---
title: "\"МУК 4.1.3158-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания\""
number: "МУК 4.1.3158-14"
status: действует
canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-1-3158-14"
---

## "МУК 4.1.3158-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"

# "МУК 4.1.3158-14. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания"

(утв. Роспотребнадзором 24.02.2014)


<div align="right">

<a id="p100001"></a>Утверждаю<br>
Вр.и.о. руководителя<br>
Федеральной службы<br>
по надзору в сфере<br>
защиты прав потребителей<br>
и благополучия человека,<br>
Главного государственного<br>
санитарного врача<br>
Российской Федерации<br>
**А.Ю.ПОПОВА**

</div>

24 февраля 2014 года


#### <a id="p100002"></a>4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ


<a id="p100003"></a>**ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АКРОЛЕИНА В КРОВИ**
**МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ**

<a id="p100004"></a>**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.3158-14**

1. <a id="p100005"></a>Разработаны: ФБУН "Федеральный научный центр медико-профилактических технологий управления рисками здоровью населения" (Т.С.Уланова, Н.В.Зайцева, Т.Д.Карнажицкая, Е.О.Пшеничникова).
2. <a id="p100006"></a>Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (протокол от 26 декабря 2013 г. N 4).
3. <a id="p100007"></a>Утверждены вр.и.о. руководителя Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главного государственного санитарного врача Российской Федерации А.Ю.Поповой 24 февраля 2014 г.
4. <a id="p100008"></a>Введены впервые.
<a id="p100009"></a>Свидетельство о метрологической аттестации N 88-16374-008-01/00076-2013 от 08.02.2013.

<div align="center">

1. <a id="p100010"></a>Назначение и область применения

</div>


<a id="p100011"></a>1.1. Настоящие методические указания устанавливают порядок применения метода высокоэффективной жидкостной хроматографии для измерения массовой концентрации акролеина в крови в диапазоне концентраций от 0,1 до 5,0 мг/куб. дм.
<a id="p100012"></a>1.2. Методические указания по измерению массовой концентрации акролеина в крови методом высокоэффективной жидкостной хроматографии предназначены для использования территориальными органами и службами Роспотребнадзора, лечебными и научными учреждениями, осуществляющими деятельность в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды.

#### <a id="p100013"></a>1.3 Методические указания носят рекомендательный характер.


<div align="center">

2. <a id="p100014"></a>Физико-химические и токсикологические свойства

</div>


<a id="p100015"></a>Акролеин (акриловый альдегид, этиленальдегид, 2-пропеналь) - бесцветная, легко воспламеняющаяся слезоточивая жидкость с резким запахом. Выделяется в атмосферный воздух с отработавшими газами автотранспорта, в процессе горения органического топлива, при приготовлении пищи (жарение, копчение). Относится к опасным веществам. Гигиенический норматив в Российской Федерации не установлен.


| <a id="p100016"></a>Регистрационный номер CAS | <a id="p100017"></a>107-02-8 |
| --- | --- |
| <a id="p100018"></a>Формула | <a id="p100019"></a>$\text{С}_{3}\text{Н}_{4}\text{О}$ |
| <a id="p100020"></a>Молекулярная масса | <a id="p100021"></a>56,06 |
| <a id="p100022"></a>$\text{Т}_{\text{пл}.}$ , °C | <a id="p100023"></a>-87,7 |
| <a id="p100024"></a>$T_{\text{кип}.}$ , °C | <a id="p100025"></a>52,7 |
| <a id="p100026"></a>Плотность при 20 °С, г/куб. см | <a id="p100027"></a>0,8389 |
| <a id="p100028"></a>Растворимость в воде при 20 °С, % | <a id="p100029"></a>20,85 |
| <a id="p100030"></a>Растворим | <a id="p100031"></a>в этаноле, ацетонитриле, ацетоне, диэтиловом эфире |
| <a id="p100032"></a>Давление насыщенных паров при 20 °С, кПа | <a id="p100033"></a>29 |
| <a id="p100034"></a>ПДК, мг/куб. дм | <a id="p100035"></a>отсутствует |
| <a id="p100036"></a>Класс опасности | <a id="p100037"></a>2 |


<a id="p100038"></a>Краткая токсикологическая характеристика. Обладает выраженным раздражающим, общетоксическим, аллергенным, мутагенным действием. Угнетает синтез ДНК и клеточное деление, ингибирует ДНК-полимеразу. Оказывает цитотоксическое действие.

<div align="center">

3. <a id="p100039"></a>Метрологические характеристики методики выполнения измерений

<a id="p100040"></a>При соблюдении всех регламентированных условий и проведении анализа в точном соответствии с данной методикой значения погрешности (и ее составляющих) результатов измерений не превышают значений, приведенных в табл. 1.

