МУК 4.1.1899-04. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Атомно-абсорбционное измерение массовых концентраций селена в эритроцитах и плазме крови. Методические указания

(утв. Минздравом России 03.03.2004)

3 марта 2004 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

АТОМНО-АБСОРБЦИОННОЕ ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВЫХ КОНЦЕНТРАЦИЙ СЕЛЕНА В ЭРИТРОЦИТАХ И ПЛАЗМЕ КРОВИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1 мая 2004 года

1. Разработаны: к.х.н. И.Л. Гринштейн, Л.А. Васильева, Л.П. Полякова (РНЦ «Прикладная химия»), к.х.н. В.П. Ипполитова, к.б.н. Е.А. Комракова (Нижегородский НИИ гигиены и профпатологии).

2. Подготовлены творческим коллективом специалистов в составе: Л.М. Безрукавникова, Л.Г. Макеева, Г.В. Муравьева.

3. Рекомендованы к утверждению на совместном заседании группы Главного эксперта Комиссии по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию по проблеме «Лабораторно-инструментальное дело и метрологическое обеспечение» и методбюро п/секции «Промышленно-санитарная химия» Проблемной комиссии «Научные основы медицины труда».

4. Рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Министерстве здравоохранения Российской Федерации.

5. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 3 марта 2004 г.

6. Введены в действие с 1 мая 2004 г.

Введение

Методические указания по определению массовых концентраций химических веществ в биологических средах предназначены для использования в системе Госсанэпиднадзора России, в лечебных и научных учреждениях, работающих в области медицины труда, промышленной экологии и экологии окружающей среды.

Методические указания разработаны с целью обеспечения контроля за содержанием металлов и химических соединений в крови и моче людей, подвергающихся неблагоприятному воздействию вредных производственных и экологических факторов.

В сборнике представлены 5 методик по измерению концентраций 6 металлов и 3 химических соединений в моче и крови. Методики основаны на использовании атомно-абсорбционных и газохроматографических методов анализа.

Включенные в сборник Методические указания разработаны в соответствии с требованиями ГОСТ Р 8.563-96 «Государственная система единства измерений. Методики выполнения измерений», МИ 2336-95 «Характеристики погрешности и результатов количественного химического анализа. Алгоритмы оценивания», МИ 2336-96 «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

1. Область применения

Методические указания устанавливают количественный атомно-абсорбционный анализ плазмы (сыворотки) и эритроцитов крови на содержание селена в диапазоне концентраций 0,001 — 0,02 мкг/куб. см.

2. Характеристика определяемого элемента

Молекулярная масса — 78,96.

Регистрационный номер CAS: 7782-49-2.

Селен — темно-серый, с коричневым оттенком порошок, T 221 пл °С, T 685,3 °С, плотность 4,79. кип

    При  обычной  температуре  селен  устойчив к действию воздуха,
кислорода,  воды,  концентрированной соляной и разбавленной серной

кислот, хорошо растворяется в концентрированной азотной кислоте. С

фтором,  хлором,  бромом  селен  на  холоде образует галогениды, с
водородом  взаимодействует  при  температуре 350 - 400 °С, образуя
селеноводород. При сжигании на воздухе или в кислороде  образуется
оксид  селена  (SeO ),   последний  при  растворении  в  воде дает

               2

селенистую кислоту.

Токсикологическая характеристика определяемого элемента

Селен обладает двойственными свойствами, с одной стороны необходим для жизни, с другой — является токсичным элементом. Селен выполняет роль катализатора ряда ферментативных реакций, участвует в реакции окислительно-восстановительных процессов, является стабилизатором плазматических ядерных и внутриклеточных мембран, обладает антиокислительными свойствами и в некоторых биохимических реакциях заменяет витамин Е.

