МУК 4.1.3323-15. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств метобромурона и 4-бромфенилмочевины в семенах подсолнечника, бобах сои и растительном масле методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Роспотребнадзором 28.12.2015)

Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 28 декабря 2015 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ МЕТОБРОМУРОНА И 4-БРОМФЕНИЛМОЧЕВИНЫ В СЕМЕНАХ ПОДСОЛНЕЧНИКА, БОБАХ СОИ И РАСТИТЕЛЬНОМ МАСЛЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУК 4.1.3323-15

1. Разработаны сотрудниками ФГБНУ «Всероссийский НИИ защиты растений» (В.И. Долженко, А.С. Комарова, В.В. Человечкова) и ООО «Инновационный центр защиты растений» (И.А. Цибульская, Т.Д. Черменская).

2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 17 декабря 2015 г. № 2).

3. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 28 декабря 2015 г.

4. Введены впервые.

Свидетельство о метрологической аттестации № 01.5.04.198/01.00043/2015.

Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения остаточных количеств метобромурона и 4-бромфенилмочевины в семенах подсолнечника, бобах сои и растительном масле в диапазоне концентраций 0,05 — 0,5 мг/кг.

Методические указания носят рекомендательный характер.

Метобромурон

3-(4-бромфенил)-1-метокси-1-метилмочевина (ИЮПАК)

C₉H₁₁BrN₂O₂

Молекулярная масса: 259,1.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления: 95 — 96 °C.

Давление пара при 25 °C: 0,4 МПа.

Растворимость в воде: 330 мг/дм3 (при 20 °C).

Растворимость в органических растворителях (г/дм3 при 20 °C): гептан < 10; дихлорметан, ацетон, метанол, этилацетат > 250.

Стабильность к гидролизу: стабилен, при 20 °C: DT50 = 170 дней (pH 7).

Период полураспада в почве: DT50 = 34 дня.

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность LD50 для млекопитающих (для крыс) > 10 000 мг/кг. Оказывает раздражающее действие на кожу, слизистую глаз и дыхательные пути.

Область применения препарата. Предвсходовый гербицид для борьбы с широколиственными сорняками и однолетними травами, адсорбируется корнями и листьями.

Механизм действия. Ингибирование фотосинтеза.

4-Бромфенилмочевина

4-Бромфенилмочевина (ИЮПАК).

Основной метаболит метобромурона в почве и растениях.

C₇H₇BrN₂O

Молекулярная масса: 215,0.

Химически чистое вещество представляет собой бесцветные кристаллы.

Температура плавления: 225 — 227 °C.

В России для метобромурона и 4-бромфенилмочевины гигиенические нормативы не установлены.

1. Погрешность измерений

При соблюдении всех регламентированных условий проведения анализа в точном соответствии с данной методикой погрешность (и ее составляющие) результатов измерений при доверительной вероятности P = 0,95 не превышает значений, приведенных в табл. 1 и 2, для соответствующих диапазонов концентраций.

Таблица 1

Метрологические параметры для метобромурона

Таблица 2

Метрологические параметры для 4-бромфенилмочевины

Таблица 3

Полнота извлечения метобромурона, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

Таблица 4

Полнота извлечения 4-бромфенилмочевины, стандартное отклонение, доверительный интервал среднего результата

2. Метод измерений

Методика основана на определении метобромурона и 4-бромфенилмочевины методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с использованием УФ-детектора после их извлечения из образцов ацетонитрилом и очистке на патроне для твердофазной экстракции.

Идентификация проводится по времени удерживания, количественное определение — методом абсолютной калибровки.

Избирательность метода обеспечивается сочетанием условий подготовки проб и хроматографирования.

3. Средства измерений, реактивы, вспомогательные устройства и материалы

3.1 Средства измерений

3.2 Реактивы

Примечание. Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией, не требующих дополнительной очистки растворителей.

3.3 Вспомогательные устройства и материалы

Примечание. Допускается применение оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования по электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-09, а также требования, изложенные в технической документации на жидкостный хроматограф.

4.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией, соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83. Содержание вредных веществ в воздухе не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и ГН 2.2.5.2308-07.

Организация обучения работников безопасности труда — по ГОСТ 12.0.004-90.

5. Требования к квалификации операторов

Измерения в соответствии с настоящей методикой может выполнять специалист-химик, имеющий опыт работы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии, ознакомленный с руководством по эксплуатации хроматографа, освоивший данную методику и подтвердивший экспериментально соответствие получаемых результатов нормативам контроля погрешности измерений по п. 13.

6. Условия измерений

При выполнении измерений выполняют следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °C и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к определению

7.1 Кондиционирование колонки

Перед началом анализа аналитическую колонку кондиционируют в потоке подвижной фазы (0,1 — 0,2 см3/мин) до стабилизации нулевой линии.

