--- title: "\"МУК 4.2.2008-05. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.2008-05" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-2-2008-05" --- ## "МУК 4.2.2008-05. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Методические указания" # "МУК 4.2.2008-05. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Пищевые продукты и пищевые добавки. Метод идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (ГМО) растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 17.10.2005) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). > Документ [введен](#p100002) в действие с 17 октября 2005 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
17 октября 2005 года #### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. **БИОЛОГИЧЕСКИЕ И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ.** **ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ И ПИЩЕВЫЕ ДОБАВКИ** **МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ** **ОРГАНИЗМОВ (ГМО) РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ** **ФЕРМЕНТНОГО АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.2.2008-05**
Дата введения:
с момента утверждения 1. Разработаны: ГУ НИИ питания РАМН (В.А. Тутельян - руководитель, Е.Ю. Сорокина, О.Н. Чернышева, Н.А. Кашина); ФГУЗ "Федеральный центр гигиены и эпидемиологии" Роспотребнадзор России (Т.В. Воронцова, Т.Н. Потапова); Инновационная корпорация "Биозащита" (И.В. Панкин). 2. Рекомендован к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека. 3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека Г.Г. Онищенко 17 октября 2005 г. 4. Введены впервые. ### 1. Область применения 1.1. Настоящие методические указания подготовлены для идентификации генно-инженерно-модифицированных организмов (далее - ГМО) растительного происхождения в пищевых продуктах с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе и его последующей обработки на аппаратно-программном комплексе "ДЕГМИГЕН-001". 1.2. Методические указания разработаны в соответствии с Федеральным законом от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения", Законом Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции от 21.12.2004 N 171-ФЗ) "О защите прав потребителей", Постановления Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека", Постановления Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации", Постановления Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании". 1.3. Методические указания предназначены для органов и учреждений Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов, а также других испытательных лабораторий, аккредитованных в порядке, установленном Правительством Российской Федерации. 1.4. Методические указания разработаны для одновременного определения в одном лабораторном испытании пяти различных маркеров рекомбинантной ДНК при проведении скрининга с целью выявления ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах, в том числе в продовольственном сырье. ### 2. Общие положения Методические указания содержат описание метода определения ГМО растительного происхождения в пищевых продуктах с помощью набора реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод основан на идентификации рекомбинантной ДНК с использованием метода асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) и последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных рекомбинантных последовательностей ДНК: трех регуляторных (35 S, nos и ocs) и двух селективных (gus, nptII). Идентификация этих последовательностей позволяет проводить предварительную проверку пищевых продуктов на наличие ГМО растительного происхождения. -12 Чувствительность метода - не менее 10 г (1пг) ДНК. ### 3. Аппаратура, материалы, лабораторная посуда, реактивы #### 3.1 Аппаратура и инструменты. 3.1.1. Амплификатор ДНК типа "Терцик-мс-2" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с ТУ 9642-001-4648062-98. 3.1.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа биологических микрочипов типа "ДЕГМИГЕН-001" ТУ 9443-001-02699501-2003. 