--- title: "\"МУК 4.2.1903-04. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.1903-04" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-2-1903-04" --- ## "МУК 4.2.1903-04. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа. Методические указания" # "МУК 4.2.1903-04. 4.2. Методы контроля. Биологические и микробиологические факторы. Продукты пищевые. Метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с применением биологического микрочипа. Методические указания" (утв. Минздравом России 06.03.2004) > [!IMPORTANT] > Документ [введен](#p100002) в действие с 6 марта 2004 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
6 марта 2004 года #### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. БИОЛОГИЧЕСКИЕ **И МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ** **ПРОДУКТЫ ПИЩЕВЫЕ. МЕТОД ИДЕНТИФИКАЦИИ** **ГЕНЕТИЧЕСКИ МОДИФИЦИРОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ (ГМИ) РАСТИТЕЛЬНОГО** **ПРОИСХОЖДЕНИЯ С ПРИМЕНЕНИЕМ БИОЛОГИЧЕСКОГО МИКРОЧИПА** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.2.1903-04**
Дата введения
с момента утверждения 1. Разработаны: Институтом физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН и Институтом молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта РАН. 2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 06.03.04. 3. Введены впервые. ### 1. Область применения Настоящие Методические указания распространяются на пищевое сырье (в т.ч. посевной и посадочный материал), пищевые продукты, цветы (далее - продукт) и устанавливает метод идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения с использованием биологического микрочипа. Метод основан на асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции (далее - амПЦР) с последующей гибридизацией продуктов этой амПЦР на биологическом микрочипе. Метод одновременно устанавливает наличие или отсутствие в анализируемой пробе не менее пяти различных трансгенных последовательностей ДНК. -12 Чувствительность метода - не менее 10 г (1 пг) ДНК. Методические указания предназначены для применения в лабораториях учреждений санитарно-эпидемиологической службы Российской Федерации, осуществляющей контроль за качеством продовольственного сырья и пищевых продуктов, в т.ч. импортируемых в Российскую Федерацию, гигиеническую оценку и выдачу санитарно-эпидемиологических заключений, в лабораториях других организаций, аккредитованных в установленном порядке на право проведения контроля безопасности пищевой продукции и продовольственного сырья. ### 2. Нормативные ссылки В настоящих Методических указаниях использованы ссылки на следующие стандарты: ГОСТ 12.1.004-91. Система стандартов безопасности труда. Пожарная безопасность. Общие требования ГОСТ 12.1.007-76. Система стандартов безопасности труда. Вредные вещества. Классификация и общие требования безопасности ГОСТ 12.1.019-79. Система стандартов безопасности труда. Электробезопасность. Общие требования и номенклатура видов защиты ГОСТ 12.4.009-83. Система стандартов безопасности труда. Пожарная техника для защиты объектов. Основные виды. Размещение и обслуживание ГОСТ 12.4.021-75. Система стандартов безопасности труда. Системы вентиляционные. Общие требования ГОСТ 1770-74. Посуда мерная лабораторная стеклянная. Цилиндры, мензурки, колбы, пробирки. Общие технические условия ГОСТ 3118-77. Кислота соляная. Технические условия [ГОСТ 3164-78](https://bukva.ai/docs/gost-3164-78). Масло вазелиновое медицинское. Технические условия ГОСТ 4233-77. Натрий хлористый. Технические условия ГОСТ 4328-77. Натрия гидроокись. Технические условия ГОСТ 6709-72. Вода дистиллированная. Технические условия [ГОСТ 9284-75](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-9284-75). Стекла предметные для микропрепаратов. Технические условия ГОСТ 9805-84. Спирт изопропиловый. Технические условия ГОСТ 12026-76. Бумага фильтровальная лабораторная. Технические условия [ГОСТ 12738-77](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-12738-77). Колбы