7.2 Приготовление растворов

7.2.1. 0,005 М раствор ортофосфорной кислоты: (0,5 +/- 0,01) г 98%-й ортофосфорной кислоты помещают в мерную колбу объемом 1 дм3, растворяют в бидистиллированной воде и доводят объем до метки. Раствор хранят при комнатной температуре не более 1 месяца.

7.3 Приготовление основных и градуировочных растворов

7.3.1 Приготовление основного и градуировочных растворов

метобромурона

7.3.1.1. Основной раствор метобромурона с концентрацией 1,0 мг/см3: точную навеску метобромурона (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в качестве растворителя подвижную фазу № 1.

7.3.1.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,1 см3 основного раствора метобромурона и доводят до метки подвижной фазой № 1.

7.3.1.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора метобромурона № 1 и доводят до метки подвижной фазой № 1.

7.3.1.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,0 см3 раствора метобромурона № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой № 1.

7.3.1.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора метобромурона № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой № 1.

7.3.1.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора метобромурона № 4 и доводят объем до метки подвижной фазой № 1.

7.3.2 Приготовление основного и градуировочных растворов

4-бромфенилмочевины

7.3.2.1. Основной раствор 4-бромфенилмочевины с концентрацией 1,0 мг/см3: точную навеску 4-бромфенилмочевины (50 +/- 0,5) мг помещают в мерную колбу вместимостью 50 см3, растворяют в метаноле и доводят объем до метки тем же растворителем.

Градуировочные растворы с концентрациями 0,05; 0,1; 0,2; 0,5; 1,0 мкг/см3 готовят методом последовательного разбавления по объему, используя в качестве растворителя подвижную фазу № 2.

7.3.2.2. Раствор № 1 с концентрацией 1,0 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 100 см3 вносят 0,1 см3 основного раствора 4-бромфенилмочевины и доводят до метки подвижной фазой № 2.

7.3.2.3. Раствор № 2 с концентрацией 0,5 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5,0 см3 раствора 4-бромфенилмочевины № 1 и доводят до метки подвижной фазой № 2.

7.3.2.4. Раствор № 3 с концентрацией 0,2 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 2,0 см3 раствора 4-бромфенилмочевины № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой № 2.

7.3.2.5. Раствор № 4 с концентрацией 0,1 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 1,0 см3 раствора 4-бромфенилмочевины № 1 и доводят объем до метки подвижной фазой № 2.

7.3.2.6. Раствор № 5 с концентрацией 0,05 мкг/см3: в мерную колбу вместимостью 10 см3 помещают 5 см3 раствора 4-бромфенилмочевины № 4 и доводят объем до метки подвижной фазой № 2.

Основные растворы можно хранить в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в течение 3 месяцев, градуировочные растворы — в течение недели.

При изучении полноты определения метобромурона и 4-бромфенилмочевины в матрицах используют растворы в ацетонитриле и метаноле соответственно.

7.4 Построение градуировочного графика

Для построения градуировочного графика (площадь пика — концентрация метобромурона или 4-бромфенилмочевины в растворе) в хроматограф вводят по 10 мм3 градуировочных растворов (не менее 3 параллельных измерений для каждой концентрации, не менее 4 точек по диапазону измеряемых концентраций). Затем измеряют площади пиков и строят график зависимости среднего значения площади пика от концентрации в градуировочном растворе.

Методом наименьших квадратов рассчитывают градуировочный коэффициент (K) в уравнении линейной регрессии для каждого из веществ:

C = K S, где

S — площадь пика градуировочного раствора.

Градуировку признают удовлетворительной, если значение коэффициента линейной корреляции оказывается не ниже 0,99.

Градуировочную характеристику необходимо проверять при замене реактивов, хроматографической колонки или элементов хроматографической системы, а также при отрицательном результате контроля градуировочного коэффициента.

Градуировочную зависимость признают стабильной при выполнении следующего условия:

\frac{|C - C_{K}|}{C} \cdot 100 \leq \lambda_{\text{контр}.} , где

C — аттестованное значение массовой концентрации метобромурона или 4-бромфенилмочевины в градуировочном растворе,

Cк — результат контрольного измерения массовой концентрации метобромурона или 4-бромфенилмочевины в градуировочном растворе,

\lambda_{\text{контр}.} — норматив контроля градуировочного коэффициента, % ( \lambda_{\text{контр}.} = 10\% при P = 0,95).

7.5 Подготовка патрона для твердофазной экстракции

Патрон промывают последовательно 3 см3 этилацетата и 3 см3 гексана, после чего он готов к работе.