3.1.3. Компьютерная программа "Аrrа" для анализа изображений, полученных с помощью комплекса "ДЕГМИГЕН-001". 3.1.4. Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами ТУ 4320-002-71321417-2004 [(Приложение 1 А).](#p100165) 3.1.5. Термостат суховоздушный типа ТВ3-25 с рабочей температурой 42 °С, рабочий диапазон от 20 °С до 60 °С, точность поддержания температуры +/- 1 °С ТУ 42-61961. 3.1.6. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104-01 2-го класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г. 3.1.7. Термостат типа "TERMO 24-15" под пробирки типа Эппендорф вместимостью 0,5 и 1,5 мл, диапазон температур от 15 до 120 °С, количество гнезд - не менее 20 каждого типа, точность поддержания температуры - 0,2 °С, разность температур между соседними ячейками - не более 0,5. 3.1.8. Камера морозильная по ГОСТ 26678-85, обеспечивающая температуру минус 20 °С. ##### 3.1.9 Холодильник бытовой по ГОСТ 26678-85. ##### 3.1.10 Микроцентрифуга настольная типа Эппендорф с частотой -1 вращения не менее 13000 мин. ##### 3.1.11 Аппарат для встряхивания типа "Вортекс", скорость -1 вращения 250 - 3000 мин. . 3.1.12. Дистиллятор, обеспечивающий качество дистиллированной воды по ГОСТ 6709-72. 3.1.13. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5% - 10,0%, воспроизводимость 3% - 7%); 0,5 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм, точность +/- 2,0% - 5,0%, воспроизводимость 2,5% - 5%); 20,0 - 200,0 куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5% - 2,0%, воспроизводимость 2% - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм, точность +/- 1,0% - 1,5%, воспроизводимость 1% - 2%); 2000 - 10000 куб. мм (шаг - 10 куб. мм, воспроизводимость 1% - 2%). 3.1.14. Облучатель бактерицидный настенный ОБН-150 ТУ 16-535-84 или других видов. Примечание: Допускается использование другой аппаратуры и инструментов с аналогичными техническими характеристиками, разрешенных для применения в установленном порядке. #### 3.2 Лабораторная посуда и материалы. 3.2.1. Бумага фильтровальная лабораторная ГОСТ 12026-76. 3.2.2. Воронки стеклянные ГОСТ 25336-82. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические вместимостью 25, 50, 100, 200, 1000 куб. см, [ГОСТ 12738-77](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-12738-77). ##### 3.2.3 Чашки Петри по ГОСТ 25336-82. 3.2.4. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные вместимостью 25, 100, 1000 куб. см, ГОСТ 1770-74. 3.2.5. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5; 1,5 куб. см. 3.2.6. Наконечники с фильтром для дозаторов с переменным объемом дозирования до 10; 20; 200; 1000; 10000 куб. мм. #### 3.3 Реактивы и реагенты. ##### 3.3.1 Додецилсульфат натрия (SDS). ##### 3.3.2 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328-77. 3.3.3. Этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), х.ч. ТУ 6-09-11-1721-83. 3.3.4. Альбумин бычий сывороточный сухой (БСА). Корпорация "Сигма Алдрич" (Sigma), кат. N В 4287. ##### 3.3.5 Спирт этиловый ректификованный [ГОСТ Р 51652-00](https://bukva.ai/docs/gost-r-51652-2000). ##### 3.3.6 Вода дистиллированная ГОСТ 6709-72. ##### 3.3.7 Вода деионизованная ОСТ 11.029.003-80. 3.3.8. 3%-ный раствор пероксида водорода. Примечание: Допускается использование других реактивов с аналогичными техническими характеристиками; препараты импортного производства должны иметь международный сертификат качества ИСО 9000 или EN 29000. 3.3.9. Набор реагентов для выявления и идентификации ГМО растительного происхождения на биологическом микрочипе состоит из набора для выделения ДНК, набора для проведения амПЦР и набора для ДНК гибридизации и ферментного анализа. Наборы рассчитаны на сто реакций. 3.3.10. Набор реагентов для пробоподготовки (бисер - 30 г, лизирующий реагент - 60 куб. см (2 флакона), сорбент - 2 куб. см (2 пробирки), солевой буфер (10-кратный) - 10 куб. см, экстракционный раствор - 10 куб. см) ТУ 2643-003-71321417-2004. Порядок приготовления рабочего раствора солевого буфера описан в [4.1.](#p100073) Остальные реагенты готовы к использованию. 