стеклянные с градуированной горловиной. Технические условия ГОСТ 13646-68. Термометры стеклянные ртутные для точных измерений. Технические условия ГОСТ 21400-75. Стекло химико-лабораторное. Технические требования. Методы испытаний ГОСТ 24104-01. Весы лабораторные. Общие технические требования ГОСТ 25336-82. Посуда и оборудование лабораторные стеклянные. Типы, основные параметры и размеры ГОСТ 26678-85. Холодильники и морозильники бытовые электрические компрессионные параметрического ряда. Общие технические условия ГОСТ 29227-91 (ИСО 835-1-81). Посуда лабораторная стеклянная. Пипетки градуированные. Ч. 1. Общие требования [ГОСТ Р 51652-00](https://bukva.ai/docs/gost-r-51652-2000). Спирт этиловый ректификованный из пищевого сырья. Технические условия. ### 3. Определения В настоящих Методических указаниях применяют следующие термины с соответствующими определениями: #### 3.1 Биологическая безопасность - в соответствии с [Прилож. А.](#p100179) 3.2. Генетически модифицированные источники: сырье и пищевые продукты (компоненты), используемые человеком в натуральном или переработанном виде, полученные из генетически модифицированных организмов или содержащие их в своем составе. 3.3. Генетически модифицированный организм: организм, генетический материал которого изменен с применением методов генной инженерии. 3.4. Генная инженерия: совокупность приемов, методов и технологий, в т.ч. технологий получения рекомбинантных нуклеиновых кислот, по выделению генов из организма, осуществлению манипуляций с генами и введению их в другие организмы. 3.5. Биологический микрочип: микроматрица с ячейками, в которых иммобилизован набор олигонуклеотидов. 3.6. Праймер: последовательность однотяжевой ДНК длиной до 25 нуклеотидов, применяемая для проведения асимметричной мультиплексной полимеразной цепной реакции. 3.7. Асимметричная мультиплексная полимеразная цепная реакция: полимеразная цепная реакция, где в одной пробирке с участием нескольких пар праймеров одновременно амплифицируются разные последовательности анализируемой ДНК, причем количество одного из праймеров каждой пары в несколько раз превышает количество другого праймера. ### 4. Аппаратура, материалы и реактивы #### 4.1 Компьютерная программа "Imageware" для анализа изображений, полученных с помощью "Чипдетектора-03" [[1].](#p100183) 4.2. Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов типа "Чипдетектор-03" [[2].](#p100184) 4.3. Амплификатор ДНК типа "Терцик" под микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2, 0,5 куб. см со скоростью нагрева/охлаждения активного элемента не менее 1,5 °С/с [[3].](#p100185) 4.4. Термостат суховоздушный типа ТВЗ-25 с рабочей температурой 37 °С, рабочий диапазон от 20 до 60 °С, точность поддержания температуры +/- 1 °С [[4].](#p100186) 4.5. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТ 24104 высокого класса точности с пределом допускаемой абсолютной погрешности однократного взвешивания не более +/- 0,0001 г. 4.6. Камера морозильная по ГОСТ 26678, обеспечивающая температуру минус 20 °С. 4.7. Холодильник бытовой электрический по ГОСТ 26678. #### 4.8 Микроцентрифуга настольная типа 5415С с частотой вращения -1 не менее 13000 мин. [[5].](#p100187) #### 4.9 Мешалка магнитная с подогревом [[6].](#p100188) 4.10. Аппарат для встряхивания типа CV-1500 с частотой -1 вращения не менее 1500 мин. [[7].](#p100189) 4.11. рН-метр с набором электродов, с погрешностью измерений +/- 0,1 рН. 4.12. Микродозаторы с переменным объемом дозирования: 0,5 - 10,0 куб. мм (шаг - 0,1 куб. мм, точность +/- 2,5 - 10,0%, воспроизводимость 3 - 7%); 5,0 - 50,0 куб. мм (шаг - 0,5 куб. мм, точность +/- 2,0 - 5,0%, воспроизводимость 2,5 - 5%); 20,0 - 200,0 куб. мм (шаг - 1,0 куб. мм, точность +/- 1,5 - 2,0%, воспроизводимость 2 - 3%); 100 - 1000 куб. мм (шаг - 5 куб. мм, точность +/- 1,0 - 1,5%, воспроизводимость 1 - 2%). #### 4.13 Штативы под микроцентрифужные пробирки типа RP-30 и RP-80 на 30 и 80 шт. [[8].](#p100190) 4.14. Наконечники с фильтром для микродозаторов (микропипеток) с переменным объемом дозирования жидкостей до 10; 20; 200; 1000 куб. мм [[9].](#p100191) 4.15. Пробирки микроцентрифужные типа Эппендорф вместимостью 0,2; 0,5 и 1,5 куб. см стерильные. 