Механизм токсического действия селена связан с замещением серы в биохимически активных веществах в процессе метаболизма, селен входит в активный центр глютатионпероксидазы. По характеру действия соединения селена несколько напоминают соединения мышьяка, обладают политропным действием. В ряде случаев его воздействие вызывает изменение ткани зубов, заболевания ногтей, желудочно-кишечные нарушения, нервные расстройства. Химическая форма селена может изменяться после контакта с влажными слизистыми оболочками, с потом. Соединения селена более токсичны, чем элементарный селен. Диапазон физиологически оптимальных концентраций селена узок, при уровне ниже минимального предела отмечается увеличение риска возникновения и развития кардиологических и ряда онкологических заболеваний, ослабление антиоксидантной защиты организма. Изменения содержания селена происходят раньше в плазме (сыворотке), чем в эритроцитах.

Нормальной концентрацией селена в плазме (сыворотке) крови считается диапазон от 0,053 до 0,105 мкг/куб. см.

3. Погрешность измерений

Методика обеспечивает выполнение измерений массовой концентрации селена с погрешностью, не превышающей +/- 28%, при доверительной вероятности 0,95.

4. Метод измерений

Метод основан на минерализации проб плазмы и эритроцитов крови концентрированной азотной кислотой и пероксидом водорода, получении летучего гидрида селена, его термическом разложении и последующем измерении резонансного поглощения линии селена на атомно-абсорбционном спектрометре.

Нижний предел измерения концентрации селена в минерализате 0,001 мкг/куб. см.

материалы и реактивы

5.1 Средства измерения, вспомогательные

устройства и материалы

5.1.1. Атомно-абсорбционный спектрометр КВАНТ-2А, ГКНЖ 30.00.000, ТУ 4434-030-29903757-99, оснащенный гидридной приставкой ГРГ-107, ГКНЖ 46.00.000 ТУ 4434-030-29903757-99 и источником излучения для определения селена (лампой полого катода).

5.1.2 Весы лабораторные ВЛР-200, ГОСТ 24104-88Е.

5.1.3. Колбы мерные 2-25-2; 2-50-2; 2-100-2; 2-200-2; 2-250-2, ГОСТ 1770-74Е.

5.1.4. Пипетки мерные 4(5)-1-1; 4(5)-1-2; 4(5)-1-5; 4(5)-1-10; 4(5)-1-20, ГОСТ 29227-91.

5.1.5. Пробирки мерные, вместимостью 10 куб. см, ГОСТ 25336-82Е.

5.1.6. Стаканы Н-1-10 ТХС, Н-1-25; Н-1-100, ГОСТ 25336-82Е.

5.1.7. Колба коническая, вместимостью 100 куб. см, ГОСТ 25366-82Е.

5.1.8. Термометр лабораторный шкальный ТЛ-2; пределы 0 — 200 °С, цена деления 0,1 °С, ГОСТ 215-73Е.

5.1.9 Электроплитка бытовая, ГОСТ 14919-83.

5.1.10. Аналитический реактор для минерализации проб РМП-25, изготовленный НПО «Метрология» г. Казань (аналитический автоклав), МУК 4.1.985-00.

5.1.11 Термостат с автоматической регулировкой температуры до 200 °С.

5.1.12 Ацетилен технический, в баллонах, ГОСТ 5457-75.

5.1.13 Аргон газообразный в баллонах, ТУ 21-12-79.

5.1.14 Часовое стекло.

5.1.15 Центрифуга лабораторная клиническая Опн-3, ТУ 5375-4260-76.

5.2 Реактивы

5.2.1. Вода дистиллированная, ГОСТ 6709-72 или бидистиллированная.

5.2.2 Натрия гидроксид, ГОСТ 4328-77.

5.2.3 Боргидрид натрия (тетрагидроборат натрия), ТУ 1-92-162-90.

5.2.4 Пероксид водорода о.с.ч., ГОСТ 10929-76.

5.2.5. Стандартный образец состава раствора ионов селена с массовой концентрацией селена 1,0 мг/куб. см; ГСО 7779-2000.