3.3.11. Набор реагентов для амПЦР ТУ 2643-003-71321417-2004 (включает в себя: сухие смеси реагентов (100 пробирок, каждая пробирка содержит Taq ДНК полимеразу, дезоксинуклеозидтрифосфаты и хлорид магния с конечными концентрациями, соответственно, 1 ед., 200 мкМ и 2,5 мМ, а также оптимизированную буферную систему для проведения одной стандартной ПЦР); растворитель; минеральное масло; "+" контроль амплификации - 1 пробирка, 0,5 куб. см, праймеры на 35S-промотор вируса мозаики цветной капусты: - 35S_п 5' CGG СТА СТС CAA GAA TAT CAA AGA TAC AGT ТТС AGA AGA (39 н.о.); - 35S_o* 5' CCA TTT TCC TTT TTT ATT GTC CTT TCG ATG AAG TGA CAG A (40 н.о.); праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli: - gus_ 5' АСС GTA ССТ CGC АТТ АСС СТТ ACG CTG AAG AGA (33 н.о.); - gus_o* 5' TGC CCG СТТ CGA AAC CAA TGC СТА AAG AGA (30 н.о.); праймеры на терминатор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: - nos_п 5' GGA CAA GCC GTT TTA CGT TTG GAA CTG АСА GA (32 н.о.); - nos_o* 5' GCC TGA CGT ATG TGC TTA GCT CAT TAA ACT CCA GA (35 н.о.); праймеры на маркерный ген nptII из транспозона Тn5 бактериального происхождения: - npt_п 5' GTG АСС CAT GGC GAT GCC TGC TTG С (25 н.о.); - npt_o* 5' АСС CAG CCG GCC АСА GTC GAT GAA TCC AGA (30 н.о.); праймеры на промотор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: - ocs_п 5' AAA AAG TGG CAG AAC CGG TCA AAC СТА ААА GA (32 н.о.); - ocs_o* 5' CGT TAT TAG TTC GCC GCT CGG TGT GTC GTA GA (32 н.о.). Праймеры расфасованы в 10 пробирках по 0,5 куб. см. Примечание: 35S_п; gus_п; nos_п; nptII_п; ocs_п - обозначают прямые праймеры; 35S_o*; gus_o*; nos_o; nptII_o*; ocs_o* - обозначают обратные праймеры, меченные биотином; н.о. - нуклеотидные остатки. 3.3.12. Набор реагентов для ДНК гибридизации и ферментного анализа ТУ 2643-003-71321417-2004: 20xSSC - 50 куб. см; диаминобензидин (ДАБ) - 100 таблеток; конъюгат пероксидазы хрена со стрептавидином - 0,1 куб. см с концентрацией 1 мг/куб. см, 1 пробирка. Примечание: Срок годности набора реагентов - 12 месяцев со дня изготовления. Основную часть реагентов, упакованную в картонную коробку, хранят в сухом темном месте при температуре от +2 °С до +8 °С. В отдельных пластиковых пакетах при температуре -20 °С хранят праймеры, положительный контроль и конъюгат стрептавидин-пероксидазы. ### 4. Подготовка к анализу. Приготовление растворов #### 4.1 Приготовление 0,5 М ЭДТА (рН 8,0). В мерной колбе на 100 куб. см растворить 18,62 г этилендиаминтетрауксусной кислоты (молекулярный вес 372,2) в 80 куб. см дистиллированной воды. Раствором 30%-ной гидроокиси довести рН раствора до 8,0, дистиллированной водой - объем раствора до метки, перемешать. Хранить в колбе с притертой пробкой при комнатной температуре до года. #### 4.2 Приготовление 10%-ного раствора SDS. Растворить 10 г SDS в 90 куб. см дистиллированной воды. Хранить при комнатной температуре не более 1 года. #### 4.3 Приготовление рабочего раствора солевого буфера. Содержимое флакона с 10-кратным солевым буфером (10 куб. см) (из набора реагентов) перенести из флакона в цилиндр, довести бидистиллированной водой до отметки 100 куб. см и 96%-ным этиловым спиртом - до отметки 300 куб. см и перемешать. Рабочий раствор солевого буфера следует хранить в герметично закрытой посуде при температуре 4 °С. ### 5. Отбор и подготовка проб пищевых продуктов для анализа Отбор проб проводят по государственным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп пищевой продукции: [ГОСТ 5904-82](https://bukva.ai/docs/gost-5904-82), [9163-90](https://bukva.ai/docs/gost-9163-90), [12292-00](https://bukva.ai/docs/gost-12292-2000), 10852-86, [12430-66](https://bukva.ai/docs/gost-12430-66), 13979-86, [26313-84](https://bukva.ai/docs/standart-gost-26313-84), 22617.0-77, 27668-88, 26312-84, 9792-73, [7631-85](https://bukva.ai/docs/gost-7631-85), [12036-85](https://bukva.ai/docs/gost-12036-85), 51447-99, 135869.3-86, 13440-89, 17109-88, [19341-73](https://bukva.ai/docs/gost-19341-73), [26809-86](https://bukva.ai/docs/gost-26809-86), 