4.16. Пестик или палочка стеклянные по ГОСТ 21400 для микроцентрифужных пробирок вместимостью 1,5 куб. см. 4.17. Цилиндры стеклянные мерные лабораторные по ГОСТ 1770 на 25, 100, 250 и 1000 куб. см. 4.18. Колбы стеклянные мерные плоскодонные конические по ГОСТ 25336 вместимостью 50 - 1000 куб. см. #### 4.19 Пипетки стеклянные градуированные по ГОСТ 29227. 4.20. Бумага фильтровальная лабораторная по ГОСТ 12026. #### 4.21 Натрия гидроокись по ГОСТ 4328. 4.22. Кислота соляная концентрированная по ГОСТ 3118, хч. #### 4.23 Натрий хлористый по ГОСТ 4233, хч. #### 4.24 Этилендиаминтетрауксусной кислоты динатриевая соль дигидрат (ЭДТА) [[10].](#p100192) #### 4.25 Трис(оксиметил)аминометан [[11].](#p100193) #### 4.26 Спирт этиловый ректификованный по [ГОСТ Р 51652](https://bukva.ai/docs/gost-r-51652-2000), хч. #### 4.27 Спирт изопропиловый по ГОСТ 9805, хч. #### 4.28 Додецилсульфат натрия (SDS) [[12].](#p100194) #### 4.29 Вода дистиллированная по ГОСТ 6709. 4.30. Вода особо чистая стерильная, не содержащая ДНК, РНК и дезоксирибонуклеаз. #### 4.31 Фермент термостабильный Taq-полимераза, оптимум активности при 70 - 72 °С [[13].](#p100195) 4.32. ПЦР буфер десятикратный (10х; 12,1 г в 1 куб. дм Трис-НСl, рН 8,8; 37,28 г в 1 куб. дм КСl, 5% Твин-20, 50% формамид; 142,83 мг в 1 куб. дм MgCl2. #### 4.33 Гуанидин тиоцианат [[14].](#p100196) #### 4.34 М-[2-оксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновая кислота] (HEPES) [[15].](#p100197) #### 4.35 Масло вазелиновое медицинское по [ГОСТ 3164](https://bukva.ai/docs/gost-3164-78). 4.36. Раствор водный дезоксирибонуклеозидтрифосфатов: дАТФ, дГТФ, дТТФ, дЦТФ с концентрацией 2 мМ каждого [[16].](#p100198) #### 4.37 Раствор заведомо трансгенной ДНК (около 100 нг/куб. мм 6 или 10 копий/куб. мм) [[17].](#p100199) #### 4.38 Раствор заведомо нетрансгенной ДНК (около 100 нг/куб. 6 мм или 10 копий/куб. мм) [[18].](#p100200) #### 4.39 Баня водяная [[19].](#p100201) #### 4.40 Раствор водный праймеров "ПР-1" для амплификации соответствующих участков генома, включающий следующие пары праймеров: праймеры на промотор 35S вируса мозаики цветной капусты: 35S_п 5' ССТ ССТ CGG ATT CCA TTG ССС AG (23 н.о.) 35S_оф 5' GTC CAT СТТ TGG GAC САС ТGТ CGG (24 н.о.); праймеры на маркерный ген gus из бактерии Escherichia coli: gus_п 5' AAG CCG GGC AAT TGC ТGТ GCC А (22 н.о.) gus_оф 5' GAC CGC АТС GAA ACG CAG САС G (22 н.о.); праймеры на промотор nos из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: nos_п 5' CGA TGA CGC GGG АСА AGC CGT (21 н.о.) nos_оф 5' GAC СТТ AGG CGA CTT TTG AAC GCG С (25 н.о.); праймеры на маркерный ген npt II из транспозона Tn5 бактериального происхождения: npt_п 5' GTG ТТС CGG CTG TCA GCG CAG G (22 н.о.) npt_оф 5' CGC AAG GAA CGC CCG TCG TGG (21 н.о.); праймеры на терминатор ocs из агробактерии Agrobacterium tumefaciens: ocs_п 5' GCG AGA CGC СТА TGA TCG CAT GAT (24 н.о.) ocs_оф 5' GAA ACC GGC GGT AAG GAT CTG AGC (24 н.о.). Примечание. В обозначениях праймеров индекс "_п" означает "прямой", индекс "_оф" означает "обратный флуоресцентномеченый"; н.о. - нуклеотидные остатки [[20].](#p100202) #### 4.41 Биологический микрочип с иммобилизованными олигонуклеотидами, приведенными в табл. 1 [[21].](#p100203)
Таблица 1
**ОЛИГОНУКЛЕОТИДЫ, ИММОБИЛИЗОВАННЫЕ НА БИОЛОГИЧЕСКОМ МИКРОЧИПЕ**
Наименование олигонуклеотидаДетектируемая мишеньПоследовательность олигонуклеотида
35S_ипромотор 35S5' GCC АТС ATT GCG ATA AAG G
gus_иген gus5' CTG GTA TCA GCG CGA A
nos_ипромотор nos5' GCT AAG CAC ATA CGT CAG AA
npt_иген npt II5' GGC AGC GCG GCT АТС
ocs_итерминатор ocs5' ТТС ТGТ ТGТ GСА СGТ ТGТ А
Примечание. Индекс "_и" означает "иммобилизованный".
