--- title: "\"МУК 4.2.1775-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.1775-03" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-2-1775-03" --- ## "МУК 4.2.1775-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания" # "МУК 4.2.1775-03. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания" (утв. Минздравом России 24.10.2003) > [!IMPORTANT] > Документ [введен](#p100002) в действие с 1 декабря 2003 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
24 октября 2003 года
#### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК** **МИКРООРГАНИЗМА TRICHODERMA VIRIDE 44-11-62/3 - ПРОДУЦЕНТА** **КОМПЛЕКСА ЦЕЛЛЮЛОЛИТИЧЕСКИХ ФЕРМЕНТОВ В АТМОСФЕРНОМ** **ВОЗДУХЕ НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.2.1775-03**
Дата введения
1 декабря 2003 года 1. Разработаны Российским государственным медицинским университетом (к.б.н. Н.И. Шеиной). 2. Утверждены Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 24 октября 2003 г. 3. Введены в действие с 1 декабря 2003 г. 4. Введены впервые. ## 1. Общие положения и область применения Настоящие Методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма - Trichoderma viride 44-11-62/3 - продуцента комплекса целлюлолитических ферментов (целлюлаза, ксиланаза) в атмосферном воздухе населенных мест в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Методики выполнения измерений". Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды". ## 2. Характеристика штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3 На агаризованной среде сусло-агар (содержание солодового сусла 5 - 6° по Баллингу) на 5 день развития микроорганизм образует характерные колонии до 5,0 - 5,5 см в диаметре с гладкой подошвой, слегка приподнятые над поверхностью среды, не врастающие в агар, с волнистым краем, пушистым воздушным мицелием, который покрыт спорами лимонно-желтого цвета. На 3 день развития в среду выделяется ярко-желтый пигмент лимонного оттенка. Гифы мицелия бесцветные, септированные, многократно ветвистые. Систематическое положение микроорганизма Класс Fungi imperfecti Порядок Hyphomycetales Род Trichoderma Вид viride Штамм 44-11-62/3 Штамм Trichoderma viride 44-11-62/3 получен во ВНИИбиотехнология в лаборатории Биосинтеза ферментов методом индуцированной селекции с применением этиленимина и нитрозометилмочевины из исходной культуры Trichoderma viride 44 - продуцента целлюлазы и депонирован в ЦМПМ ВНИИгенетика. Штамм-продуцент синтезирует высокоактивный комплекс целлюлолитических ферментов для производства ферментного препарата целловиридин Г3х. Максимальная активность целлюлазы составляет 35 ед./мл, ксиланазы - 42 ед./мл. Штамм-продуцент растет на жидких и агаризованных средах. Культивирование гриба происходит 5 суток при температуре 36 - 38 °С, затем 5 суток при комнатной температуре. Для размножения и хранения используется сусло-агар 5 - 6 °Б, рН среды - 5,0 - 6,0. Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл./куб. м, пометка А. ## 3. Пределы измерений Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе в диапазоне концентраций от 100 до 5000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95. ## 4. Метод измерений Прямой метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток (спор, фрагментов мицелия) на поверхность плотной питательной среды сусло-агар и подсчета выросших колоний по культурально-морфологическим признакам на день развития. Косвенный метод измерения концентрации штамма-продуцента основан на аспирации из воздуха микробных клеток на поверхность плотной питательной селективной среды и подсчета выросших колоний по зонам просветления, образующихся вокруг каждой колонии штамма, как результат продукции целлюлазы на среде с окрашенной целлюлозой. ## 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. #### 5.1 Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Прибор для бактериологического анализа ТУ 64-12791-77 воздуха, модель 818 (щелевой прибор Кротова) Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные, аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 Лупа с увеличением х10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные, стеклянные, диаметром 100 мм Пробирки биологические ГОСТ 10515-75 вместимостью 20 и 35 мл Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74 Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81 #### 5.2 Реактивы, растворы Агаризованное пивное сусло 5 - 6 °Б для штамма-продуцента (агар - 1,8%, рН 5,0 - 6,0, режим стерилизации 1,1 - 1,2 ати в течение 30 мин.) Молочная кислота, ГОСТ 490-79 синоним - альфа-оксипропионовая кислота (из расчета 0,4 мл на 100 мл среды сусло-агар для подавления посторонней бактериальной флоры) Бенгальский розовый Диметилсульфоксид Спирт этиловый ректификат [ГОСТ 5962-67](https://bukva.ai/docs/gost-5962-67) Селективная среда для штамма-продуцента, состав среды: КН РО - 1 г; МgSО 7Н О - 0,5 г; 2 4 4 2 (NН ) SО - 0,7 г; целлюлоза порошковая 4 2 4 в пересчете на сухое вещество - 0,9 г; лактоза - 0,3 г; дрожжевой экстракт - 0,5 г; агар - 18 г; вода дистиллированная - до 1000 мл ## 6. Требования безопасности При выполнении измерений концентрации клеток штамма-продуцента в атмосферном воздухе соблюдают следующие требования: 6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88. 6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора. 6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977). 6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. ## 7. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. ## 8. Условия измерений Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%. ## 9. Проведение измерения #### 9.1 Условия отбора проб воздуха Для определения концентрации клеток штамма-продуцента воздух аспирируют при помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента (прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента, косвенный - до 30 - 50 колоний на чашке). Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. #### 9.2 Выполнение анализа При выполнении анализа воздуха прямым методом среду сусло-агар расплавляют, остужают до 50 - 60 °С, добавляют молочной кислоты из расчета 0,4 мл на 100 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают в чашки Петри. При выполнении анализа воздуха косвенным методом селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют 50 мг/л бенгальского розового, растворенного в 1 мл диметилсульфоксида, тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Бенгальский розовый предназначен для специфического окрашивания целлюлозы и для ограничения разрастания колоний на чашках. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 42 °С (для интенсификации развития гриба). Через 3 суток производят подсчет выросших колоний по культурально-морфологическим признакам и характерной пигментации среды (прямой метод) или зон просветления вокруг выросших колоний продуцента (косвенный метод) как результат продукции целлюлолитических ферментов на среде с окрашенной целлюлозой. ## 10. Вычисление результатов измерения Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле: N х 1000 Х = --------, кл./куб. м, V где: Х - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). ## 11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме. Протокол N
количественного микробиологического анализа штамма-продуцента Trichoderma viride 44-11-62/3 в атмосферном воздухе населенных мест 1. Дата проведения анализа _______________________________ 2. Место отбора пробы ____________________________________
3. Название лаборатории __________________________________
4. Юридический адрес организации _________________________ Результаты микробиологического анализа | Шифр или N пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл./куб. м | | --- | --- | --- |
Ответственный исполнитель
Научный руководитель ## Список литературы 1. Руководство по контролю загрязнения атмосферы: [РД 52.04.186-96](https://bukva.ai/docs/rukovodstvo-rd-52-04-186-89). М., 1991. 693 с. 2. [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329). ГСИ "Методики выполнения измерений". 3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности. М., 1980. 27 с. 4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности. М., 1977. 7 с.
5. ГОСТ 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ". М.: Изд-во стандартов, 1981. 3 с.
6. Бабьева И.П., Зенова Г.М. Биология почв. М.: МГУ. 122 с.
---