27668-88, [27853-88](https://bukva.ai/docs/gost-27853-88), [28741-90](https://bukva.ai/docs/gost-28741-90), 29142-91, [13634-90](https://bukva.ai/docs/gost-13634-90), [15877-70](https://bukva.ai/docs/gost-15877-70), 17110-71, 17109-88, [ГОСТ Р 50436-92](https://bukva.ai/docs/gost-r-50436-92), [50437-92](https://bukva.ai/docs/gost-r-50437-92), [51926-02](https://bukva.ai/docs/gost-r-51926-2002), [ГОСТ Р ИСО 2170-97](https://bukva.ai/docs/gost-iso-2170-97). ### 6. Проведение анализа. Выделение ДНК 6.1. В одноразовые центрифужные пробирки типа eppendorf на 1,5 куб. см внести 300 мг бисера и 70 - 80 мг анализируемого материала. Добавить 0,5 мл 5 мМ Na2-cоль ЭДТА и термостатировать при 65 °С в течение 30 - 60 мин. Время инкубации составляет 30 минут для процессированных продуктов (мука, чипсы, детское питание и др.) и до 60 мин. для зерна. Через каждые 10 - 15 минут гомогенизировать пробу срезанным наконечником (для каждой пробы использовать индивидуальный наконечник). 6.2. К содержимому пробирки добавить 400 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до максимально однородного состояния. Пробу термостатировать при 65 °С 60 - 120 мин. 6.3. После термостатирования пробу, при необходимости, еще раз гомогенизировать, добавить 500 куб. мм бидистиллированной воды и перемешать на вортексе. 6.4. Центрифугировать пробу 1 мин. при 5000 g (12000 об./мин.). Прозрачный супернатант перенести в чистую пробирку. 6.5. Добавить 20 куб. мм сорбента из набора реагентов (перед использованием сорбент следует интенсивно встряхнуть на вортексе). Пробирку поместить на ротатор и перемешивать на вортексе 10 минут (10 - 20 об./мин.). #### 6.6 Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g. 6.7. Осторожно, не задевая осадка, удалить супернатант. К осадку добавить 200 куб. мм лизирующего реагента из набора реагентов и перемешать на вортексе до однородного состояния. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g. 6.8. Удалить супернатант. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого буфера из набора реагентов, перемешать содержимое пробирки переворачиванием 5 - 10 раз. Центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g. #### 6.9 Удалить супернатант не задевая осадка. 6.10. К осадку добавить 1 куб. см рабочего раствора солевого буфера, перемешать на вортексе, центрифугировать пробу 10 секунд при 5000 g и осторожно удалить супернатант. #### 6.11 Повторить предыдущий пункт еще раз. #### 6.12 Подсушить осадок при 65 °С в течение 4 - 5 минут. 6.13. К осадку добавить 50 куб. мм экстракционного раствора из набора реагентов. Отбор раствора из исходного флакона проводить при постоянном помешивании, не допуская выпадения в осадок гранул ионообменной смолы. 6.14. Суспендировать содержимое пробирки на вортексе 5 - 10 секунд до гомогенного состояния, затем термостатировать 10 минут при 65 °С. 6.15. Еще раз суспендировать пробу на вортексе, центрифугировать 1 мин. при 5000 g. 6.16. Супернатант, содержащий очищенную ДНК, перенести в чистую пробирку и хранить при -20 °С до проведения ПЦР анализа. При отборе раствора ДНК необходимо избегать захвата осадка, содержащего сорбент. Примечание: Кроме описанного выше сорбционного метода выделения ДНК, возможно использование метода выделения с помощью СТАВ (гексадецилтриметиламмониум бромид), описанного в методических указаниях по определению генетически модифицированных источников в продуктах питания растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции [(МУК 4.2.1902-04](https://bukva.ai/docs/muk-4-2-1902-04) "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции"). ### 7. Амплификация 7.1. Перед проведением реакции вынуть из холодильника необходимое количество микропробирок с сухими реагентами из набора реагентов. Промаркировать соответствующим образом: "-" контроль", "исследуемые пробы", "+" контроль". #### 7.2 Добавить во все пробирки по 5 куб. мм праймеров. #### 7.3 Добавить во все пробирки по 10 куб. мм растворителя. 