Биологический микрочип представляет собой стандартное предметное стекло по [ГОСТ 9284](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-9284-75) для световой микроскопии, на поверхности которого в определенном порядке расположены 10 микроскопических ячеек [(рис. 1),](#p100102) заполненных полиакриламидным гелем. Каждая из пяти верхних ячеек содержит индивидуальный ковалентно иммобилизованный олигонуклеотид (35S, gus, nos, npt или ocs). Три ячейки с индексом "НК" не содержат ранее перечисленных индивидуальных ковалентно иммобилизованных олигонуклеотидов и выполняют роль отрицательного контроля гибридизации. Две ячейки с индексом "М" содержат ковалентно связанный флуоресцентный краситель и предназначены для однозначной ориентации биологического микрочипа. Поверхность биологического микрочипа с ячейками должна быть закрыта пластиковой крышкой с отверстиями, которая вместе с предметным стеклом образует замкнутое пространство, предназначенное для проведения гибридизации анализируемой пробы. ```text ┌─────────────────────────────────────────┐ │ ──┼──── 1 │ ┌───────┐ │ │ │ 35S_и ├───┼───┐ │ └───────┘ │ │ │ │ │ │ ┌───────┐ ┌───────┐ │ │ ┌───┼────────────────┤ gus_и │ │ nos_и ├───┼───┤ │ │ └───────┘ └───────┘ │ │ │ │ │ │ │ │ ┌───────┐ ┌───────┐ │ │ ├───┼────────────────┤ npt_и │ │ osc_и ├───┼───┤ 2 ─┤ │ └───────┘ └───────┘ │ ├─ 2 ├───┼────────────────────┐ │ │ │ │ ┌───────┐ ┌───┴───┐ ┌───────┐ │ │ ├───┼───┤ НК │ │ НК │ │ НК ├───┼───┤ │ │ └───────┘ └───────┘ └───────┘ │ │ │ │ │ │ │ │ ┌───────┐ ┌───────┐ │ │ └───┼───┤ М │ │ М ├───┼───┘ │ └───────┘ └───────┘ │ │ │ └─────────────────────────────────────────┘ ``` 1 - предметное стекло 2 - гелевые ячейки
Рисунок 1. Схема биологического микрочипа
для идентификации генетически модифицированных источников
растительного происхождения
Допускается применение других средств измерений с метрологическими характеристиками, а также оборудования и реактивов с техническими характеристиками не хуже указанных выше. ### 5. Отбор проб Отбор проб проводят по межгосударственным и национальным стандартам, устанавливающим порядок отбора проб для однородных групп растительного сырья (в т.ч. посевного материала, цветов) и пищевых продуктов. ### 6. Подготовка к проведению анализа #### 6.1 Приготовление растворов ##### 6.1.1 Приготовление раствора NaOH концентрации 40 г/куб. дм. В стеклянную плоскодонную колбу по ГОСТ 1770 вместимостью 100 куб. см помещают 4,0 г сухой гидроокиси натрия по ГОСТ 4328 и растворяют в 100 куб. см особо чистой стерильной воды по [4.30.](#p100076) После охлаждения раствора до комнатной температуры его переливают в специальную щелочеустойчивую пластиковую плотно закрывающуюся емкость. Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года. ##### 6.1.2 Приготовление раствора ЭДТА концентрации 186,12 г/куб. дм. В стеклянную плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 18,61 г ЭДТА по [4.24,](#p100070) растворяют в 80 куб. см особо чистой стерильной воды при интенсивном перемешивании на магнитной мешалке [[6].](#p100188) Затем раствором гидроокиси натрия по [6.1.1](#p100108) доводят рН раствора до 8,0. Полученный раствор переливают в мерную колбу по [ГОСТ 12738](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-12738-77) вместимостью 100 куб. см и особо чистой стерильной водой доводят объем этого раствора до метки. Срок хранения в холодильнике по ГОСТ 26678 при температуре 4 - 5 °С - не более 6 мес. ##### 6.1.3 Приготовление 70%-го раствора этилового спирта. В мерную колбу вместимостью 200 куб. см по [ГОСТ 12738](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-12738-77) вносят 140 куб. см 96%-ного этилового спирта высокой степени очистки по [ГОСТ Р 51652](https://bukva.ai/docs/gost-r-51652-2000), добавляют 52 куб. см особо чистой стерильной воды и перемешивают. Срок хранения при температуре 4 - 5 °С - не более 6 мес. ##### 6.1.4 Приготовление гибридизационного буфера. В стеклянный стакан или плоскодонную колбу вместимостью 300 - 500 куб. см помещают точно отмеренные количества: 44,33 (+/- 0,01) г гуанидин тиоцианата - по [4.33](#p100079) [[14],](#p100196) 4,88 (+/- 0,01) г N-[2-гидроксиэтил]пиперазин-N'-[2-этансульфоновой кислоты] натриевой соли (HEPES) по [4.34](#p100080) [[15].](#p100197) Затем стеклянной