7.6 Проверка хроматографического поведения метобромурона

и 4-бромфенилмочевины на патроне для твердофазной экстракции

В круглодонную колбу емкостью 10 см3 отбирают по 1 см3 стандартных растворов метобромурона и 4-бромфенилмочевины в ацетонитриле с концентрацией 1 мкг/см3 и 0,1 г растительного масла (наличие масла необходимо, так как без него 4-бромфенилмочевина не растворится в гексане). Растворитель удаляют в вакууме. Остаток растворяют в 1 см3 гексана и переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу ополаскивают 1 см3 гексана и также наносят на патрон. Последовательно промывают патрон 10 см3 гексана и 3 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Метобромурон элюируют 6 см3 смеси № 2 со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы № 1 и анализируют по п. 9.3. Далее промывают патрон 5 см3 смеси № 3, элюат отбрасывают. 4-Бромфенилмочевину элюируют 8 см3 этилацетата со скоростью 1 — 2 капли в секунду. Отбирают фракции по 2 см3, упаривают досуха, растворяют в 1 см3 подвижной фазы № 2 и анализируют по п. 9.4.

Фракции, содержащие метобромурон, объединяют и вновь анализируют. Фракции, содержащие 4-бромфенилмочевину, тоже объединяют и вновь анализируют.

Устанавливают уровень веществ в элюате, определяют полноту смывания с патрона и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Проверку хроматографического поведения метобромурона и 4-бромфенилмочевины следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии патронов и растворителей.

8. Отбор проб и хранение

Отбор проб семян подсолнечника и бобов сои производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79), а также в соответствии с ГОСТ 10852-86 «Семена масличные. Правила приемки и методы отбора проб». Пробы семян подсолнечника и бобов сои хранят при комнатной температуре в полотняных мешочках, перед анализом доводят до стандартной влажности и измельчают. Растительное масло хранят в холодильнике при температуре 0 — 4 °C в герметично закрытой стеклянной таре в течение 6 месяцев.

Для исследовательских целей допускается получение масла в день анализа в лаборатории из проб измельченных семян или бобов с помощью лабораторного пресса.

9. Проведение определения

9.1 Определение метобромурона и 4-бромфенилмочевины

в семенах подсолнечника, бобах сои и растительном масле

Пробу измельченных семян подсолнечника, бобов сои или растительного масла (10 г) помещают в полипропиленовую центрифужную пробирку объемом 50 см3, добавляют 30 см3 ацетонитрила, помещают в перемешивающее устройство на 10 мин, затем центрифугируют в течение 10 мин при скорости 4 000 об./мин. Ацетонитрильный экстракт декантируют, в пробирку добавляют 20 см3 ацетонитрила и экстракцию повторяют. От объединенных органических экстрактов отбирают аликвоту, соответствующую 1 г пробы, переносят в круглодонную колбу вместимостью 25 см3 и упаривают растворитель на ротационном вакуумном испарителе при температуре бани не выше 40 °C. Сухой остаток подвергают очистке по п. 9.2.

9.2 Очистка на патроне для твердофазной экстракции

Сухой остаток, полученный в п. 9.1, растворяют в 1 см3 гексана и количественно переносят на подготовленный патрон (п. 7.5). Колбу ополаскивают 1 см3 гексана и также наносят на патрон. Патрон последовательно промывают 10 см3 гексана и 3 см3 смеси № 1, элюат отбрасывают. Метобромурон элюируют 5 см3 смеси № 2. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы № 1 и анализируют по п. 9.3.

Далее патрон промывают 5 см3 смеси № 3, элюат отбрасывают. 4-Бромфенилмочевину элюируют 5 см3 этилацетата. Элюат собирают в круглодонную колбу емкостью 25 см3 и упаривают досуха на ротационном испарителе при температуре не выше 40 °C. Сухой остаток растворяют в 1 см3 подвижной фазы № 2 и анализируют по п. 9.4.

9.3 Условия хроматографирования метобромурона

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи C18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза № 1: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 45 : 55, по объему. Скорость потока элюента — 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора — 245 нм. Объем вводимой пробы — 10 мм3. Время удерживания метобромурона — (4,1 +/- 0,1) мин.

9.4 Условия хроматографирования 4-бромфенилмочевины

Ультраэффективный жидкостный хроматограф с быстросканирующим УФ-детектором, снабженный дегазатором, автоматическим пробоотборником и термостатом колонки. Аналитическая колонка, заполненная сорбентом с привитой фазой, включающей гидрофильную карбаматную группу в цепи C18 (100 x 2,1) мм, 1,7 мкм. Температура колонки (30 +/- 1) °C. Подвижная фаза № 2: смесь ацетонитрила и 0,005 М ортофосфорной кислоты в соотношении 20 : 80, по объему. Скорость потока элюента — 0,2 см3/мин. Рабочая длина волны УФ-детектора — 245 нм. Объем вводимой пробы — 10 мм3. Время удерживания 4-бромфенилмочевины — (9,4 +/- 0,1) мин.