<a id="p100041"></a>Таблица 1

<a id="p100042"></a>Диапазон измерений, значения точности<br>
(правильности и прецизионности) методики

</div>



| <a id="p100043"></a>Объект измерения | <a id="p100044"></a>Диапазон измерений массовой концентрации акролеина, мг/куб. дм | <a id="p100045"></a>Показатель точности (границы относительной погрешности), +/- $\delta$ , % при<br>Р = 0,95 | <a id="p100046"></a>Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), $\sigma_{r}$ , % | <a id="p100047"></a>Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), $\sigma_{R}$ , % | <a id="p100048"></a>Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории), r, % (при P = 0,95 n = 2) |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100049"></a>Кровь | <a id="p100050"></a>0,1-5 | <a id="p100051"></a>30 | <a id="p100052"></a>11 | <a id="p100053"></a>15 | <a id="p100054"></a>31 |


<div align="center">

<a id="p100055"></a>Значения показателя точности используют при:<br>
- <a id="p100056"></a>оформлении результатов измерений, выдаваемых лабораторией;<br>
- <a id="p100057"></a>оценке деятельности лабораторий на качество проведения измерений;

</div>

- <a id="p100058"></a>оценке возможности использования результатов измерений при реализации методики измерений в конкретной лаборатории.

4. <a id="p100059"></a>Метод измерения

<a id="p100060"></a>Измерение массовой концентрации акролеина в крови основано на взаимодействии акролеина с 3-аминофенолом с образованием производного 7-гидроксихинолина и его анализе методом высокоэффективной жидкостной хроматографии на обращенной фазе и флуориметрическом детектировании.
<a id="p100061"></a>Нижний предел измерения в анализируемом объеме пробы - 2 нг. Средняя полнота извлечения свободного акролеина из крови - 84%.

5. <a id="p100062"></a>Средства измерений, вспомогательные устройства,

<div align="center">

реактивы и материалы

</div>



#### <a id="p100063"></a>5.1 Средства измерений



| <a id="p100064"></a>Жидкостный хроматограф с флуориметрическим детектором и градиентным насосом, смешивающим два компонента |  |
| --- | --- |
| <a id="p100065"></a>Весы лабораторные равноплечие второго класса точности; наибольший предел взвешивания 200 г, диапазон взвешивания по шкале мг от 0 до 100 мг, цена деления делительного устройства - 0,05 мг, погрешность взвешивания по шкале мг +/- 0,15 мг | <a id="p100066"></a>ГОСТ Р 53228-2008 |
| <a id="p100067"></a>Гири $\text{Г}_{2} - 210$ | <a id="p100068"></a>ГОСТ 7328-2001 |
| <a id="p100069"></a>Пипетки мерные градуированные 1-2-1-1, 1-2-1-5, 1-2-1-10 | <a id="p100070"></a>ГОСТ 29227-91 |
| <a id="p100071"></a>Шприц хроматографический жидкостный емкостью 10 и 50 куб. мм с ценой деления 5 куб. мм и погрешностью измерения 1% |  |
| <a id="p100072"></a>Колбы мерные 2-50-2, 2-100-2 | <a id="p100073"></a>ГОСТ 1770-74 |
| <a id="p100074"></a>Пробирки стеклянные мерные П-2-10-14/23 ХС | <a id="p100075"></a>ГОСТ 1770-74 |
| <a id="p100076"></a>Цилиндры мерные 2-100-1 с пришлифованной пробкой | <a id="p100077"></a>ГОСТ 1770-74 |
| <a id="p100078"></a>Микродозаторы, с переменным объемом 100-1000 куб. мм, 1000-5000 куб. мм и пределом допускаемой погрешности измерения не более +/- 2%<br>рН-метр лабораторный (основная погрешность измерения не более +/- 0,05 единиц pH) |  |
| <a id="p100079"></a>Секундомер механический | <a id="p100080"></a>ГОСТ 5072-72 |


<a id="p100081"></a>*Примечание.* Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.