пипеткой по ГОСТ 29227 вместимостью 5 куб. см приливают 3,75 (+/- 0,05) куб. см раствора ЭДТА, приготовленного по [6.1.2,](#p100110) и цилиндром вместимостью 250 куб. см добавляют 200 куб. см особо чистой стерильной воды. Стакан с раствором помещают на магнитную мешалку по [4.9](#p100055) [[6]](#p100188) и перемешивают до полного растворения компонентов. Доводят значение рН буфера до 7,5 (+/- 0,1) добавлением раствора гидроокиси натрия, приготовленного по [6.1.1.](#p100108) Полученный раствор из стакана переносят в мерную колбу вместимостью 250 куб. см, доводят объем до метки особо чистой стерильной водой и разливают по 50 куб. см в плоскодонные колбы с притертыми пробками. Срок хранения при температуре 2 - 8 °С - не более 12 мес. ##### 6.1.5 Приготовление раствора Трис-HCl концентрации 242,2 г/куб. дм. В колбу вместимостью 100 куб. см помещают 24,22 г Трис (оксиметил) аминометана по [4.25](#p100071) [[11]](#p100193) и растворяют приблизительно в 80 куб. см особо чистой стерильной воды. Концентрированной соляной кислотой по ГОСТ 3118 доводят рН раствора до 7,5, а объем - до 100 куб. см особо чистой стерильной водой. Срок хранения при комнатной температуре - не более 6 мес. ##### 6.1.6 Приготовление раствора NaCl концентрации 146,2 г/куб. дм. В плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 14,62 г хлористого натрия по ГОСТ 4233, растворяют в 70 - 80 куб. см особо чистой стерильной воды, затем полученный раствор переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и особо чистой стерильной водой доводят до метки. Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года. ##### 6.1.7 Приготовление раствора 20%-ного додецилсульфата натрия (SDS) [[12].](#p100194) В стеклянную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 20 г сухого додецилсульфата натрия по [4.27](#p100073) и добавляют 80 куб. см особо чистой стерильной воды. Растворяют при плавном перемешивании на магнитной мешалке и одновременном нагревании до температуры 40 - 50 °С до полного растворения. Срок хранения при комнатной температуре - не более одного года. ##### 6.1.8 Приготовление буфера экстракции. В мерной колбе вместимостью 50 куб. см смешивают 5 куб. см раствора Трис-HCl, приготовленного по [6.1.5,](#p100116) 5 куб. см раствора NaCl, приготовленного по [6.1.6,](#p100118) 1,25 куб. см раствора 20%-ного SDS, приготовленного по [6.1.7,](#p100120) и 2,5 куб. см раствора ЭДТА, приготовленного по [6.1.2;](#p100110) каждый раствор отбирают отдельной стеклянной пипеткой. Объем раствора доводят до 50 куб. см особо чистой стерильной водой. Срок хранения при температуре 4 - 5 °С - не более двух недель, в морозильной камере по ГОСТ 26678 при температуре минус 20 °С - не более одного года. 6.1.9. Раствор Taq-полимеразы по [4.31](#p100077) хранят при температуре минус 20 °С не более одного года. Не допускается хранение раствора Taq-полимеразы ниже температуры минус 23 °С. #### 6.2 Приготовление пробы для анализа (выделение ДНК) 6.2.1. Две навески каждого анализируемого продукта массой 60 - 80 мг помещают в две чистые стерильные микроцентрифужные пробирки по [4.15](#p100061) вместимостью 1,5 куб. см, в течение 15 - 20 с доводят до состояния однородной смеси пестиком по ГОСТ 21400 при комнатной температуре и сразу микродозатором добавляют по 400 куб. мм буфера экстракции, приготовленного по [6.1.8.](#p100122) 6.2.2. Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.1, интенсивно встряхивают в течение 5 с на аппарате для встряхивания по [4.10](#p100056) [[7],](#p100189) быстро нагревают на водяной бане [[19]](#p100201) до температуры 65 °С и выдерживают при этой температуре 15 - 20 мин., периодически осторожно перемешивая содержимое. ##### 6.2.3 Микроцентрифужные пробирки со смесью, приготовленной по 6.2.2, центрифугируют при комнатной температуре в настольной -1 центрифуге по [4.8](#p100054) [[5]](#p100187) при частоте вращения 13000 мин. в течение 5 мин. ##### 6.2.4 Надосадочную жидкость, полученную по 6.2.3, отбирают по 300 куб. мм и переносят в чистые микроцентрифужные пробирки, содержащие по 300 куб. мм изопропилового спирта по ГОСТ 9805. Содержимое перемешивают, выдерживают 5 мин. при комнатной температуре и центрифугируют 5 мин. при частоте вращения 13000 -1 мин. . 