10. Обработка результатов анализа

Количественное определение проводят методом абсолютной калибровки. Содержание метобромурона или 4-бромфенилмочевины в пробе (Xi, мг/кг) вычисляют по формуле:

X_{i} = \frac{S_{xi} \cdot K_{i} \cdot V}{P} , где

Sxi — площадь пика аналита на хроматограмме испытуемого образца, мм2 (AU);

Ki — градуировочный коэффициент, найденный на стадии построения соответствующей градуировочной зависимости;

V — объем пробы, подготовленной для хроматографического анализа, см3;

P — навеска анализируемого образца, г (аликвота, равная 1 г).

Поскольку содержание метаболита не нормируется, общее содержание действующего вещества в сумме с метаболитом — в эквиваленте действующего вещества с учетом коэффициента, определяемого по соотношению молекулярных масс соединений (k = 259/215), рассчитывается по формуле:

X = \frac{S_{x1} \cdot K_{1} \cdot V}{P} + \frac{S_{x2} \cdot K_{2} \cdot V \cdot k}{P}

Содержание остаточных количеств вычисляют как среднее из двух параллельных определений.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартные растворы с концентрацией 1,0 мкг/см3, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

11. Проверка приемлемости результатов параллельных определений

За результат анализа принимают среднее арифметическое результатов двух параллельных определений, расхождение между которыми не превышает предела повторяемости (1):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq r , где (1)

X₁, X₂ - результаты параллельных определений, мг/кг;

r — значение предела повторяемости (r = 2.8\sigma_{r}) .

При невыполнении условия (1) выясняют причины превышения предела повторяемости, устраняют их и вновь выполняют анализ.

12. Оформление результатов

Результат анализа представляют в виде:

(\overline{X} \pm \Delta)\text{мг}/\text{кг} при вероятности P = 0,95, где

\overline{X} — среднее арифметическое результатов определений, признанных приемлемыми, мг/кг;

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг;

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

В случае, если содержание компонента менее нижней границы диапазона определяемых концентраций, результат анализа представляют в виде: «содержание вещества в пробе „менее нижней границы определения“ (например: менее 0,05 мг/кг <>, где <> — 0,05 мг/кг — предел обнаружения метобромурона в растительном масле).»

13. Контроль качества результатов измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-1 — 6-02 «Точность (правильность и прецизионность) методов и результатов измерений».

13.1. Стабильность результатов измерений контролируют перед проведением измерений, анализируя один из градуировочных растворов.

13.2. Плановый внутрилабораторный оперативный контроль процедуры выполнения анализа проводится с применением метода добавок.

Величина добавки Cд должна удовлетворять условию:

C_{\text{д}} = \Delta_{\text{л},X} + \Delta_{\text{л},X\prime} , где

\pm \Delta_{\text{л},X}( \pm \Delta_{\text{л},X\prime}) — характеристика погрешности (абсолютная погрешность) результатов анализа, соответствующая содержанию компонента в испытуемом образце (расчетному значению содержания компонента в образце с добавкой соответственно), мг/кг; при этом:

\Delta_{\text{л}} = \pm 0,84\Delta , где

\Delta — граница абсолютной погрешности, мг/кг:

\Delta = \frac{\delta \cdot X}{100} , где

\delta — граница относительной погрешности методики (показатель точности в соответствии с диапазоном концентраций), %.

Результат контроля процедуры Кк рассчитывают по формуле:

Кк = X' — X - Cд, где

X', X, Cд — среднее арифметическое результатов параллельных определений (признанных приемлемыми по п. 11) содержания компонента в образце с добавкой, испытуемом образце, концентрация добавки соответственно, мг/кг.

Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

\text{К } = \sqrt{\Delta_{\text{л},X\prime}^{2} + \Delta_{\text{л},X}^{2}} (2)

Проводят сопоставление результата контроля процедуры (Кк) с нормативом контроля (К).

Если результат контроля процедуры удовлетворяет условию

|Кк| <= К, (3)

процедуру анализа признают удовлетворительной.

При невыполнении условия (3) процедуру контроля повторяют. При повторном невыполнении условия (3) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры к их устранению.

13.3 Проверка приемлемости результатов измерений, полученных в условиях воспроизводимости:

Расхождение между результатами измерений, выполненных в двух разных лабораториях, не должно превышать предел воспроизводимости (R):

\frac{2 \cdot |X_{1} - X_{2}| \cdot 100}{(X_{1} + X_{2})} \leq R , где (4)

X₁, X₂ - результаты измерений в двух разных лабораториях, мг/кг;

R — предел воспроизводимости (в соответствии с диапазоном концентраций), %.