5.2.6 Кислота азотная о.с.ч., ГОСТ 11125-73.

5.2.7 Кислота соляная о.с.ч., ГОСТ 14261-77.

5.2.8. Гепарин для инъекций, № сертификата соответствия 50-20-70546 от 29.07.02.

5.2.9 Натрия хлорид, ГОСТ 4233-77.

5.2.10 Мочевина, ГОСТ 6691.

Допускается использование других средств измерений, вспомогательного оборудования, материалов и реактивов с техническими и метрологическими характеристиками и квалификацией не хуже приведенных в разделе.

6. Требования безопасности

6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005-88.

6.2. При выполнении измерений с использованием атомно-абсорбционного спектрометра соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора.

6.3. При работе с газами, находящимися в баллонах под давлением, необходимо соблюдать «Правила устройства и безопасной эксплуатации сосудов, работающих под давлением» (ПБ-10-115-96), утвержденные Постановлением Госгортехнадзора России 18.04.95 № 20 и ГОСТ 12.2.085.

6.4. Реакционный блок ГРГ-107 предохраняют от ударов и резких толчков, не допускают перекосов сосудов в генераторе.

Неиспользованные растворы боргидрида натрия перед утилизацией дезактивируют в вытяжном шкафу избыточным объемом 10%-ного раствора азотной кислоты в толстостенном сосуде объемом 500 куб. см.

7. Требования к квалификации оператора

К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим или среднеспециальным образованием, имеющих опыт работы в химической лаборатории, овладевших персональным компьютером и программным обеспечением на уровне пользователя, техникой эксплуатации пламенно-абсорбционного спектрометра типа «Квант», генератора ртутно-гидридного ГРГ-107.

8. Условия измерений

8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят в нормальных условиях при температуре воздуха (20 +/- 5) °С, атмосферном давлении 84 — 106 кПа и относительной влажности воздуха не более 80%.

9. Подготовка к выполнению измерений

9.1 Отбор, подготовка и хранение проб

Кровь берут из вены в количестве 5 куб. см. В пробирку с кровью вносят 0,1 куб. см гепарина, перемешивают, центрифугируют при 3000 об./мин. в течение 10 мин. Отделяют плазму от эритроцитов. Эритроциты отмывают дважды физиологическим раствором.

Плазму и эритроциты минерализуют отдельно в аналитических автоклавах по следующей схеме: 1 куб. см плазмы и эритроцитов помещают в тефлоновые стаканчики автоклава, добавляют по 1,5 см концентрированной азотной кислоты, через 15 — 20 мин. добавляют 1 куб. см 36%-ного пероксида водорода, закрывают крышкой, герметизируют в металлическом корпусе. Автоклав помещают в термостат, выдерживают при T 190 °С 60 мин., вынимают, охлаждают. В тефлоновый стаканчик добавляют 1,5 куб. см концентрированной соляной кислоты и нагревают при температуре 95 °С в течение 30 мин., охлаждают и добавляют 0,2 куб. см 10%-ного раствора мочевины. Для получения «холостой» пробы в тефлоновый стакан помещают 1 куб. см бидистиллированной воды, 1 каплю гепарина, 1,5 куб. см азотной кислоты, 1 куб. см 36%-ного пероксида водорода и поступают как описано выше. Объем полученного минерализата плазмы, эритроцитов, холостой пробы доводят 6 М раствором соляной кислоты до 10 куб. см. Пробы готовы к измерению. При невозможности немедленного анализа минерализаты хранят в холодильнике. Срок хранения 1 месяц.

9.2 Приготовление растворов

9.2.1 Раствор соляной кислоты молярной концентрации 6 моль/куб. дм.

486 куб. см соляной кислоты d = 1,19 г/куб. см помещают в мерную колбу, вместимостью 1 куб. дм, доводят объем до метки дистиллированной водой.