6.2.5. Надосадочную жидкость по 6.2.4 тщательно удаляют микродозатором, а осадок ДНК, полученный по [6.2.4,](#p100129) промывают 1 куб. см 70%-ного этилового спирта, приготовленного по [6.1.3](#p100112) и охлажденного до температуры 0 - 4 °С, центрифугируют аналогично 6.2.4. Полученную надосадочную жидкость вновь тщательно удаляют, а осадок ДНК подсушивают при комнатной температуре до полного удаления этилового спирта, но не более 30 мин. 6.2.6. Осадок ДНК, полученный по 6.2.5, перерастворяют в 40 - 50 куб. мм особо чистой стерильной воды. Полученный раствор ДНК используют для проведения амПЦР. Срок хранения раствора ДНК при температуре минус 20 °С - не более одного года. #### 6.3 Подготовка асимметричной мультиплексной ПЦР ##### 6.3.1 Приготовление реакционной смеси для амПЦР <*>. --- <*> Реакционную смесь для амПЦР готовят непосредственно перед анализом при температуре не выше 20 °С. 6.3.1.1. В микроцентрифужную пробирку вместимостью 1,5 куб. см микродозатором вносят (из расчета на каждую анализируемую пробу): 3 куб. мм 10х буфера реакционного для ПЦР по [4.32;](#p100078) 3 куб. мм смеси дезоксирибонуклеозидтрифосфатов по [4.36](#p100082) [[16],](#p100198) 2,5 куб. мм фермента Taq-полимеразы по [4.31](#p100077) [[13]](#p100195) (концентрацией 5 ед. акт./куб. мм) <*>, а также водный раствор праймеров по [4.40](#p100086) [[20]](#p100202) в следующих концентрациях (нг/куб. дм): 35S_п/35S_оф - 15,32/81,02; gus_п/gus_оф - 3,75/37,59; nos_п/nos_оф - 3,61/84,74; npt_п/npt_оф - 7,51/36,01; ocs_п/ocs_оф - 8,18/41,41. --- <*> Срок хранения Taq-полимеразы после разведения при температуре от 2 до 8 °С - не более 2 ч. Смесь разбавляют особо чистой стерильной водой до объема 27 куб. мм (из расчета на одну анализируемую пробу) и осторожно перемешивают в течение 3 - 5 с на аппарате для встряхивания, не допуская образования пены. Общий объем реакционной смеси для амПЦР готовят с учетом числа анализируемых проб и двух контрольных проб: положительный контроль (заведомо трансгенная ДНК по [4.37)](#p100083) и отрицательный контроль (заведомо нетрансгенная ДНК по [4.38).](#p100084) ###### 6.3.1.2 Реакционную смесь для амПЦР, полученную по [6.3.1.1,](#p100136) осаждают кратковременным (10 - 15 с) центрифугированием на -1 настольной центрифуге при частоте вращения 1500 - 3000 мин. и сразу же используют для проведения анализа. 6.3.2. Все этапы амПЦР должен проводить квалифицированный, специально обученный персонал в соответствии с требованиями [[22].](#p100204) Для проведения амПЦР допускается использовать только стерильную лабораторную посуду и новые стерильные микроцентрифужные пробирки. При проведении амПЦР каждую микроцентрифужную пробирку открывают только перед отбором или внесением анализируемой пробы, а по окончании манипуляции сразу же закрывают. Запрещается открывать одновременно несколько микроцентрифужных пробирок с анализируемыми пробами и оставлять их открытыми длительное время. Каждую анализируемую пробу отбирают микродозатором с новым стерильным наконечником с фильтром. ### 7. Проведение анализа #### 7.1 Проведение асимметричной мультиплексной ПЦР 7.1.1. Реакционную смесь для амПЦР, полученную по [6.3.1.2,](#p100145) микродозатором вносят в чистые микроцентрифужные пробирки вместимостью 0,2 или 0,5 куб. см по 27 куб. мм в каждую. 7.1.2. Анализируемую ДНК, выделенную по [6.2,](#p100125) вносят микродозатором по 3 куб. мм в микроцентрифужные пробирки с реакционной смесью для амПЦР по 7.1.1. При использовании амплификатора ДНК по [4.3](#p100049) [[3]](#p100185) без подогрева крышки в каждую микроцентрифужную пробирку с реакционной смесью вносят по 30 куб. мм вазелинового масла по [ГОСТ 3164](https://bukva.ai/docs/gost-3164-78) для предохранения реакционной смеси от испарения водной фазы при амПЦР. В этом случае анализируемую ДНК вносят под слой масла, в результате чего образуются водная и масляная фазы. 7.1.3. В две другие микроцентрифужные пробирки микродозатором вносят по 3 куб. мм раствора заведомо трансгенной ДНК (положительный контроль) и раствора заведомо нетрансгенной ДНК (отрицательный контроль). 7.1.4. Все микроцентрифужные пробирки со смесями, полученными по [7.1.2,](#p100150) и растворами, подготовленными по 7.1.3, помещают в амплификатор ДНК и проводят амПЦР по программе, указанной в табл. 2.
