--- title: "\"МУК 4.1.2108-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом. Методические указания\"" number: "МУК 4.1.2108-06" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-1-2108-06" --- ## "МУК 4.1.2108-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом. Методические указания" # "МУК 4.1.2108-06. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации фенола в биосредах (кровь) газохроматографическим методом. Методические указания" (утв. Роспотребнадзором 09.08.2006) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). > Документ [введен](#p100002) в действие с 1 сентября 2006 года.
Утверждаю
Руководитель Федеральной
службы по надзору в сфере
защиты прав потребителей
и благополучия человека,
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
9 августа 2006 года
#### 4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ФЕНОЛА В БИОСРЕДАХ** **(КРОВЬ) ГАЗОХРОМАТОГРАФИЧЕСКИМ МЕТОДОМ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.2108-06**
Дата введения
1 сентября 2006 года
## 1. Область применения Методические указания по определению концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, лечебными и научными учреждениями, работающими в области профпатологии и экологии человека, научно-исследовательскими институтами, занимающимися вопросами гигиены окружающей среды. Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием органических соединений в биологических средах у населения, проживающего в районах с повышенным уровнем загрязнения окружающей среды. Методические указания разработаны в соответствии с требованиями [ГОСТ Р 8.563-96](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-329) "ГСОЕИ. Методики выполнения измерений", ГОСТ Р 1.5-92 "ГСС. Общие требования к построению, изложению, оформлению и содержанию стандартов". Методика анализа обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации фенола в крови в диапазоне концентраций: от 0,04 до 0,50 мкг/куб. см с погрешностью 24,8% при доверительной вероятности 0,95. Фенол С Н ОН Молекулярная масса 128,56. 6 5 Фенол - бесцветные кристаллы с характерным запахом, Т - 181,75 °С. кип. Растворим в воде и органических растворителях. Является сильным нейротоксином, поражает печень, почки, проникает через кожу [[1]](#p100143). ## 2. Сущность метода Методика основана на предварительном переводе фенола в метилфениловый эфир в щелочной среде с помощью йодистого метила, концентрировании продукта дериватизации из крови экстракцией диэтиловым эфиром и последующем газохроматографическом анализе экстракта. Необходимость превращения фенола в производные вызвана тем, что прямой газохроматографический анализ фенолов, особенно следовых количеств, осложнен высокой полярностью фенольных соединений и низким давлением их паров. Улучшить газохроматографические свойства фенола можно путем превращения их в менее полярные соединения. Выполнение измерений массовой концентрации фенола проводят методом газовой хроматографии с использованием пламенно-ионизационного детектора. Определению не мешают о-, м-, п-крезолы, ксиленолы в количествах, не превышающих верхнюю границу измеряемой концентрации фенола. Длительность анализа, включая экстракцию пробы, - 20 мин. ## 3. Средства измерений, вспомогательные устройства, материалы и реактивы При выполнении измерений применяют следующие средства измерений, вспомогательные устройства, материалы, реактивы и растворы. Допускается применение других типов средств измерений, вспомогательного оборудования и химреактивов с аналогичными или лучшими метрологическими и техническими характеристиками. ### 3.1. Средства измерений Хроматограф газовый с пламенно-ионизационным детектором Секундомер "Агат" ТУ 25-1894.003-90 Микрошприцы МШ-10 ТУ 2.833.106-00 Весы лабораторные ВЛР-200 