7.4. В пробирку, которая служит отрицательным контролем, добавить 5 куб. мм бидистиллированной воды. В опытные пробирки добавить по 5 куб. мм исследуемой ДНК. В пробирку с положительным контролем добавить 5 куб. мм раствора контрольной ДНК. 7.5. Добавить во все пробирки по 20 куб. мм минерального масла (масло не используется в случае, если амплификатор имеет термостатируемую крышку). 7.6. Подготовленные для проведения реакции пробирки перенести в термоблок программируемого термостата и запустить программу амплификации в соответствии с режимами, приведенными в таблице 1. Таблица 1 **ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ АМПЦР**
Шаг программыТемпература °СВремя инкубации, сек.Количество циклов
1.941801
2.943042
3.62,530
4.721801
Примечание: Для пипетирования жидкостей без примесей рекомбинантной ДНК (праймеры, растворитель, вода) необходимо иметь отдельный комплект микродозаторов, не используемых при пробоподготовке или работах с ДНК-содержащими препаратами. При подготовке смесей для проведения амПЦР каждую пробирку открывают только перед отбором или внесением проб, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микропробирок с пробами и оставлять их открытыми на длительное время. 7.7. После завершения реакции микропробирки необходимо передать в помещение, в котором будет проводиться гибридизация. Отбор пробы для гибридизации проводится из-под слоя минерального масла, в случае его использования. 7.8. Подготовка проб для амПЦР и их гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе в одном помещении не допускается. Реакционные смеси после амплификации содержат в высоких концентрациях фрагменты ДНК, контаминация которыми помещений, оборудования и реактивов может привести к получению ложноположительных результатов. ### 8. Проведение ДНК гибридизации 8.1. Приготовить рабочие разведения раствора 20xSSC (3 М NaCl, 0,3 М цитрат натрия, рН 7,4): 2xSSC, 0,l% SDS; 0,lxSSC; 0,lxSSC, 0,1% SDS; 0,01xSSC. Для приготовления 100 куб. см раствора можно воспользоваться таблицей 2. Таблица 2 **ПРИГОТОВЛЕНИЕ РАБОЧИХ РАСТВОРОВ SSC** | Раствор | 20хSSC | 10%-ный SDS | Н О дист. 2 | | --- | --- | --- | --- | | 2xSSC, 0,1% SDS | 10 куб. см | 1 куб. см | 89 куб. см | | 0,1хSSC | 0,5 куб. см | - | 99,5 куб. см | | 0,1xSSC, 0,1% SDS | 0,5 куб. см | 1 куб. см | 98,5 куб. см | | 0,01хSSC | 0,05 куб. см | - | 99,95 куб. см | 8.2. Микропробирки с продуктами амплификации ДНК центрифугировать 1 - 2 секунды для сбора пробы на дне пробирки и держать далее только в вертикальном положении. Добавить в каждую микропробирку 5 куб. мм 20хSSC и 0,2 куб. мм 10% SDS, перемешать и центрифугировать 1 - 2 секунды. Распределить полученную смесь по поверхности микрочипа, содержащей зоны иммобилизованных олигонуклеотидов. 8.3. Поместить микрочип во влажную камеру (например, в чашку Петри со смоченным дистиллированной водой бумажным фильтром) и поставить на 1 час в воздушный термостат с температурой 42 °С. 8.4. По окончании реакции капли смыть буфером 2хSSC, 0,1% SDS и затем тщательно промыть чип следующими растворами: - 2xSSC, 0,l% SDS - 1 раз 5 минут; - 0,1хSSC, 0,1% SDS - 2 раза по 5 минут; - 0,1хSSC - 5 раз по 1 минуте; - 0,01хSSC в течение 10 секунд. ### 9. Проведение ферментного анализа 9.1. Исходный стрептавидин-пероксидазный конъюгат разбавить в 200 раз буфером 1хSSC, содержащим 1% BSA (бычий сывороточный альбумин), из расчета 25 куб. мм на микрочип. Например, необходимо проанализировать 5 микрочипов. Для этого потребуется 25 х 5 = 125 куб. мм раствора конъюгата. Готовят с небольшим избытком, 150 куб. мм раствора. Для этого 1,5 мг BSA растворяют в 150 куб. мм 1хSSC, а затем добавляют 0,75 куб. мм исходного конъюгата. 9.2. Нанести 25 - 30 куб. мм разведенного конъюгата на рабочую зону микрочипа и поместить его на 30 минут во влажную камеру при комнатной температуре. #### 9.3 Смыть конъюгат раствором 1хSSC. #### 9.4 Залить микрочип раствором 2xSSC и промыть 5 минут. #### 9.5 Промыть микрочип раствором 1хSSC. 9.6. Непосредственно перед применением приготовить раствор субстрата - диаминобензидина (ДАБ). Для этого растворить таблетку ДАБ в 1 куб. см буфера 0,1хSSC, добавить 30 куб. мм 3%-ного раствора пероксида водорода и перемешать. Раствор использовать немедленно. 