Таблица 2
ПРОГРАММА ПРОВЕДЕНИЯ амПЦР
| Шаг программы | Температура, °С | Время инкубации | Число циклов | | --- | --- | --- | --- | | 1 | 95 | 5 мин. | 1 | | | 95 | 30 с | | | 2 | 62 | 30 с | 37 | | | 72 | 30 с | | | 3 | 72 | 5 мин. | 1 | #### 7.2 Гибридизация на биологическом микрочипе ##### 7.2.1 В необходимое количество микроцентрифужных пробирок микродозатором вносят по 24 куб. мм гибридизационного буфера, приготовленного по [6.1.4.](#p100114) Затем к гибридизационному буферу добавляют по 12 куб. мм водной фазы ПЦР-смеси, полученной в результате проведения амПЦР по [7.1.4,](#p100152) и перемешивают в течение 20 - 30 с на аппарате для встряхивания по [4.10](#p100056) с частотой вращения -1 не менее 1500 мин. для получения гибридизационной смеси. 7.2.2. Из каждой микроцентрифужной пробирки микродозатором отбирают по 28 куб. мм гибридизационной смеси (для каждого биологического микрочипа), полученной по [7.2.1,](#p100162) и помещают на поверхность биологического микрочипа через отверстие в пластиковой крышке. Гибридизацию проводят в термостате [[4]](#p100186) при температуре 37 °С в течение 18 ч. 7.2.3. После окончания гибридизации пластиковые крышки снимают, каждый биологический микрочип трижды промывают дистиллированной водой по ГОСТ 6709 при температуре 25 °С и высушивают при комнатной температуре. Схема метода идентификации генетически модифицированных источников (ГМИ) растительного происхождения приведена в [Прилож. Б](#p100208). ### 8. Обработка результатов анализа 8.1. Визуализацию гибридизационной картины на биологическом микрочипе для анализируемой пробы осуществляют с помощью аппаратно-программного комплекса для анализа флуоресценции биологических микрочипов "Чипдетектор-03" [[2]](#p100184) и компьютерной программы Imageware [[1].](#p100183) 8.2. Полученную на экране компьютера гибридизационную картину для анализируемой пробы сравнивают с гибридизационной картиной для положительного контроля (заведомо трансгенной ДНК) и гибридизационной картиной для отрицательного контроля (заведомо нетрансгенной ДНК). Пример гибридизационной картины флуоресцентных продуктов амПЦР в гелевых ячейках биологического микрочипа приведен в [Прилож. В](#p100210). Наличие высокого уровня специфического флуоресцентного сигнала в гелевых ячейках биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды (для промоторов 35S и nos, терминатора ocs, генов gus или npt II), свидетельствует о присутствии конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т.е. о трансгенности анализируемой ДНК. Низкий уровень флуоресцентных сигналов в гелевых ячейках биологического микрочипа после гибридизации, сравнимый с уровнем фоновой флуоресценции отрицательного контроля, но не выше установленного порога чувствительности в программе Imageware, указывает на отсутствие конкретных чужеродных последовательностей ДНК в анализируемой пробе, т.е. о нетрансгенности анализируемой ДНК. #### 8.3 Интерпретация результатов. 8.3.1. Высокий уровень флуоресценции одной, нескольких или всех пяти гелевых ячеек биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, превышающий заданный в программе Imageware [[1]](#p100183) порог чувствительности, свидетельствует о наличии генетически модифицированных источников (ГМИ) в анализируемом продукте. 8.3.2. Низкий уровень флуоресценции всех пяти гелевых ячеек биологического микрочипа, содержащих иммобилизованные олигонуклеотиды, близкий к фоновой флуоресценции отрицательных контролей и не достигающий заданного в программе Imageware порога чувствительности, свидетельствует об отсутствии генетически модифицированных источников (ГМИ) в анализируемом продукте. 8.3.3. Высокий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует о получении ложноположительного результата. Причиной может быть загрязнение ГМИ реактивов и/или оборудования. В этом случае необходимо обработать поверхности лабораторных столов и оборудования раствором соляной кислоты (1 моль/куб. дм), заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Полученный при повторном анализе низкий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо нетрансгенной ДНК свидетельствует о достоверном результате, который является окончательным. 8.3.4. Низкий уровень (отсутствие) флуоресцентного сигнала при использовании заведомо трансгенной ДНК свидетельствует о получении ложноотрицательного результата. Причиной могут быть потеря активности одного из компонентов реакционной смеси для амПЦР или несоблюдение условий проведения амПЦР и/или гибридизации на биологическом микрочипе. В этом случае необходимо заменить реактивы на свежеприготовленные и повторить анализ. Полученный при повторном анализе высокий уровень флуоресценции гелевых ячеек при использовании заведомо трансгенной ДНК свидетельствует о достоверном результате, который является окончательным. ### 9. Требования безопасности 9.1. При выполнении всех работ необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами в соответствии с ГОСТ 12.1.007. 