9.2.2. Стандартный раствор № 1 с массовой концентрацией селена 50 мкг/куб. см. Готовят из стандартного раствора ионов селена с массовой концентрацией 1,0 мг/куб. см. Вскрывают ампулу, содержимое выливают в сухую пробирку, отмеряют пипеткой 5 куб. см, переносят его в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 3 месяца.

9.2.3. Стандартный раствор № 2 с массовой концентрацией 0,5 мкг/куб. см. Готовят из раствора № 1. Отбирают 1 куб. см в коническую колбу, вместимостью 100 куб. см, добавляют 50 куб. см 6 М раствора соляной кислоты, нагревают на плитке в течение 20 — 30 минут, не допуская сильного кипения, переносят полученный раствор в мерную колбу вместимостью 100 куб. см. Коническую колбу из-под раствора несколько раз промывают 6 М раствором соляной кислоты, сливая в мерную колбу. Полученный раствор доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 месяц.

9.2.4. Стандартный раствор № 3 с массовой концентрацией селена 0,020 мкг/куб. см. Готовят из раствора № 2. Пипеткой переносят 4 куб. см в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.

9.2.5. Стандартный раствор № 4 с массовой концентрацией селена 0,010 мкг/куб. см. Готовят из раствора № 2. Отбирают пипеткой 2 куб. см в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.

9.2.6. Стандартный раствор № 5 с массовой концентрацией 0,005 мкг/куб. см. Готовят из раствора № 2. 1 куб. см раствора селена с концентрацией 0,5 мкг/куб. см переносят в мерную колбу вместимостью 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты. Срок хранения 1 день.

9.2.7. Стандартный раствор № 6 с массовой концентрацией селена 0,002 мкг/куб. см. Готовят из раствора № 3 с массовой концентрацией селена 0,020 мкг/куб. см. Отбирают пипеткой 10 куб. см в мерную колбу вместимостью 100 куб. см, доводят 6 М раствором соляной кислоты до метки.

9.2.8. Стандартный раствор № 7 с массовой концентрацией 0,001 мкг/куб. см. Готовят из раствора № 4 с массовой концентрацией селена 0,010 мкг/куб. см. Отбирают 10 куб. см в мерную колбу на 100 куб. см и доводят до метки 6 М раствором соляной кислоты.

9.2.9. Раствор гидроксида натрия с массовой долей — 1%. Готовят растворением 1 г гидроксида натрия в 99 куб. см бидистиллированной воды.

9.2.10. Раствор боргидрида натрия с массовой долей 1,5%. 1,5 г боргидрида натрия растворяют в 98,5 99 куб. см 1%-ного раствора гидроксида натрия. Раствор выдерживают не менее одного часа под часовым стеклом, переливают в полиэтиленовую банку с крышкой. Срок хранения 1 — 2 недели.

9.2.11. Раствор натрия хлорида с массовой концентрацией 0,9% (физиологический раствор). Готовят растворением 0,9 г натрия хлорида в 99,1 99 куб. см бидистиллированной воды.

9.3 Подготовка к работе спектрометра

и гибридной приставки ГРГ-107

Установить при выключенном приборе спектральную лампу на селен.

Открыть вентиль воздушной магистрали.

Открыть вентиль на баллоне с горючим газом.

Установить с помощью редукторов, необходимое давление для ацетилена 0,12 — 0,18 Мпа (1,2 — 1,8 атм.); для аргона и воздуха 3 — 4 атм.

Подготовить к работе ртутно-гидридную приставку в соответствии с руководством по эксплуатации ГКНЖ 46.00.000 РЭ, генератор ртутно-гидридный ГРГ-107.

Включить компьютер и произвести запуск компьютерной программы.

Включить кнопку «Сеть» и нажать кнопку «Сброс» на передней панели спектрометра.

С помощью компьютерной программы загрузить выбранную методику на селен. Программа автоматически установит значения параметров прибора (токов спектральных ламп, напряжение питания ФЭУ).