#### <a id="p100082"></a>5.2 Реактивы



| <a id="p100083"></a>Акролеин, аналитический стандарт с содержанием основного компонента не менее 99,0% |  |
| --- | --- |
| <a id="p100084"></a>Вода дистиллированная | <a id="p100085"></a>ГОСТ 6709-72 |
| <a id="p100086"></a>Ацетонитрил для хроматографии, хч | <a id="p100087"></a>ТУ 6-09-14-2167-84 |
| <a id="p100088"></a>Метанол (метиловый спирт), хч | <a id="p100089"></a>ГОСТ 6995-77 |
| <a id="p100090"></a>Этанол (этиловый спирт) ректификованный | <a id="p100091"></a>[ГОСТ Р 51652-2000](https://bukva.ai/docs/gost-r-51652-2000) |
| <a id="p100092"></a>Кислота хлористоводородная, ампулы для приготовления 0,1 н раствора, Стандарт-титр |  |
| <a id="p100093"></a>Кислота ортофосфорная, хч | <a id="p100094"></a>ГОСТ 6552-80 |
| <a id="p100095"></a>Кислота серная, осч | <a id="p100096"></a>[ГОСТ 14262-78](https://bukva.ai/docs/standart-gost-14262-78) |
| <a id="p100097"></a>3-Аминофенол для синтеза (имп.), чистота не менее 99,0% |  |
| <a id="p100098"></a>Железа (III) сульфат (9-водный), (имп.), содержание иона железа (III) 21-23% | <a id="p100099"></a>ТУ 2141-002-58318296-2005 |
| <a id="p100100"></a>Гидроксиламина гидрохлорид, чистый<br>7-гидроксихинолин, чистота не менее 99,0% | <a id="p100101"></a>[ГОСТ 5456-79](https://bukva.ai/docs/gost-5456-79) |
| <a id="p100102"></a>Магний серно-кислый 7-водный, хч | <a id="p100103"></a>[ГОСТ 4523-77](https://bukva.ai/docs/gost-4523-77) |
| <a id="p100104"></a>Раствор гепарина в ампулах (5000 ед. в 1 куб. см) | <a id="p100105"></a>ФС 42-1327-99 |


<a id="p100106"></a>*Примечание.* Допускается использование реактивов с более высокой квалификацией.


#### <a id="p100107"></a>5.3 Вспомогательные устройства и материалы



| <a id="p100108"></a>Хроматографическая колонка металлическая, длиной 150 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми полярными группами $C_{18}$ , зернение 5 мкм |  |
| --- | --- |
| <a id="p100109"></a>Предколонка, длиной 12,5 мм, внутренним диаметром 2,1 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом с привитыми полярными группами $C_{18}$ , зернение 5 мкм |  |
| <a id="p100110"></a>Сорбент для хроматографии $C_{18}$ |  |
| <a id="p100111"></a>Шкаф сушильный электрический с диапазоном рабочих температур от 50 до 200 °С | <a id="p100112"></a>ТУ 16.531.743-83 |
| <a id="p100113"></a>Центрифуга лабораторная с частотой вращения ротора от 500 до 2700 об./мин. для пробирок вместимостью 2 куб. см |  |
| <a id="p100114"></a>Устройство очистки воды, позволяющее получать воду чистоты "для жидкостной хроматографии" |  |
| <a id="p100115"></a>Баня водяная лабораторная от 15 до 100 °С |  |
| <a id="p100116"></a>Стаканы В-1-50-ТС, В-1-600-ТС вместимостью 50 и 600 куб. см | <a id="p100117"></a>ГОСТ 25336-82 |
| <a id="p100118"></a>Мешалка магнитная от 120 до 1500 об./мин. |  |
| <a id="p100119"></a>Пробирки из полипропилена конические градуированные вместимостью 15 куб. см |  |
| <a id="p100120"></a>Шприц медицинский одноразовый типа Люэр вместимостью 5 куб. см | <a id="p100121"></a>ГОСТ Р ИСО 7886-2009 |
| <a id="p100122"></a>Фильтр мембранный целлюлозно-ацетатный с размером пор 0,45 мкм |  |


<div align="center">

<a id="p100123"></a>*Примечание.* Допускается использование других вспомогательных устройств и материалов аналогичного назначения, технические характеристики которых не уступают указанным.

6. <a id="p100124"></a>Требования безопасности

<a id="p100125"></a>6.1. При выполнении измерений необходимо соблюдать требования техники безопасности при работе с химическими реактивами по ГОСТ 12.1.007-76, требования электробезопасности при работе с электроустановками по ГОСТ 12.1.019-2009, а также требования, изложенные в технической документации на эксплуатацию жидкостного хроматографа.<br>
<a id="p100126"></a>6.2. Помещение лаборатории должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией и соответствовать требованиям пожарной безопасности по ГОСТ 12.1.004-91 и иметь средства пожаротушения по ГОСТ 12.4.009-83.<br>
<a id="p100127"></a>6.3. Содержание вредных веществ в воздухе рабочей зоны не должно превышать ПДК (ОБУВ), установленных ГН 2.2.5.1313-03 и 2.2.5.2308-07.

7. <a id="p100128"></a>Требования к квалификации оператора

<a id="p100129"></a>К выполнению измерений и обработке их результатов допускают лиц, имеющих квалификацию не ниже инженера-химика с опытом работы на жидкостном хроматографе, освоивших метод измерений и получивших удовлетворительные результаты оперативного контроля процедуры измерений.

