--- title: "\"МУК 4.2.1008-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма pseudomonas Fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны. Методические указания\"" number: "МУК 4.2.1008-00" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-2-1008-00" --- ## "МУК 4.2.1008-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма pseudomonas Fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны. Методические указания" # "МУК 4.2.1008-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма pseudomonas Fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в воздухе рабочей зоны. Методические указания" (утв. Минздравом России 21.12.2000) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). > Документ [введен](#p100002) в действие с 21 декабря 2000 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации -
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
21 декабря 2000 года
#### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ. **МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ** **КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS** **FLUORESCENS (DENITRIFICANS) В 99 - ПРОДУЦЕНТА** **ВИТАМИНА В12 В ВОЗДУХЕ РАБОЧЕЙ ЗОНЫ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.2.1008-00**
Дата введения:
с момента утверждения
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской Л.В. (Государственный научный центр по антибиотикам). 2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 21 декабря 2000 г. 3. Введены впервые. ## 1. Общие положения и область применения Настоящие методические указания устанавливают методику проведения микробиологического количественного анализа концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 - продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны в диапазоне 12 концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТа 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования" и [ГОСТа Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Методики выполнения измерений". Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований. Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды". 2. Характеристика штамма - продуцента витамина В 12 Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 является продуцентом витамина В . Штамм растет на агаризованных 12 средах на основе мелассы при температуре 28 °С. В течение 3-х суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета. Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М, ристомицину, цефалотину и эритромицину. Предельно допустимая концентрация (ПДК) в воздухе рабочей зоны - 2000 кл./куб. м. ## 3. Пределы измерений Методика обеспечивает выполнения измерений количества клеток продуцента витамина В в воздухе рабочей зоны в диапазоне 12 концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха при доверительной вероятности 0,95. ## 4. Метод измерений Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента витамина В и на поверхность плотной питательной среды и подсчете 12 выросших колоний по типичным морфологическим признакам. ## 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы. ### 5.1. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы Прибор для бактериологического анализа воздуха, ТУ 64-12791-77 модель 818 (щелевой прибор Кротова) Термостаты электрические суховоздушные или водяные Автоклав электрический ГОСТ 9586-75 Бокс, оборудованный бактерицидными лампами Холодильник бытовой Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200 Микроскоп биологический с иммерсионной системой типа "Биолам" Л-211 Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83 Чашки Петри бактериологические плоскодонные стеклянные диаметром 100 мм Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75 Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74 Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74 Секундомер ГОСТ 9586-75 Барометр ГОСТ 24696-79 Марля медицинская ГОСТ 9412-77 Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81. ### 5.2. Реактивы, растворы Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин, эритромицин.
Спирт этиловый ректификат [ГОСТ 5962-67](https://bukva.ai/docs/gost-5962-67)
Селективная среда для штамма-продуцента. Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO - 1,3 г; MgSO 7H O - 4 2 4 4 2 1,0 г; (NH ) SO - 0,5 г; MnSO H O - 0,1 г; ZnSO 7H O - 0,1 г; 4 2 4 4 2 4 2 агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 - 7,0; стерилизация - 121 °С, 30 минут. ## 6. Требования безопасности При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
витамина В в воздухе рабочей зоны соблюдают следующие
12
требования. 6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.005-88. 6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора. 6.3. Руководство "Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности" (1980), "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977). 6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами. ## 7. Требования к квалификации операторов К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований. ## 8. Условия измерений Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха 20 +/- 5 °С, атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%. ## 9. Проведение измерения ### 9.1. Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента витамина В воздух аспирируют при
12 помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (1 - 10 мин.) зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента. Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенку крышки. На подвижный диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы. ### 9.2. Выполнение анализа Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента. Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха. После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат при 28 °С. Через 48 - 72 часа производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию. ## 10. Вычисление результатов измерения Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле: N 1000 Х = ------, кл./куб. м, V где: Х - концентрация клеток продуцента в воздухе; N - количество колоний продуцента, выросших на чашке; 1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха; V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации). В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 минут (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода пользуются следующим расчетом концентрации клеток продуцента: эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см. Составляем пропорцию: на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха на 78,54 кв. см - Х л Х = 1,57 л/мин. Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха. Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха. На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Тл. В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится: N х 1000 N х 636,9 -------- = ---------. 1,57 х Т Т Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится: 12 х 636,9 ---------- = 253 клетки. 30 ## 11. Оформление результатов измерений Результаты измерений оформляют протоколом по форме. Протокол N Количественного микробиологического анализа штамма - продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99 в воздухе рабочей зоны Дата проведения анализа ______________________________________ Место отбора пробы ___________________________________________ Название лаборатории _________________________________________ Юридический адрес организации ________________________________ Результаты микробиологического анализа | Шифр или N пробы | Определяемый микроорганизм | Концентрация, кл/куб. м | | --- | --- | --- |
Ответственный исполнитель
Научный руководитель
## Список литературы 1. ГОСТ 12.1.005-88 "ССБТ. Воздух рабочей зоны. Общие санитарно-гигиенические требования". 2. [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329). ГСИ. "Методики выполнения измерений". 3. Положение об организации работы по технике безопасности в микробиологической промышленности, М., 1980. 27 с. 4. Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности, М., 1977. 7 с. ---