9.2. Помещение, в котором проводятся работы, должно быть оборудовано общей приточно-вытяжной вентиляцией по ГОСТ 12.4.021. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать гигиенические нормативы, установленные Минздравом России [[23,](#p100205) [24].](#p100206) 9.3. При работе с электроустановками электробезопасность должна соответствовать требованиям ГОСТ 12.1.019. Помещение лаборатории должно соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004 и быть оснащено средствами пожаротушения по ГОСТ 12.4.009. 9.4. Исследования по идентификации ГМИ растительного происхождения могут проводиться на базе лабораторий, проводящих исследования методом ПЦР с патогенными биологическими агентами. В таком случае должно быть предусмотрено лишь разграничение проведения исследований во времени. При организации исследований по идентификации ГМИ необходимо предусмотреть наличие вспомогательных помещений (комнаты ведения учетной документации; раздевалки для сотрудников; комнаты приема пищи; туалета; подсобных помещений), которые могут быть общими с другими подразделениями учреждения. Проведение исследований методом ПЦР сопряжено с необходимостью обеспечения соблюдения правил биологической безопасности и требований к организации и проведению анализа с целью предотвращения ложноположительных и ложноотрицательных результатов [[22].](#p100204) ## Приложение А
(справочное)
Биологическая безопасность: защищенность человека, общества и окружающей среды от негативного воздействия токсических, аллергенных, канцерогенных, мутагенных биологических веществ и соединений, содержащихся в природных или генно-инженерно-модифицированных биологических объектах и полученных из них продуктах. ## Приложение Б
(справочное)
Не приводится
## Приложение В
(обязательное)
Не приводится
Приложение Г
(справочное)
**БИБЛИОГРАФИЯ**
1. Центр биологических Компьютерная программа "Imageware" микрочипов РАН ИМБ для анализа изображений, полученных с помощью "Чипдетектора-03" 2. ТУ 9443-001-02699501-03 Комплекс аппаратно-программный для анализа флуоресценции биологических микрочипов "Чипдетектор-03" 3. ТУ 9642-001-4648062-98 Амплификатор "Терцик МС-2" 4. ТУ 42-619-61 Термостат суховоздушный ТВЗ-25 5. Корпорация "Эппендорф", Микроцентрифуга настольная 5415С, кат. N 5425000.014 -1 13000 мин. 6. Корпорация "Хеликон", кат. Мешалка магнитная с подогревом N MSH-300 7. Корпорация "Хеликон", Аппарат для встряхивания кат. N CV-1500 (центрифуга-вортекс) 8. Корпорация "Хеликон", Штативы под микроцентрифужные кат. N RP-30 и RP-80 пробирки 9. Корпорация "Хеликон", Наконечники с фильтром для кат. N FA 104; FA 108; FA 111; микропипеток FA 113N 10. ТУ 6-09-11-1721-83 Этилендиаминтетрауксусной кислоты натриевая соль дигидрат 11. ТУ 6-09-4292-76 Трис(оксиметил)аминометан [NН2С(СН2ОН)3] 12. Корпорация "Сигма Алдрич" Додецилсульфат натрия (SDS) ("Sigma"), кат. N L-6026 13. Корпорация "Сигма Алдрич" Фермент Taq-полимераза 5 ед. ("Sigma"), кат. N Д 1806 акт./куб. мм 14. Корпорация "Хеликон", Гуанидин тиоцианат [CH3N3-HSCN] кат. N Am-038-0.5 15. Корпорация "Хеликон", N-[2-оксиэтил]пиперазин-N'- кат. N Am-0485-Ol [2-этансульфоновая кислота] (HEPES) [C8H17N2O4SNa] 16. Корпорация "Хеликон", Раствор смеси дАТФ, дГТФ, дТТФ, кат. N Н-4044-0.4 дЦТФ, по 25 мл каждого 17. ИФР РАН Раствор заведомо трансгенной ДНК 6 около 100 нг/куб. мм или 10 копий/куб. мм 18. ИФР РАН Раствор заведомо нетрансгенной ДНК 6 около 100 нг/куб. мм или 10 копий/куб. мм 19. ТУ 46-22-603-75 Баня водяная с электрическим или огневым подогревом 20. Центр биологических Раствор водный праймеров "ПР-1" микрочипов ИМБ РАН 21. Центр биологических Микрочипы гелевые с микрочипов ИМБ РАН иммобилизованными олигонуклеотидами 22. Методические рекомендации Государственный комитет по проведению работ в санэпиднадзора Российской диагностических лабораториях, Федерации; N 06-19/52-17 от использующих метод поли- 02.06.95 меразной цепной реакции. Основные положения 23. Предельно допустимые Минздрав России. М., 2003 концентрации (ПДК) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. ГН 2.2.5.1313-03 24. Ориентировочные Минздрав России. М., 2003 безопасные уровни воздействия (ОБУВ) вредных веществ в воздухе рабочей зоны. ГН 2.2.5.1314-03 ------------------------------------------------------------------