8. <a id="p100130"></a>Условия измерений

<a id="p100131"></a>При приготовлении градуировочных растворов и подготовке проб к анализу соблюдают следующие условия:<br>
    - <a id="p100132"></a>температура окружающего воздуха   (22 +/- 2) °С;<br>
    - <a id="p100133"></a>атмосферное давление              от 84 до 106 кПа;<br>
    - <a id="p100134"></a>относительная влажность воздуха   от 30 до 80%.<br>
<a id="p100135"></a>Выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

9. <a id="p100136"></a>Подготовка к выполнению измерений

</div>


<a id="p100137"></a>Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, приготовление растворов, подготовка хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики.


#### <a id="p100138"></a>9.1 Подготовка посуды


<a id="p100139"></a>Используемую посуду вымыть мыльным раствором, промыть проточной водопроводной водой, многократно ополоснуть дистиллированной водой и высушить при температуре 50 °С.


#### <a id="p100140"></a>9.2 Приготовление растворов


<a id="p100141"></a>9.2.1. Раствор для элюирования А. В стакан вместимостью 600 куб. см вносят 500 куб. см дистиллированной воды, устанавливают на магнитную мешалку, помещают в раствор электроды рН-метра, небольшими порциями с помощью стеклянной пипетки вносят концентрированную фосфорную кислоту при перемешивании до установления рН 2,5. Срок хранения раствора 5 дней.
<a id="p100142"></a>9.2.2. Раствор для элюирования В. В мерный цилиндр 2-100-1 помещают 25 куб. см метанола, доводят до 100 куб. см ацетонитрилом, закрывают пришлифованной стеклянной пробкой, тщательно перемешивают. Срок хранения раствора 5 дней.
<a id="p100143"></a>9.2.3. Элюент для хроматографии. Состав элюента задают на двух каналах насоса: смешивают раствор для элюирования А и раствор для элюирования В в соотношении 94: 6% (объемная доля).
<a id="p100144"></a>9.2.4. Раствор 3-аминофенола, молярная концентрация 0,023 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают навеску 0,1255 г 3-аминофенола, растворяют в 40-45 куб. см дистиллированной воды при температуре 40-50 °С, остужают до комнатной температуры, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.
<a id="p100145"></a>9.2.5. Раствор гидроксиламина соляно-кислого, молярная концентрация 0,043 моль/куб. дм. В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают навеску 0,1494 г гидроксиламина соляно-кислого, растворяют в 40-45 куб. см дистиллированной воды, доводят дистиллированной водой до метки. Срок хранения раствора 30 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.
<a id="p100146"></a>9.2.6. Раствор железа (III) сульфата, массовая концентрация 2,8 мг/куб. см. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают навеску 0,28 г железа (III) сульфата, девятиводного, растворяют в 50-60 куб. см дистиллированной воды, добавляют 1 куб. см серной кислоты концентрированной, доводят до метки дистиллированной водой. Срок хранения раствора не ограничен.
<a id="p100147"></a>9.2.7. Раствор серной кислоты в дистиллированной воде, 16% (объемная доля). В термостойкий стакан вместимостью 50 куб. см помещают 10 куб. см дистиллированной воды и 2 куб. см серной кислоты концентрированной. Осторожно перемешивают, остужают до комнатной температуры. Срок хранения раствора не ограничен.
<a id="p100148"></a>9.2.8. Исходный раствор акролеина (раствор 1). В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 40-45 куб. см спирта этилового, 50 куб. мм чистого акролеина (с учетом плотности 42 мг) и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в исходном растворе - 0,84 мг/куб. см. Срок хранения раствора 14 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.
<a id="p100149"></a>9.2.9. Раствор акролеина для градуировки (раствор 2). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 40-45 куб. см спирта этилового, 0,6 куб. см исходного раствора акролеина и доводят этиловым спиртом до метки. Массовая концентрация акролеина в разбавленном растворе составляет 0,005 мг/куб. см. Используют свежеприготовленный раствор.
<a id="p100150"></a>9.2.10. Раствор 7-гидроксихинолина для идентификации продукта реакции акролеина с 3-аминофенолом. В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают навеску 0,0100 г 7-гидроксихинолина, растворяют в 5-6 мл раствора 0,1 Н хлористо-водородной кислоты, доводят до метки дистиллированной водой. Концентрация 7-гидроксихинолина в растворе составляет 100 мкг/куб. см. Срок хранения раствора 60 дней в холодильнике при температуре 4-6 °С.


