Перевиваемая клеточная культура МДВКне обнаруженоне обнаружено
Таблица 2
**КОНТРОЛЬ СЫВОРОТКИ КРОВИ КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА**
**НА ПРИСУТСТВИЕ МИКОПЛАЗМ**
| Методы | Результаты контроля | | --- | --- | | Микробиологический (посев на питательные среды) | Отсутствие роста | | Цитохимический | Отсутствие люминесцентного свечения в индикаторной клеточной культуре Vero | ---