После выхода в графический экран добиться максимального значения интенсивности в канале лампы полого катода селена (за счет уточнения длины волны, юстировки спектральных ламп).

Оставаясь в графическом экране, произвести, в случае необходимости, корректировку считанных из методики значений токов спектральных ламп и напряжения питания ФЭУ.

После корректировки значения сигналов в каналах лампы полого катода и дейтеревой лампы должны быть близки к 100.

Подать команду на зажигание пламени «поджечь».

Промыть горелку, при горящем пламени опустить капилляр в промывочный раствор (6 М раствор соляной кислоты) на 1 мин.

Рабочие параметры, устанавливаемые на спектрометре и условия определения селена для ртутно-гидридного генератора, диапазон определяемых концентраций представлены в табл. 1.

Таблица 1

РАБОЧИЕ ПАРАМЕТРЫ СПЕКТРОМЕТРА И УСЛОВИЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ СЕЛЕНА

Длина волны лямбда, нм	Ширина щели, мм	Предварительный продув, с	Задержка, сек.	Регистрация, с	Реагент Боргидрид натрия 1,5%-ный раствор куб. см	Рабочая газовая смесь	Пламя	Диапазон определяемых концентраций, мкг/куб. см
196,0	0,50	20	10	40 — 45	не более 40 куб. см	аргон — воздух	воздух — ацетилен	0,001 — 0,020

9.4 Установление и контроль градуировочной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость величины абсорбции от массовой концентрации селена (мкг/куб. см) устанавливают путем измерения величины абсорбции стандартных растворов, приготовленных согласно табл. 2.

Таблица 2

ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ СЕЛЕНА

№ п.п.	Стандартные растворы по пп. 9.2.2 - 9.2.5	Стандартный раствор селена, куб. см	6 М раствор соляной кислоты, куб. см	Массовая концентрация селена, мкг/куб. см
1.	Холостая проба	0	100	0
2.	№ 4 с массовой концентрацией селена 0,01 мкг/куб. см п. 9.2.5	10	90	0,001
3.	№ 3 с массовой концентрацией селена 0,02 мкг/куб. см п. 9.2.4	10	90	0,002
4.	№ 2 с массовой концентрацией селена 0,5 мкг/куб. см п. 9.2.3	1	99	0,005
5.	№ 2 с массовой концентрацией селена 0,5 мкг/куб. см п. 9.2.3	2	98	0,010
6.	№ 2 с массовой концентрацией селена 0,5 мкг/куб. см п. 9.2.3	4	96	0,020

Замеряют величину абсорбции указанных градуировочных растворов и холостой пробы по алгоритму программы спектрометра.

В реакционный сосуд «Р» помещают с помощью пипетки 10 куб. см градуировочного раствора или холостой пробы, устанавливают сосуд в реакционный блок, проводят измерение.

Проводят по пять параллельных измерений со всеми пятью указанными градуировочными растворами.

Программа компьютера строит по средним значениям результатов измерений абсорбции градуировочный график.

Перед каждым началом работы, а также в процессе работы через 10 — 15 измерений уточняют вызванную из памяти компьютера градуировку по одному или двум растворам.

10. Выполнение измерений

При проведении измерений концентраций селена в пробах выполняют следующие операции:

• Заполняют сосуд для раствора реагента — раствором боргидрида натрия, объемом не более 40 куб. см.
• В реакционный сосуд вносят дозированный объем подготовленной пробы (10 куб. см).
• Оба сосуда устанавливают в соответствующий блок генератора «ГРГ-107».
• Подают с помощью компьютера команду «измерение».
• Выполняют измерения «холостой» пробы.

При замерах концентраций селена в пробах свыше 0,02 мкг/куб. см пробы разбавляют.

11. Вычисление результатов измерений

Массовую концентрацию селена в мкг/куб. см в эритроцитах и плазме (сыворотке) крови вычисляют по формуле:

                    C = (C  - C ) мкг/куб. см,
                          р    х

где: C — массовая концентрация селена в анализируемой пробе в мкг/куб. см;

    С  и С  - концентрация  селена в анализируемом растворе (после
     р    х

минерализации) и «холостой пробы», мкг/куб. см.