#### <a id="p100151"></a>9.3 Подготовка хроматографической колонки


<a id="p100152"></a>Колонку устанавливают в хроматограф, подают ацетонитрил со скоростью 0,2 куб. см/мин. в течение 0,5 ч., затем подают элюент состава: 94% (объемная доля) раствора для элюирования А, 6% (объемная доля) раствора для элюирования В со скоростью 0,2 куб. см/мин. до установления равновесия колонки, которое определяют по стабильности нулевой линии детектора. Проводят холостую разгонку с установлением ступеней градиента: 6 мин. - 6% раствора В, 13 мин. - 8% раствора В, 17 мин. - 10% раствора В, 22 мин. - 20% раствора В с увеличением скорости подвижной фазы до 0,5 куб. см/мин., 36 мин. - остановка разгонки.


#### <a id="p100153"></a>9.4 Построение градуировочной характеристики


<a id="p100154"></a>9.4.1. Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика 7-гидроксихинолина (дериват акролеина) от массовой концентрации акролеина в крови устанавливают методом абсолютной градуировки по трем сериям растворов. Каждую серию, состоящую из шести градуировочных растворов, готовят из раствора акролеина для градуировки N 2, приготовленного по [п. 9.2.9](#p100149).
<a id="p100155"></a>9.4.2. Градуировочные растворы готовят в стеклянных пробирках с притертой пробкой вместимостью 10 куб. см. Для этого в каждую пробирку вносят 0,25 куб. см цельной крови с гепарином, раствор акролеина для градуировки и этанол в соответствии с табл. 2. В соответствии с [п. 11](#p100212) проводят анализ холостой пробы. При наличии анализируемого вещества в холостой пробе вычитают его фоновое содержание при построении градуировки.

<div align="center">

<a id="p100156"></a>Таблица 2

</div>


<a id="p100157"></a>Градуировочные растворы для определения акролеина в крови


| <a id="p100158"></a>Номер раствора | <a id="p100159"></a>1 | <a id="p100160"></a>2 | <a id="p100161"></a>3 | <a id="p100162"></a>4 | <a id="p100163"></a>5 | <a id="p100164"></a>6 |
| --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100165"></a>Объем раствора акролеина для градуировки (С = 0,005 мг/куб. см), куб. см | <a id="p100166"></a>0,005 | <a id="p100167"></a>0,015 | <a id="p100168"></a>0,035 | <a id="p100169"></a>0,050 | <a id="p100170"></a>0,125 | <a id="p100171"></a>0,25 |
| <a id="p100172"></a>Объем этанола, куб. см | <a id="p100173"></a>0,245 | <a id="p100174"></a>0,435 | <a id="p100175"></a>0,215 | <a id="p100176"></a>0,200 | <a id="p100177"></a>0,125 | <a id="p100178"></a>0 |
| <a id="p100179"></a>Массовая концентрация акролеина в крови, мг/куб.дм | <a id="p100180"></a>0,1 | <a id="p100181"></a>0,3 | <a id="p100182"></a>0,7 | <a id="p100183"></a>1,0 | <a id="p100184"></a>2,5 | <a id="p100185"></a>5,0 |


<a id="p100186"></a>Проводят реакцию дериватизации для перевода акролеина в форму производного (7-гидроксихинолина). В каждую пробирку с градуировочным раствором добавляют 2 куб. см раствора 3-аминофенола, 2 куб. см раствора гидроксиламина соляно-кислого, 0,1 куб. см раствора сульфата железа, 0,2 куб. см раствора серной кислоты. Пробирки закрывают пробкой и тщательно перемешивают содержимое интенсивным встряхиванием. Пробирки нагревают на водяной бане 15 мин. при температуре 100 °С, периодически открывая пробки. После охлаждения очищают прореагировавшую смесь способом твердофазной экстракции. Для этого в пробирку добавляют 0,35 г магния серно-кислого 7-водного и 0,05 г сорбента для хроматографии $\text{С}_{18}$ , интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин., переносят в конические пробирки из полипропилена и центрифугируют 10 мин. со скоростью 2000 об./мин. Надосадочный слой отбирают и пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский типа Люэр, фильтрат собирают в виалу, анализируют 20 куб. мм экстракта в рабочем режиме хроматографа.

##### <a id="p100187"></a>9.4.3 Режим работы хроматографа:

 - <a id="p100188"></a>колонка 4,6 мм х 150 мм, заполненная сорбентом $\text{С}_{18}$ ;
    - <a id="p100189"></a>элюент: 94% раствора А, 6% раствора В;
    - <a id="p100190"></a>градиент элюирования: 6 мин. - 6% раствора В, 13 мин. - 8% раствора В,
17 мин. - 10%  раствора  В,  22 мин. - 20% раствора  В, 30 мин. - остановка

<div align="center">

разгонки, время после анализа - 6 мин.;<br>
    - <a id="p100191"></a>скорость движения элюента        0,2 куб. см/мин.;<br>
    - <a id="p100192"></a>флуориметрический детектор:

</div>

    - <a id="p100193"></a>длина волны возбуждения          243 нм
    - <a id="p100194"></a>длина волны эмиссии              501 нм
    - <a id="p100195"></a>температура термостата колонки   27 °С.
<a id="p100196"></a>Градуировочный коэффициент рассчитывают по формуле:

<div align="center">

<a id="p100197"></a> $\text{К } = \frac{\sum_{i = 1}^{n} C_{i}/S_{i}}{n}$ , где:

</div>


<a id="p100198"></a> $C_{i}$ - массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе, мг/куб. дм;
<a id="p100199"></a> $S_{i}$ - среднее значение трех измерений площади пика акролеина в форме его производного (7-гидроксихинолина), полученное при анализе i-го градуировочного раствора, условные единицы (усл. ед.);

<div align="right">

<a id="p100200"></a>n - количество градуировочных смесей (n = 6).<br>
<a id="p100201"></a>Градуировку проводят при смене реактивов или разделительной колонки.<br>
<a id="p100202"></a>9.4.4. Контроль стабильности градуировочной характеристики. Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят 1 раз в квартал в анализируемой серии измерений. Образцами для контроля стабильности являются градуировочные растворы, выбранные таким образом, чтобы массовая концентрация акролеина соответствовала нижней, верхней границам и середине диапазона построения градуировочной характеристики. Градуировка признается стабильной при выполнении условия:

</div>


<div align="center">

<a id="p100203"></a> $C_{m} - C \leq 0,15 \cdot C$ , где: (1)

<a id="p100204"></a>C - заданная массовая концентрация акролеина в градуировочном растворе;

</div>

<a id="p100205"></a> $C_{m}$ - результат измерения массовой концентрации акролеина в образце для градуировки.
<a id="p100206"></a>При невыполнении условия (1) стабильности градуировочной характеристики эксперимент повторяют с другим градуировочным раствором. При повторном невыполнении условия стабильности градуировочной характеристики выясняют и устраняют причины нестабильности градуировочной характеристики.

<div align="center">

10. <a id="p100207"></a>Выполнение измерений

</div>



#### <a id="p100208"></a>10.1 Отбор проб


<div align="center">

<a id="p100209"></a>Отбирают пробу крови объемом 1 куб. см в пробирку, содержащую 0,025 куб. см гепарина. Отобранные пробы хранят в холодильнике при температуре 4-6 °С, срок хранения проб 8 ч.

</div>



#### <a id="p100210"></a>10.2 Порядок выполнения измерений


<a id="p100211"></a>Выполняют два параллельных измерения массовой концентрации акролеина в образце крови. Для этого в стеклянные пробирки с притертой пробкой вместимостью 10 куб. см вносят по 0,25 куб. см пробы крови, добавляют 0,25 куб. см этанола, 2 куб. см раствора 3-аминофенола, 2 куб. см раствора гидроксиламина соляно-кислого, 0,1 куб. см раствора сульфата железа, 0,2 куб. см раствора серной кислоты, закрывают пробкой. Смесь интенсивно встряхивают, нагревают на водяной бане 15 мин. при температуре 100 °С, периодически открывая пробирки. После охлаждения очищают прореагировавшую смесь способом твердофазной экстракции. Для этого в каждую пробирку добавляют 0,35 г магния серно-кислого 7-водного и 0,15 г сорбента для хроматографии $C_{18}$ , интенсивно встряхивают смесь в течение 1 мин., переносят в конические пробирки из полипропилена и центрифугируют 10 мин. со скоростью 2000 об./мин. Надосадочный слой отбирают и пропускают через пористый фильтр (размер пор 0,45 мкм), используя шприц медицинский типа Люэр, фильтрат собирают в виалу, анализируют 20 куб. мм экстракта в рабочем режиме хроматографа.

11. <a id="p100212"></a>Обработка результатов измерений


#### <a id="p100213"></a>11.1 Массовую концентрацию акролеина в крови (мг/куб. дм) вычисляют по формуле:


<a id="p100214"></a> $\text{С } = S_{i} \cdot \text{К}$ , где:

<a id="p100215"></a>С - массовая концентрация акролеина в анализируемой пробе, мг/куб. дм;
<a id="p100216"></a> $S_{i}$ - площадь пика 7-гидроксихинолина на хроматограмме, (усл. ед.);
<a id="p100217"></a>К - градуировочный коэффициент.
<a id="p100218"></a>11.2. За результат измерения $\overline{\text{С}}$ принимают среднее арифметическое значение двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости $\text{С}_{1}$ , $\text{С}_{2}$ (параллельных определений), для которых выполняется условие:

<div align="center">

<a id="p100219"></a> $|\text{С}_{1} - \text{С}_{2}| \leq 0,01 \cdot r \cdot \frac{C_{1} + C_{2}}{2}$ , где: (2)

</div>


<a id="p100220"></a>r - предел повторяемости. Значения предела повторяемости приведены в [табл. 3](#p100225).
<a id="p100221"></a>При невыполнении условия (2) получают дополнительно еще два результата измерений. За результат измерений принимают среднее арифметическое четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, для которых выполняется условие:

<a id="p100222"></a> $|\text{С}_{max,4} - \text{С}_{min,4}| \leq 0,01 \cdot CR_{0,95}(4) \cdot \frac{C_{1} + C_{2} + C_{3} + C_{4}}{4}$ , где: (3)

<div align="center">

<a id="p100223"></a> $CR_{0,95}(4)$ - критический диапазон. Значения критического диапазона приведены в табл. 3.