9.7. Залить рабочую зону микрочипа раствором субстрата и выдержать от 2 до 10 минут при комнатной температуре. В случае положительной реакции появляются коричневые пятна окисленного субстрата. 9.8. Промыть микрочип дистиллированной водой, встряхнуть капли воды и поместить в термостат 42 °С на 5 - 10 минут. После сушки микрочип с окрашенными зонами необходимо хранить в темном месте. ### 10. Сканирование биологических микрочипов 10.1. В соответствии с руководством по эксплуатации, поставляемым в комплекте с аппаратно-программным комплексом "ДЕГМИГЕН-001", подготовить сканер микрочипов к работе. 10.2. Поместить микрочип в рамку для сканирования, зафиксировать его и закрыть рамку. 10.3. Запустить программу сканирования, функционирующую в диалоговом режиме, дождаться появления на мониторе приглашения к сканированию и только после этого вставить рамку с микрочипом в приемное окно детектора. 10.4. После завершения сканирования микрочипа необходимо сохранить изображение [(Приложение 1 Б),](#p100167) присвоив файлу соответствующее имя. 10.5. Для завершения работы с программой сканирования следует нажать в диалоговом окне клавишу "ВЫХОД". ### 11. Анализ изображений биочипов #### 11.1 Запустить программу обработки изображения микрочипа "Аrrа". 11.2. Ввести оцифрованное изображение в программу, для этого нужно выбрать опцию меню "Файл", и затем открыть изображение. В появившемся диалоговом окне выбрать формат, в котором представлены изображения, и выбрать в списке нужный файл, после чего изображение появится в основном окне программы. 11.3. Провести операцию разметки матрицы, чтобы совместить центры измерительных зондов с центрами пятен решетки в изображении, для этого выбрать опцию меню "Анализ" и затем - "Разметка матрицы". Разметка начинается с рисования прямоугольника, боковые стороны которого проходят через центры узлов крайних столбцов. Для этого нужно щелкнуть левой кнопкой мыши в центре левого верхнего пятна/ячейки. Затем, держа кнопку нажатой, переместить правую нижнюю вершину появившегося прямоугольника в центр нижнего правого узла. 11.4. В результате предварительной разметки на экране появится четырехугольник с внутренними линиями, расположенными равномерно, в соответствии с заданным числом столбцов матрицы. 11.5. Чтобы завершить разметку и закрыть диалоговое окно, нужно нажать клавишу "Принять". 11.6. После завершения базовой разметки проводят автоматическую коррекцию положения зондов. Для этого в меню выбирается опция "Настройки/Автоматическая подстройка". 11.7. Для анализа результатов нужно выбрать опцию меню "Анализ" - "Показать результаты". 11.8. По окончании измерений программа предоставляет возможность подготовки и распечатки протокола испытаний [(Приложение 2).](#p100172) Для этого нужно выбрать опцию меню "Файл" и затем - "Заполнить протокол". После этого появится окно с формой для заполнения. После того как она будет заполнена, нажать кнопку "Выход". ### 12. Интерпретация результатов 12.1. Появление регистрируемого компьютерной программой Аrrа оптического сигнала в одной, нескольких или во всех пяти зонах гибридизации, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на присутствие рекомбинантной ДНК, свидетельствующей о наличии ГМО растительного происхождения в анализируемом образце (пробе). 12.2. Отсутствие регистрируемого оптического сигнала во всех пяти гибридизационных зонах, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, указывает на не содержание рекомбинантной ДНК, что свидетельствует о том, что анализируемый образец (проба) не имеет ГМО растительного происхождения. 12.3. Появление оптического сигнала в зоне гибридизации при использовании отрицательного контроля амплификации, свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором 1 H соляной кислоты, заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. 12.4. Отсутствие оптического сигнала при использовании положительного контроля амплификации свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР и/или гибридизации с применением ферментного анализа на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. ### 13. Организация рабочих мест Организация рабочих мест для проведения исследований, описанных в настоящих методических указаниях, проводится в соответствии с [МУК 4.2.1902-04](https://bukva.ai/docs/muk-4-2-1902-04) "Определение генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения методом полимеразной цепной реакции". Приложение 1