12. Оформление результатов измерений

Результат количественного анализа представляют в виде C +/- ДЕЛЬТА мкг/куб. см, P = 0,90, ДЕЛЬТА = 0,283 х C.

13. Контроль погрешности измерений

Таблица 3

РЕЗУЛЬТАТЫ МЕТРОЛОГИЧЕСКОЙ АТТЕСТАЦИИ МЕТОДИКИ КХА

Диапазон определяемых	Наименование метрологической характеристики
концентраций селена, мкг/куб. см	характеристика погрешности, ДЕЛЬТА, P = 0,95 мкг/куб. см	норматив оперативного контроля погрешности, K, m = 2, P = 0,95 мкг/куб. см	норматив оперативного контроля воспроизводимости Д, P = 0,95, m = 2 мкг/куб. см
0,001 — 0,020	0,283 х C	0,40 х C	0,00058 + 0,034 C (для плазмы) 0,00022 + 0,0577 C (для эритроцитов)

13.1 Оперативный контроль воспроизводимости

Образцами для контроля могут быть пробы плазмы и эритроцитов крови.

Объем отобранной для контроля пробы должен соответствовать удвоенному объему, необходимому для проведения анализа по методике. Минерализат, полученный после обработки пробы делят на две равные части и анализируют в точном соответствии с прописью методики, варьируя условия проведения анализа, т.е. получают два результата в разных лабораториях или в одной, используя при этом разные наборы мерной посуды, разные партии реактивов. Два результата анализа не должны отличаться друг от друга на величину допускаемых расхождений между результатами анализа.

                         (С  - C ) <= Д,
                           1    2

где: C — результат анализа рабочей пробы; 1 C — результат анализа этой же пробы, полученный другим 2 аналитиком с использованием другого набора мерной посуды и других партий реактивов; Д — допускаемые расхождения между результатами анализа одной и той же пробы.

Норматив воспроизводимости вычисляют по формуле:

Д = Q (P )х сигма (ДЕЛЬТА), m

где: Q (P ) = 2,77, при m = 2, P = 0,95; m

сигма (ДЕЛЬТА) — показатель воспроизводимости (характеристика случайной составляющей погрешности, соответствующая содержанию компонента в пробе).

Д = 2,77 (0,00021 + 0,0124 C); Д = 0,00058 + 0,034 C

При превышении норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива Д выявляют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля и устраняют их.

13.2 Оперативный контроль погрешности

Оперативный контроль погрешности выполняют в одной серии с КХА

рабочих  проб.  Образцами  для  контроля  являются  пробы плазмы и
эритроцитов.  Минерализат, полученный после обработки делят на две
равные  части, первую из которых анализируют в точном соответствии
с  прописью  методики, получают результат анализа исходной рабочей
пробы  -  C ,  вторую  разбавляют  в два раза и снова делят на две

       1

равные  части, первую из которых анализируют в точном соответствии
с  прописью  методики,  получая  результат  анализа рабочей пробы,
разбавленной  в  два  раза  - С , а во вторую часть делают добавку

                           2

анализируемого  компонента (x) и анализируют в точном соответствии
с  прописью  методики,  получая  результат  анализа рабочей пробы,

разбавленной в два раза с добавкой — C . 3

Решение об удовлетворительной погрешности принимают при выполнении условия:

                 (C  - C  - x) + (2 C  - C ) <= K,
                   3    2            2    1

где: C — результат анализа рабочей пробы; 1 C — результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза; 2 C — результат анализа рабочей пробы, разбавленной в два раза, 3 с добавкой анализируемого компонента;

x — величина добавки анализируемого компонента;

14. Нормы затрат времени на анализ

Для проведения анализа одной пробы на содержание селена требуется 4 ч.

---