</div>


<a id="p100224"></a>Таблица 3

<a id="p100225"></a>Значения пределов повторяемости, воспроизводимости и критического

<div align="center">

диапазона при доверительной вероятности Р = 0,95

</div>



| <a id="p100226"></a>Диапазон измерений, мг/куб. дм | <a id="p100227"></a>Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в условиях повторяемости), r, % | <a id="p100228"></a>Критический диапазон (относительное значение допускаемого расхождения между наибольшим и наименьшим четырех результатов измерений, полученных в одной лаборатории в условиях повторяемости), $CR_{0,95}(4)$ , % | <a id="p100229"></a>Предел воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в разных лабораториях), R, % |
| --- | --- | --- | --- |
| <a id="p100230"></a>От 0,1 до 5 вкл. | <a id="p100231"></a>31 | <a id="p100232"></a>40 | <a id="p100233"></a>42 |


<a id="p100234"></a>При невыполнении [условия (3)](#p100222) в качестве окончательного результата измерений принимают медиану четырех результатов измерений, полученных в условиях повторяемости (параллельных определений). Выявляют и устраняют причины, приводящие к невыполнению [условий (2)](#p100219) и [(3)](#p100222).

12. <a id="p100235"></a>Оформление результатов измерений

<a id="p100236"></a>Результат измерений представляют в виде $(\overline{\text{С}} \pm \Delta)$ мг/куб. дм, где:
<a id="p100237"></a> $\overline{C}$ - средний результат измерений, мг/куб. дм;
<a id="p100238"></a> $\Delta$ - характеристика погрешности, мг/куб. дм при Р - 0,95, значение $\Delta$ рассчитывают по формуле: $\Delta = \frac{\delta \cdot C}{100}$ , где $\delta$ - относительное значение характеристики погрешности, % (приведено в [табл. 1](#p100042)).

<div align="center">

13. <a id="p100239"></a>Контроль качества результатов измерений

</div>


<a id="p100240"></a>Контроль качества результатов измерений в пределах лаборатории организуют и проводят путем проведения оперативного контроля процедуры измерений и контроля стабильности результатов измерений в соответствии с ГОСТ Р ИСО 5725-(1-6)-2002 и [РМГ 76-2004](https://bukva.ai/docs/rmg-76-2004).
<a id="p100241"></a>Периодичность получения результатов контрольных процедур и формы их регистрации приводят в документах лаборатории, устанавливающих порядок и содержание работ по организации методов контроля стабильности результатов измерений в пределах лаборатории.


#### <a id="p100242"></a>13.1 Алгоритм оперативного контроля процедуры

<div align="center">

измерений с использованием метода добавок

</div>


<a id="p100243"></a>Оперативный контроль процедуры измерений с использованием метода добавок проводят путем сравнения результата отдельно взятой контрольной процедуры $\text{К}_{\text{к}}$ с нормативом контроля К.
<a id="p100244"></a>Результат контрольной процедуры $\text{К}_{\text{к}}$ рассчитывают по формуле

<a id="p100245"></a> $\text{К}_{\text{к}} = |\overline{\text{С}}' - \overline{\text{С}} - \text{С}_{\delta}|$ , где:

<a id="p100246"></a> $\overline{\text{С}}'$ - результат измерений массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет [условию (2)](#p100219);
<a id="p100247"></a> $\overline{\text{С}}$ - результат измерений массовой концентрации акролеина в исходной пробе - среднее арифметическое двух результатов измерений, полученных в условиях повторяемости, расхождение между которыми удовлетворяет [условию (2)](#p100219).