*ПРИМЕР* ГИБРИДИЗАЦИОННОЙ КАРТИНЫ ПРОДУКТОВ АМПЦР
**НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ** А ```text ┌─────────────────────────────────────────────────┬──────────────┐ │ 35S gus nos nрtII ocs │ М.П. │ │ │ │ │ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ └────┘ └────┘ └────┘ └────┘ └────┘ │ │ │ ┌────┐ ┌────┐ │ │ │ │K(-)│ │K(-)│ │ │ │ └────┘ └────┘ │ │ │ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ │ │ │ │K(+)│ │K(+)│ │K(+)│ │K(+)│ │K(+)│ │ │ │ └────┘ └────┘ └────┘ └────┘ └────┘ │ │ │ │ │ └─────────────────────────────────────────────────┴──────────────┘ Б ┌─────────────────────────────────────────────────┬──────────────┐ │ 35S gus nos nрtII ocs │ М.П. │ │ │ │ │ ┌────┐ ┌────┐ │ │ │ ОП │ │ │ │ │ │ │ └────┘ └────┘ │ │ │ │ │ │ К- │ │ │ │ │ │ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ ┌────┐ │ │ │ К+ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ │ └────┘ └────┘ └────┘ └────┘ └────┘ │ │ │ │ │ └─────────────────────────────────────────────────┴──────────────┘ ``` А - схема негелевого биологического микрочипа для идентификации ГМИ растительного происхождения; Б - гибридизационная картина на экране компьютера, полученная в результате анализа генетически модифицированной сои, содержащей промотор 35S и терминатор nos. Приложение 2
**ФОРМА ПРОТОКОЛА ИСПЫТАНИЙ ПО ИДЕНТИФИКАЦИИ**
**ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ (ГМО)**
**РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ ФЕРМЕНТНОГО**
**АНАЛИЗА НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ** ПРОТОКОЛ ИСПЫТАНИЙ Серия АБ N 0000000 N _________ от "__" __________ 200_ г. Продукция ____________________________________________________ Производитель сырья или продукции ____________________________ Предъявитель сырья или продукции _____________________________ Отбор проб произведен в соответствии с нормативным документом на соответствующую группу сырья или продукции ________________ Акт отбора проб и техническое задание на испытания N __ от ___ Испытания проведены на основании требований Номер образца ________________________________________________ Характеристика испытуемого образца (маркировка, вид и состояние упаковки, этикетки, штрих-кода) в образцах N ____ отсутствует, а в образце N ____ присутствует Маркировка: __________________________________________________ Годен до ________________ Штриховой код ______________________ Результаты испытаний
Номер образцаТрансгенные последовательности
35SgusnosnptIIocs
Результаты анализа ___________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ ______________________________________________________________ Исполнители: _____________________ _____________________ (подпись) (подпись) _____________________ _____________________ (подпись) (подпись) Руководитель испытательной лаборатории _______________________ (подпись) М.П. _______________________ (Фамилия, инициалы) Заключение распространяется на образец, представленный на испытания. ## НОРМАТИВНЫЕ ССЫЛКИ 1. Федеральный закон от 30.03.1999 N 52-ФЗ (в редакции от 09.05.2005 N 45-ФЗ) "О санитарно-эпидемиологическом благополучии населения". 2. Закон Российской Федерации от 07.02.1992 N 2300-1 (в редакции от 21.12.2004 N 171) "О защите прав потребителей". 3. Постановление Правительства Российской Федерации от 24.07.2000 N 554 (в редакции от 15.09.2005 N 569) "Об утверждении Положения о государственном санитарно-эпидемиологическом нормировании". 