аналитические ГОСТ 24104-01 Разновесы Г -210 ГОСТ 7328-01 2 Линейка измерительная ГОСТ 427-75 Лупа измерительная ГОСТ 25706-83 Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770-74 Пипетки вместимостью 5, 10 куб. см ГОСТ 29227-91. ### 3.2. Вспомогательные устройства Хроматографическая колонка стеклянная длиной 3 м и внутренним диаметром 3 мм Бидистиллятор стеклянный БС ТУ 25-11.1592-81 Редуктор кислородный ТУ 26-05-236-73 Центрифуга СМ-4, 3000 об./мин. Бюксы стеклянные ГОСТ 25336-82 Воронка делительная ГОСТ 23932-90. ### 3.3. Материалы Гелий в баллоне ТУ 51-940-80 Водород технический ГОСТ 3022-80 Воздух в баллоне ГОСТ 24484-80. ### 3.4. Реактивы 3% OV-1 на хроматоне N-супер фракции 0,16 - 0,20 мм - неподвижная фаза для заполнения хроматографической колонки Фенол, чда ТУ 6-09-5303-86 Нафталин, хч ТУ 6-09-2200-77 Натрия карбонат, чда ГОСТ 83-79 Метил йодистый ТУ 6-09-3988-83 Диэтиловый эфир мед. ОСТ 84-2006-88 Серная кислота, осч [ГОСТ 14262-78](https://bukva.ai/docs/standart-gost-14262-78) Калия дихромат, чда ГОСТ 4220-75 Ацетон, осч ТУ 2633-039-44493179-00. ### 3.5. Растворы Раствор калия дихромата, 3%-й. ## 4. Требования к безопасности 4.1. При выполнении работ должны быть соблюдены меры противопожарной безопасности в соответствии с требованиями ГОСТ 12.1.004-85 и правила техники безопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.007-76. 4.2. При работе необходимо соблюдать "Правила по технике безопасности и производственной санитарии при работе в химических лабораториях" (утверждены МЗ СССР 20.12.82) и "[Правила](https://bukva.ai/docs/pravila-ustroystva-i-bezopasnoy-ekspluatatsii) устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением" (утверждены Госгортехнадзором СССР 27.11.87). 4.3. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88. 4.4. При выполнении измерений с использованием газового хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора. ## 5. Требования к квалификации оператора К выполнению измерений допускаются лица, имеющие квалификацию не ниже инженера-химика и опыт работы на газовом хроматографе и в химической лаборатории, прошедшие соответствующий инструктаж, освоившие метод в процессе тренировки и уложившиеся в нормативы оперативного контроля при выполнении процедур контроля погрешности. ## 6. Условия измерений #### 6.1 При проведении процессов приготовления растворов и подготовки проб к анализу соблюдают следующие условия: - температура воздуха (20 +/- 5) °С; - атмосферное давление 630 - 800 мм рт. ст.; - влажность воздуха не более 80% при температуре 25 °С. 6.2. Выполнение измерений на газовом хроматографе проводят в условиях, рекомендуемых технической документацией по прибору. ## 7. Подготовка к выполнению измерений Перед выполнением измерений проводят следующие работы: подготовка посуды, подготовка хроматографической колонки, приготовление аттестованных смесей, установление градуировочной характеристики. ### 7.1. Подготовка посуды Используемую посуду замочить на 1 ч в свежеприготовленном 3%-м растворе дихромата калия в серной кислоте (3 г дихромата калия на 100 куб. см концентрированной серной кислоты), отмыть в проточной водопроводной воде, ополоснуть дистиллированной водой и просушить при температуре 120 °С. ### 7.2. Подготовка хроматографической колонки Хроматографическую колонку перед заполнением неподвижной фазой промывают дистиллированной водой, ацетоном и высушивают в токе инертного газа. Заполнение хроматографической колонки насадкой проводят под вакуумом. Концы колонки закрывают стекловатой, устанавливают в хроматограф и, не подключая к детектору, кондиционируют в токе газа-носителя (гелий) с расходом 30 куб. см/мин. при температуре 250 °С в течение 18 ч. После охлаждения колонку подключают к детектору, записывают