<div align="center">

<a id="p100248"></a>Норматив контроля К рассчитывают по формуле:

</div>


<a id="p100249"></a> $K = \sqrt{\Delta_{\text{л},\text{С́ср}}^{2} + \Delta_{\text{л},\text{Сср}}^{2}}$ , где:

<a id="p100250"></a> $\Delta_{\text{л},\text{С́}_{\text{ср}}}$ , $\Delta_{\text{л},\text{С}_{\text{ср}}}$ - значения характеристики погрешности результатов измерений, установленные в лаборатории при реализации методики, соответствующие массовой концентрации акролеина в пробе с известной добавкой и в исходной пробе соответственно.
<a id="p100251"></a>*Примечание.* Допустимо характеристику погрешности результатов измерений при внедрении методики в лаборатории устанавливать на основе выражения: $\Delta_{\text{л}} = 0,84 \cdot \Delta$ , с последующим уточнением по мере накопления информации в процессе контроля стабильности результатов измерений.
<a id="p100252"></a>Процедуру измерений признают удовлетворительной при выполнении условия:

<div align="right">

<a id="p100253"></a> $\text{К}_{\text{К}} \leq \text{К}$ (4)

<a id="p100254"></a>При невыполнении условия (4) контрольную процедуру повторяют. При повторном невыполнении условия (4) выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

</div>



#### <a id="p100255"></a>13.2 Алгоритм проведения контрольной процедуры

<div align="center">

при контроле внутрилабораторной прецизионности

</div>


<a id="p100256"></a>Образцами для контроля внутрилабораторной прецизионности являются пробы крови (рабочие пробы).
<a id="p100257"></a>При реализации контрольной процедуры получают два результата контрольных измерений (первичного $\overline{\text{С}_{1}}$ и повторного $\overline{\text{С}_{2}}$ ) массовой концентрации акролеина в условиях внутрилабораторной прецизионности.
<a id="p100258"></a>Результат контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении следующего условия:

<div align="center">

<a id="p100259"></a> $\frac{|\overline{\text{С}_{1}} - \overline{\text{С}_{2}}|}{(\overline{\text{С}_{1}} + \overline{\text{С}_{2}})/2} \cdot 100\% \leq R_{\text{л}}$ , где: (5),

<a id="p100260"></a> $\overline{\text{С}_{1}}$ и $\overline{\text{С}_{2}}$ - результаты измерений массовых концентраций акролеина, полученные в условиях внутрилабораторной прецизионности, т.е. в одной лаборатории в разное время, разными операторами;

</div>

<a id="p100261"></a> $R_{\text{л}}$ , - предел внутрилабораторной прецизионности, значения предела внутрилабораторной прецизионности приведены в табл. 4.
<a id="p100262"></a>При невыполнении [условия (5)](#p100259), процедуру повторяют. При повторном превышении предела внутрилабораторной прецизионности выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и принимают меры по их устранению.

<div align="center">

<a id="p100263"></a>Таблица 4

</div>


<a id="p100264"></a>Значения предела внутрилабораторной прецизионности
при доверительной вероятности Р = 0,95


| <a id="p100265"></a>Диапазон измерений, мг/куб. дм | <a id="p100266"></a>Предел внутрилабораторной прецизионности (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории в разное время, разными операторами), $R_{\text{л}}$ , % |
| --- | --- |
| <a id="p100267"></a>От 0,1 до 5 вкл. | <a id="p100268"></a>34 |



#### <a id="p100269"></a>13.3 Проверка приемлемости результатов измерений,

<div align="center">

получаемых в условиях воспроизводимости

</div>


<a id="p100270"></a>Образцами для проверки приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, являются образцы крови с внесенными в них добавками аттестованного раствора акролеина, подготовленные в соответствии с [п. 9.4.2](#p100155).
<a id="p100271"></a>Проверку приемлемости результатов измерений, получаемых в условиях воспроизводимости, проводят по результатам измерений массовых концентраций акролеина из образцов крови (специально подготовленные образцы крови с внесенными добавками аттестованного раствора акролеина) с одинаковым содержанием акролеина.
<a id="p100272"></a>Результаты измерений признают приемлемыми при выполнении условия

<a id="p100273"></a> $\frac{|\overline{\text{С}_{1}} - \overline{\text{С}_{2}}|}{(\overline{\text{С}_{1}} + \overline{\text{С}_{2}})/2} \cdot 100\% \leq R$ , где: (6)

<a id="p100274"></a> $\overline{\text{С}_{1}}$ и $\overline{\text{С}_{2}}$ - результаты измерений массовых концентраций акролеина (средние арифметические параллельных определений), полученные в условиях воспроизводимости, т.е. в разных лабораториях;

<div align="center">

<a id="p100275"></a>R - предел воспроизводимости, значения предела воспроизводимости приведены в [табл. 3](#p100225).<br>
<a id="p100276"></a>При выполнении [условия (6)](#p100273) результаты измерений, полученные в двух лабораториях, являются совместимыми и может быть рассчитано общее среднее арифметическое результатов измерений, полученных в двух лабораториях.<br>
<a id="p100277"></a>При невыполнении [условия (6)](#p100273) могут быть проведены процедуры проверки приемлемости согласно раздела 5 ГОСТ Р ИСО 5725-6.

</div>




<a id="p100278"></a>

---