---
title: "\"МУК 4.2.1004-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания\""
number: "МУК 4.2.1004-00"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-2-1004-00"
---
## "МУК 4.2.1004-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
# "МУК 4.2.1004-00. 4.2. Методы контроля. Микробиологические факторы. Метод микробиологического измерения концентрации клеток микроорганизма Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В99-продуцента витамина В12 в атмосферном воздухе населенных мест. Методические указания"
(утв. Минздравом России 20.12.2000)
> [!IMPORTANT]
> Документ [введен](#p100002) в действие с 20 декабря 2000 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
20 декабря 2000 года
#### 4.2 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ
**МЕТОД МИКРОБИОЛОГИЧЕСКОГО ИЗМЕРЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ КЛЕТОК**
**МИКРООРГАНИЗМА PSEUDOMONAS FLUORESCENS (DENITRIFICANS)**
**В 99 - ПРОДУЦЕНТА ВИТАМИНА В12 В АТМОСФЕРНОМ ВОЗДУХЕ**
**НАСЕЛЕННЫХ МЕСТ**
**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.2.1004-00**
с момента утверждения
1. Разработаны к.б.н. Бару Р.В., к.б.н. Лапчинской А.В. (Государственный научный центр по антибиотикам).
2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем министра здравоохранения Российской Федерации 20 декабря 2000 г.
3. Введены впервые.
## 1. Общие положения и область применения
Настоящие Методические указания устанавливают методику
проведения микробиологического количественного анализа
концентрации клеток штамма Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В 99 - продуцента витамина В в атмосферном воздухе населенных
12
мест в диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м
воздуха.
Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТов 17.2.4.02-81 "Охрана природы. Атмосфера. Общие требования к методам определения загрязняющих веществ" и [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "Методики выполнения измерений".
Методические указания предназначены для применения в лабораториях предприятий, организаций и учреждений, аккредитованных в установленном порядке на право проведения микробиологических исследований.
Методические указания одобрены и рекомендованы секцией "Гигиенические аспекты биотехнологии и микробного загрязнения окружающей среды" Проблемной комиссии "Научные основы гигиены окружающей среды".
## 2. Характеристика штамма-продуцента витамина В12
Микроорганизм Pseudomonas fluorescens (denitrificans) В 99
является продуцентом витамина В . Штамм растет на агаризованных
12
средах на основе мелассы при температуре 28 °С. В течение 3-х
суток образует округлые колонии 1 - 2 мм белого цвета.
Морфологически представляет собой грамотрицательные подвижные
палочки размером 0,45 - 0,85 х 0,6 мкм. Штамм устойчив к следующим
антибиотикам: левомицетину, линкомицину, полимиксину М,
ристомицину, цефалотину и эритромицину.
Предельно допустимая концентрация (ПДК) в атмосферном воздухе населенных мест - 200 кл./куб. м.
## 3. Пределы измерений
Методика обеспечивает выполнение измерений количества клеток
продуцента витамина В в атмосферном воздухе населенных мест в
12
диапазоне концентраций от 100 до 3000 клеток в 1 куб. м воздуха
при доверительной вероятности 0,95.
## 4. Метод измерений
Метод основан на аспирации из воздуха клеток продуцента
витамина В на поверхность плотной питательной среды и подсчете
12
выросших колоний по типичным морфологическим признакам.
## 5. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы
При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства и материалы.
#### 5.1 Средства измерений, вспомогательные
устройства, материалы
Прибор для бактериологического анализа воздуха,
модель 818 (щелевой прибор Кротова) ТУ 64-12791-77
Термостаты электрические суховоздушные
или водяные
Автоклав электрический ГОСТ 9586-75
Бокс, оборудованный бактерицидными лампами
Холодильник бытовой
Весы лабораторные аналитические типа ВЛА-200
Микроскоп биологический с иммерсионной
системой типа "Биолам" Л-211
Лупа с увеличением х 10 ГОСТ 25706-83
Чашки Петри бактериологические плоскодонные
стеклянные диаметром 100 мм
Пробирки биологические вместимостью 20 и 35 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные на 1, 5 и 10 мл ГОСТ 1770-74
Колбы конические вместимостью 250 и 500 мл ГОСТ 1770-74
Секундомер ГОСТ 9586-75
Барометр ГОСТ 24696-79
Марля медицинская ГОСТ 9412-77
Вата медицинская гигроскопическая ГОСТ 25556-81
#### 5.2 Реактивы, растворы
Антибиотики: левомицетин, линкомицин, полимиксин М, цефалотин,
эритромицин.
Спирт этиловый ректификат [ГОСТ 5962-67](https://bukva.ai/docs/gost-5962-67)
Селективная среда для штамма-продуцента
Среда: меласса - 100 - 150 г; (NH ) HPO - 1,3 г; MgSO 7Н O -
4 2 4 4 2
1,0 г; (NH ) SO - 0,5 г; MnSO H O - 0,1 г; ZnSO 7H O - 0,1 г;
4 2 4 4 2 4 2
агар Difco - 20 г; вода дистиллированная - до 1000 мл; рН - 6,8 -
7,0; стерилизация 121 °С, 30 мин.
## 6. Требования безопасности
При выполнении измерений концентрации клеток продуцента
витамина В в атмосферном воздухе населенных мест соблюдают
12
следующие требования.