4. Постановление Правительства Российской Федерации от 15.09.2005 N 569 "О Положении об осуществлении государственного санитарно-эпидемиологического надзора в Российской Федерации". 5. Постановление Правительства Российской Федерации от 30.06.2004 N 322 "Об утверждении Положения о Федеральной службе по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека". 6. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 08.11.2000 N 14 "О порядке проведения санитарно-эпидемиологической экспертизы пищевой продукции, полученной из генетически модифицированных источников". 7. Постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 31.12.2004 N 13 "Об усилении надзора за пищевыми продуктами, полученными из ГМИ". 8. СанПиН 2.3.2.1078-01 "Продовольственное сырье и пищевые продукты. Гигиенические требования безопасности и пищевой ценности пищевых продуктов". 9. [ГОСТ 5904-82с](https://bukva.ai/docs/gost-5904-82) "Изделия кондитерские. Правила приемки, методы отбора и подготовки проб". 10. [ГОСТ 9163-90](https://bukva.ai/docs/gost-9163-90) "Консервы мясные и мясорастительные "Сосиски". Технические условия". 11. [ГОСТ 12292-2000](https://bukva.ai/docs/gost-12292-2000) "Консервы рыбные с растительными гарнирами. Технические условия". 12. ГОСТ 10852-86 "Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб". 13. [ГОСТ 12430-66](https://bukva.ai/docs/gost-12430-66) "Продукция сельскохозяйственная. Методы отбора проб при карантинном досмотре и экспертизе". 14. [ГОСТ 26313-84](https://bukva.ai/docs/standart-gost-26313-84) "Продукты переработки плодов и овощей. Правила приемки, методы отбора проб". 15. [ГОСТ 22617.0-77](https://bukva.ai/docs/standart-gost-22617-0-77) "Семена сахарной свеклы. Правила приемки и методы отбора проб". 16. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб". 17. ГОСТ 26312.1-84 "Крупа. Правила приемки и методы отбора проб". 18. ГОСТ 9792-73 "Колбасные изделия и продукты из свинины, баранины, говядины и мяса других видов убойных животных и птиц. Правила приемки и методы отбора проб". 19. [ГОСТ 7631-85](https://bukva.ai/docs/gost-7631-85) "Рыба, морские млекопитающие, морские беспозвоночные и продукты их переработки. Правила приемки, органолептические методы оценки качества, методы отбора проб для лабораторных испытаний". 20. [ГОСТ 12036-85](https://bukva.ai/docs/gost-12036-85) "Семена сельскохозяйственных культур. Правила приемки и методы отбора проб". 21. ГОСТ Р 51447-99 "Мясо и мясные продукты. Методы отбора проб". 22. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках". 23. [ГОСТ 19341-73](https://bukva.ai/docs/gost-19341-73) "Консервы рыбные. Печень рыб с растительными добавками. Технические условия". 24. [ГОСТ 26809-86](https://bukva.ai/docs/gost-26809-86) "Молоко и молочные продукты. Правила приемки, методы отбора и подготовка проб к анализу". 25. ГОСТ 27668-88 "Мука и отруби. Приемка и методы отбора проб". 26. [ГОСТ 27853-88](https://bukva.ai/docs/gost-27853-88) "Овощи соленые и квашеные, плоды и ягоды моченые. Приемка, отбор проб". 27. [ГОСТ 28741-90](https://bukva.ai/docs/gost-28741-90) "Продукты питания из картофеля. Приемка, подготовка проб и методы испытаний". 28. ГОСТ 29142-91 "Семена масличных культур. Отбор проб". 29. [ГОСТ 13634-90](https://bukva.ai/docs/gost-13634-90) "Кукуруза. Требования при заготовках и поставках". 30. [ГОСТ 15877-70](https://bukva.ai/docs/gost-15877-70) "Кукуруза сахарная консервированная. Технические условия". 31. ГОСТ 17110-71 "Соя (промышленное сырье). Требования при поставках. Технические условия". 32. ГОСТ 17109-88 "Соя. Требования при заготовках и поставках".
33. [ГОСТ Р 50436-92](https://bukva.ai/docs/gost-r-50436-92) "Зерновые. Отбор проб зерна".
34. [ГОСТ Р 50437-92](https://bukva.ai/docs/gost-r-50437-92) "Бобовые культуры в мешках. Отбор проб".
35. [ГОСТ Р 51926-2002](https://bukva.ai/docs/gost-r-51926-2002) "Консервы. Икра овощная. Технические условия".
36. [ГОСТ ИСО 2170-97](https://bukva.ai/docs/gost-iso-2170-97) "Зерновые и бобовые. Отбор проб молотых продуктов".
---