нулевую линию в рабочем режиме. При отсутствии мешающих влияний колонка готова к работе. ### 7.3. Приготовление аттестованных смесей Для построения градуировочного графика собирают кровь, не содержащую исследуемых компонентов, и готовят серию рабочих аттестованных растворов. Исходный аттестованный раствор фенола. В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг фенола, и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения - 5 ч. Исходный аттестованный раствор нафталина (внутренний стандарт). В мерную колбу объемом 25 куб. см, содержащую ацетон в объеме 15 куб. см, вводят 10 мг нафталина и объем доводят до метки ацетоном. Весовое содержание определяемого вещества в исходном аттестованном растворе составляет 400 мкг/куб. см. Срок хранения - 3 дня. ### 7.4. Установление градуировочной характеристики Градуировочную характеристику устанавливают методом внутреннего стандарта на градуировочных смесях фенола. Строится градуировочный график в координатах: градуировочный коэффициент К - отношение площадей пиков i/ст S / S по 5 сериям аттестованных растворов для градуировки. Каждую серию, i ст состоящую из 5 аттестованных растворов, готовят в мерных колбах объемом 50 куб. см. В мерную колбу объемом 50 куб. см, содержащую бидистиллированную воду в объеме 30 куб. см, вносят по 2 куб. см крови. Затем вносят различные объемы исходных аттестованных растворов фенола и нафталина (внутренний стандарт) согласно табл. 1 и содержимое колбы доводят до метки водой. Далее проводят определение градуировочных коэффициентов фенола по отношению к внутреннему стандарту. Таблица 1
**РАБОЧИЕ АТТЕСТОВАННЫЕ РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ**
**ГРАДУИРОВОЧНЫХ КОЭФФИЦИЕНТОВ ФЕНОЛА ПО ОТНОШЕНИЮ**
**К ВНУТРЕННЕМУ СТАНДАРТУ** | Номер смеси | 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | --- | | Фенол, объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/куб. см), куб. см | 0,005 | 0,010 | 0,015 | 0,020 | 0,040 | 0,050 | 0,060 | | Содержание фенола, мкг/куб. см | 0,04 | 0,08 | 0,12 | 0,16 | 0,32 | 0,40 | 0,48 | | Нафталин, объем исходного аттестованного раствора (400 мкг/куб. см), куб. см | 0,10 | 0,09 | 0,07 | 0,05 | 0,03 | 0,02 | 0,01 | | Содержание нафталина, мкг/куб. см | 0,80 | 0,72 | 0,56 | 0,40 | 0,24 | 0,16 | 0,08 | ### 7.5. Определение градуировочных коэффициентов фенола по отношению к внутреннему стандарту Определение градуировочных коэффициентов. 50 куб. см рабочего аттестованного раствора помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см и добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см йодистого метила и встряхивают в течение 5 мин. для перевода фенола в метилфениловый эфир. Продукт метилирования экстрагируют 10 куб. см диэтилового эфира в течение 10 мин. Подготовленные пробы - экстракты центрифугируют для денатурации белка в течение 10 мин., затем помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см. В хроматографическую колонку через испаритель вводят по 10 куб. мм каждого экстракта рабочего аттестованного раствора и анализируют в условиях: температура термостата колонок - 110 °С; температура испарителя - 170 °С; температура детектора - 170 °С; расход газа-носителя (гелий) - 30 куб. см/мин.; скорость диаграммной ленты - 240 мм/ч; время удерживания метилфенилового эфира - 4 мин. 05 с; нафталина - 6 мин. 45 с. На полученной хроматограмме определяют высоты или площади пиков анализируемого компонента и внутреннего стандарта (нафталин) и по средним результатам из 7 серий рассчитывают градуировочные коэффициенты. Значение градуировочного коэффициента К вычисляют по формуле: i/ст S х Q ст i К = --------, i/ст S х Q i ст где: S , S - площади пиков исследуемого компонента (метилфениловый эфир) и i ст внутреннего стандарта (нафталин), кв. мм; Q , Q - количество исследуемого компонента (метилфениловый эфир) и i ст внутреннего стандарта (нафталин), мкг. По результатам 7 измерений определяется среднее значение градуировочного коэффициента К и строится градуировочный график в i/ст координатах: градуировочный коэффициент - отношение площадей пиков S / S . Градуировку проверяют 1 раз в квартал и при смене партии i ст реактивов. ### 7.6. Отбор проб Отбор проб венозной крови в объеме не менее 10 куб. см производится в тщательно вымытую стеклянную пробирку с притертой пробкой, в которую предварительно добавлено 0,1 куб. см раствора гепарина. Анализ крови проводить сразу или хранить в морозильной камере не более 5 дней. ## 8. Выполнение измерений Пробу крови объемом 2 куб. см доводят до 50 куб. см бидистиллированной водой и помещают в делительную воронку объемом 250 куб. см, добавляют внутренний стандарт - нафталин 0,1 куб. см. Затем добавляют 2 г кристаллического карбоната натрия. Плавным покачиванием перемешивают содержимое воронки, затем вводят в воронку 0,3 куб. см йодистого метила и встряхивают в течение 5 мин. для перевода фенола в метилфениловый эфир. Продукт метилирования экстрагируют 10 куб. см диэтилового эфира в течение 10 мин. Подготовленную пробу - экстракт центрифугируют для денатурации белка в течение 10 мин., затем помещают в бюксу и упаривают под ИК-лампой до 1 куб. см. Полученный экстракт хроматографируют и проводят количественное определение анализируемого соединения в подготовленной пробе методом внутреннего стандарта. Процедуру повторяют аналогично для второго образца и проводят выполнение измерений двух параллельных проб крови. Условия выполнения измерений аналогичные, как при установлении градуировочной характеристики [(п. 7.5)](#p100083). ## 9. Вычисление результатов измерений На хроматограмме рассчитывают площади пиков метилфенилового эфира и внутреннего стандарта (нафталина). За результат измерения принимают среднее арифметическое значение двух параллельных определений Х , Х , расхождение между которыми не должно max min превышать значения предела повторяемости r [(табл. 3)](#p100120). n Расчет концентрации фенола (мкг/куб. см) в биопробе вычисляют по формуле: S х m х К i ст i/ст Х = ----------------, S х V ст где: Х - концентрация фенола в биопробе, мкг/куб. см; S , S - площади пиков метилфенилового эфира и нафталина, кв. мм; i ст К - градуировочный коэффициент (устанавливается по градуировочному i/ст графику - К - S / S ); i/ст i ст m - навеска нафталина, мкг; ст V - объем пробы, куб. см. _ Результат измерений представляют в виде (Х +/- ДЕЛЬТА), мкг/куб. см, где: _ Х - средний результат измерений, мкг/куб. см: Х + Х _ max min Х = -----------, 2 при условии: r Х + Х n max min Х - Х <= --- х -----------, max min 100 2 где: Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений; max Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений; min r - значение предела повторяемости, %; n ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мкг/куб. см, при Р = 0,95, равная: _ дельта х Х ДЕЛЬТА = ----------, 100 где дельта - относительное значение характеристики погрешности, % [(табл. 2)](#p100116). ## 10. Внутренний контроль качества Внутренний контроль качества (ВКК) результатов измерений - повторяемость, внутрилабораторная прецизионность (воспроизводимость), точность - осуществляют с целью получения оперативной информации о качестве измерений и принятия при необходимости оперативных мер по его повышению в соответствии с нормативным документом МИ 2335-2003 "ГСОЕИ. Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа". Методика выполнения измерений обеспечивает получение результатов измерений с погрешностью, не превышающей значений, приведенных в табл. 2 и [3](#p100120).