6.1. Правила техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТу 12.1.005-88.
6.2. Электробезопасность при работе с электроустановками по ГОСТу 12.1.019-79 и инструкции по эксплуатации прибора.
6.3. "Инструкции по устройству, требованиям безопасности и личной гигиены при работе в микробиологических лабораториях предприятий микробиологической промышленности" (1977).
6.4. Все виды работ с реактивами проводят только в вытяжном шкафу при работающей вентиляции, работа с биологическим материалом осуществляется в боксе, оборудованном бактерицидными лампами.
## 7. Требования к квалификации операторов
К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц с высшим или средним специальным образованием, прошедших соответствующую подготовку и имеющих навыки работы в области микробиологических исследований.
## 8. Условия измерений
Процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5 °С), атмосферном давлении 630 - 800 мм рт. ст. и влажности воздуха не более 80%.
## 9. Проведение измерения
#### 9.1 Условия отбора проб воздуха
Для определения продуцента витамина В воздух аспирируют при
12
помощи аппарата Кротова со скоростью 10 л/мин. на поверхность
плотной питательной среды. Время аспирации воздуха (5 - 20 мин.)
зависит от предполагаемой концентрации клеток продуцента.
Аппарат Кротова перед каждым отбором пробы воздуха тщательно протирают спиртом. Особенно тщательно обрабатывают поверхность подвижного диска и внутреннюю стенку прибора, наружную и внутреннюю стенки крышки. На подвижной диск устанавливают подготовленную чашку Петри со средой, одновременно снимая с нее крышку. Прибор закрывают. Соприкосновение крышки прибора со средой недопустимо. После отбора пробы воздуха и остановки диска прибор открывают, быстро снимают чашку Петри и закрывают крышкой от данной чашки. На дне чашки Петри стеклографом отмечают точку контроля, время аспирации и дату отбора пробы.
#### 9.2 Выполнение анализа
Метод предполагает учет количества типичных по морфологическим признакам колоний, выросших на 2 - 3 сутки после посева воздуха. Прямой метод позволяет учитывать на чашке до 200 колоний продуцента.
Селективную среду расплавляют, остужают до 60 °С, добавляют свежеприготовленный в стерильной дистиллированной воде раствор антибиотика (левомицетин, линкомицин, цефалотин и др.) из расчета 30 мкг на 1 мл среды (для подавления посторонней бактериальной микрофлоры), тщательно перемешивают и разливают по 10 мл в стеклянные чашки Петри на горизонтальной поверхности. Чашки с застывшей средой помещают в термостат на сутки при температуре 37 °С, после чего проросшие чашки бракуют, стерильные чашки используют для контроля воздуха.
После отбора проб воздуха чашки Петри помещают в термостат на 28 °С. Через 48 - 72 ч производят подсчет выросших типичных колоний продуцента. При необходимости культуру подвергают микроскопированию.
## 10. Вычисление результатов измерения
Расчет концентрации клеток продуцента в пересчете на 1 куб. м воздуха производят по формуле:
N х 1000
Х = --------, кл./куб. м,
V
где:
Х - концентрация клеток продуцента в воздухе;
N - количество колоний продуцента, выросших на чашке;
1000 - коэффициент пересчета на 1 куб. м воздуха;
V - объем воздуха, л (произведение скорости на время аспирации).
В случае невозможности использования аппарата Кротова рекомендуется применять метод седиментации клеток продуцента из воздуха непосредственно на чашки Петри с плотной питательной средой. Время отбора проб воздуха может составлять до 60 мин. (при определении концентрации микроорганизма в атмосферном воздухе). При использовании этого метода применяют следующий расчет концентрации клеток продуцента:
эмпирически установлено, что за 5 мин. на площадь 100 кв. см оседает количество бактерий, содержащееся в 10 л воздуха, за 1 мин. - 2 л воздуха. Площадь чашки Петри диаметром 100 мм (радиус 8 см) равна 78,54 кв. см.
Составляем пропорцию:
на 100 кв. см за 1 мин. оседает 2 л воздуха
на 78,54 кв. см - Х л
Х = 1,57 л/мин.
Следовательно, на стеклянную чашку Петри за 1 мин. оседает 1,57 л воздуха.
Надо определить количество клеток в 1 куб. м воздуха.
На 1 чашку (диаметр 100 мм) за 1 мин. оседает количество микробов, содержащихся в 1,57 л воздуха, за Т мин. - 1,57 х Т л.
В этом количестве содержится N колониеобразующих единиц (микробных клеток - спор, обрывков мицелия), а в 1 куб. м воздуха содержится:
N х 1000 N х 636,9
-------- = ---------.
1,57 х Т Т
Пример: за 30 мин. седиментации выросло 12 колоний микроорганизма. В 1 куб. м воздуха содержится:
12 х 636,9
---------- = 253 клетки.
30
## 11. Оформление результатов измерений
Результаты измерений оформляют протоколом по форме.
Протокол N
количественного микробиологического анализа
штамма-продуцента Pseudomonas fluorescens (denitrificans)
В 99 в атмосферном воздухе
1. Дата проведения анализа ___________________________
2. Место отбора пробы ________________________________
3. Название лаборатории ______________________________
4.
Юридический адрес организации _____________________