Таблица 2
**ДИАПАЗОН ИЗМЕРЕНИЙ, ЗНАЧЕНИЯ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ТОЧНОСТИ,**
**ПОВТОРЯЕМОСТИ, ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ**
| Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/куб. см | Показатель повторяемости (относительное среднеквадратическое отклонение повторяемости), сигма , % r | Показатель воспроизводимости (относительное среднеквадратическое отклонение воспроизводимости), сигма R , % _ Xl | Показатель точности (границы относительной погрешности при вероятности Р = 0,95), +/- дельта, % | | --- | --- | --- | --- | | Фенол, от 0,04 до 0,50 вкл. | 10,5 | 10,7 | 24,8 |
Таблица 3
**ЗНАЧЕНИЯ ПРЕДЕЛОВ ПОВТОРЯЕМОСТИ И ВОСПРОИЗВОДИМОСТИ**
**ПРИ ДОВЕРИТЕЛЬНОЙ ВЕРОЯТНОСТИ Р = 0,95**
| Наименование определяемого компонента и диапазон измерений, мкг/куб. см | Предел повторяемости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами параллельных определений), r , % n | Предел внутрилабораторной воспроизводимости (относительное значение допускаемого расхождения между двумя результатами измерений, полученными в одной лаборатории, но в разных условиях), R , % _ Xl | | --- | --- | --- | | Фенол, от 0,04 до 0,50 вкл. | 12,9 | 29,6 | ### 10.1. Контроль стабильности градуировочной характеристики Контроль стабильности градуировочной характеристики проводят раз в квартал в анализируемой серии измерений. Определяют содержание исследуемых соединений в градуировочных растворах, которые соответствуют началу, середине и концу градуировочного интервала. Градуировка признается стабильной, если расхождение между заданным и измеренным значением концентраций не превышает 5%. ### 10.2. Контроль повторяемости Относительное расхождение между результатами двух измерений, выполненных в соответствии с методикой одним оператором при измерении образцов одной и той же рабочей пробы с использованием одних и тех же средств измерений и реактивов в течение возможно минимального интервала времени, не должно превышать значения предела повторяемости r [(табл. 3)](#p100120). n Повторяемость результатов параллельных измерений признают удовлетворительной, если: r Х + Х n max min Х - Х <= --- х -----------, max min 100 2 где: r - значение предела повторяемости, %; n Х - максимальный результат из 2-х параллельных измерений; max Х - минимальный результат из 2-х параллельных измерений. min Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. ### 10.3. Контроль воспроизводимости Внутренний контроль качества воспроизводимости проводят с использованием рабочей пробы. Пробу делят на две равные части и анализируют в соответствии с методикой, максимально варьируя условия проведения анализа (разные операторы, разное время, разные партии реактивов одного типа, разные наборы мерной посуды и т.д.). Воспроизводимость результатов контрольных измерений признают удовлетворительной, если выполняется условие: R _ _ _ Х + Х _ _ Xl 1 2 |Х - Х | <= --- х -------, 1 2 100 2 где: _ Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 1 измерений, мкг/куб. см; _ Х - средний результат анализа рабочей пробы из 2-х параллельных 2 измерений, полученный в других условиях, мкг/куб. см; R - значение предела внутрилабораторной воспроизводимости, % (табл. _ Xl [3](#p100120)). _ _ Расхождение между результатами измерений Х и Х , полученных в разных 1 2 условиях, не должно превышать значений показателя воспроизводимости R при _ Xl доверительной вероятности Р = 0,95, указанных в [табл. 3](#p100120). Если условие не выполняется, эксперимент повторяют. При повторном получении отрицательного результата выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. ### 10.4. Контроль точности Контроль точности с использованием метода добавок состоит в сравнении результата контрольной процедуры, равного разности между результатом _1 контрольного измерения содержания фенола в пробе с известной добавкой (Х ), _ в рабочей пробе без добавки (Х) и величиной добавки С (добавка должна д составлять не менее 40% от содержания фенола в рабочей пробе) с нормативом точности К. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие: _1 _ |Х - Х - С | = К , д k где: _1 Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе с известной добавкой из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см; _ Х - средний результат контрольного измерения содержания определяемого компонента в рабочей пробе из 2-х параллельных измерений, мкг/куб. см; С - величина добавки к пробе, мкг/куб. см; д _____________________________ /дельта _ 2 дельта _1 2 К = 0,84 х \/(------ х Х) + (------ х Х ) . 100 100 Качество контрольной процедуры признают удовлетворительным при выполнении условия: К <= К. k При превышении оперативного контроля погрешности эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, устраняют их и процедуру контроля повторяют. Периодичность ВКК регламентируют согласно руководству по качеству лаборатории. ## Литература 1. Бандман А.Л., Войтенко Г.А., Волкова Н.В. и др. Вредные химические вещества. Углеводороды. Галогенпроизводные углеводородов: Справ. изд./Под ред. В.А. Филова и др. Л.: "Химия", 1990. Методические указания разработаны Пермским научно-исследовательским клиническим институтом детской экопатологии (Т.С. Уланова, Т.В. Нурисламова, Н.А. Попова). ---