МУК 4.1.1821-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств ивермектина в печени, почках, мясе, жире сельскохозяйственных животных и молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Минздравом России 18.12.2003)

18 декабря 2003 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ИВЕРМЕКТИНА В ПЕЧЕНИ, ПОЧКАХ, МЯСЕ, ЖИРЕ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ ЖИВОТНЫХ И МОЛОКЕ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1 апреля 2004 года

1. Подготовлены Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (проф. Юдина Т.В.), Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. Калинин В.А.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (гл. специалист Веселов А.П.).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России (прот. № 20 от 2 декабря 2003 г.).

2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 18 декабря 2003 г.

4. Введены впервые.

Вводная часть

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в печени, почках, мясе, жире сельскохозяйственных животных и молоке массовой концентрации ивермектина в диапазонах 0,001 — 0,02 мг/кг (печень, почки, мясо, молоко); 0,002 — 0,04 мг/кг (жир).

Ивермектин — действующее вещество ветеринарных препаратов:

ЦЕВАМЕК 1% ИР, фирма-производитель «CEVA Sante Animale»;

ГАНАМЕКТИН, фирма-производитель «Invesa»;

ИВОМЕК 1% ИР, ИВОМЕК Плюс ИР, фирма-производитель «Мериал».

    Ивермектин   -  смесь  компонентов  Н В   и  Н В .  Содержание
                                         2 1а     2 1
компонента Н В   не менее 90%.

        2 1а

Компонент Н В — (2аЕ,4Е,8Е)-(5'S,6S,'R,7S,11R,13R,15S,17аR,20R, 2 1а 20аR,20bS)-20,20b-дигидрокси-5',6,8,19-тетраметил-7-[[(3-О-метил-4-О- (3-О-метил-2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил)-2,6-дидеокси- альфа-L-арабино-гексапиранозил]-окси]-6'-[(1S)-1-метилпропил]-3',4',5', 6,6',7,10,11,14,15,17а,20,20а-,20b-тетрадека-гидроспиро[11,15-метано-2Н, 1ЗН,17Н-фуро[4,3,2рq][2,6]бензодиокса-циклоокта-децен-13,2'-[2Н]пиран] -17-он (или 5-О-диметил-22,23-дигидроавермектин А ). 1а

Компонент Н В — (2аЕ,4Е,8Е)-(5'S,6S,'R,7S,11R,13R,15S,17аR,20R, 2 1b 20аR,20bS)-20,20b-дигидрокси-5',6,8,19-тетраметил-6'-(1-метилэтил)-7- [[(3-О-метил-4-О-(3-О-метил-2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил)- 2,6-дидеокси-альфа-L-арабино-гексапиранозил]-окси]-3',4',5',6,6',7,10,11, 14,15,17а,20,20а-,20b-тетрадека-гидроспиро[11,15-метано-2Н,-13Н,17Н- фуро[4,3,2рq][2,6]бензодиокса-циклоокта-децен-13,2'-[2Н]пиран]-17-он (или 25-(1-метилэтил)-5-О-диметил)-25-де(1-метилпропил)-22,23- дигидроавермектин А ). 1а

Содержание компонента Н В не менее90 %. 1 1а

Структурная формула не приводится.

 Компонент     R          Эмпирическая формула  Молекулярная масса
 Н В           CH -CH     C  H  O               875
  2 1а           2   3     48 74 14
 Н В           CH         C  H  O               861
  2 1b           3         47 72 14

Ивермектин — кристаллический порошок, без запаха, цвет от белого до желтовато-белого. Насыпная плотность от 1,1 до 1,3 г/куб. см. Практически нерастворим в воде (около 4 мкг/мл), алифатических углеводородах и циклогексане. Растворим в этиловом спирте, хорошо растворим в метиленхлориде, метилэтилкетоне, пропиленгликоле, полиэтиленгликоле. Ивермектин получают путем селективного каталитического восстановления абамектина, который в свою очередь является продуктом жизнедеятельности почвенных организмов Streptomyces avermitilis.

Ивермектин не имеет определенной точки плавления, при нагревании обугливается. Ввиду очень слабой растворимости в воде стабильность водных растворов ивермектина не изучена.

Краткая токсикологическая характеристика

Ивермектин обладает нервно-паралитическим действием. ЛД для 50 лабораторных животных при однократном пероральном введении 15 — 60 мг/кг м.т.

Данные о максимально допустимом уровне (MRL) ивермектина в тканях и органах сельскохозяйственных животных в соответствии с рекомендациями Европейского комитета ветеринарных продуктов и Всемирной организации здравоохранения (1998) представлены в таблице 1.

Таблица 1

Животные	Ткани, органы	Максимально допустимый уровень
Крупный рогатый скот	Мышцы <*>	0,01 мг/кг
	Печень	0,1 мг/кг
	Жир	0,04 мг/кг
	Молоко <*>	0,005 мг/куб. дм
Свиньи, овцы	Мышцы <*>	0,01 мг/кг
	Печень	0,015 мг/кг
	Жир	0,02 мг/кг
<*> Рекомендации Объединенного совещания ФАО/ВОЗ по остаточным количествам пестицидов в продуктах питания, 20 — 29 сентября 2000 г.

Область применения препарата

Ивермектин обладает инсектицидной, акарицидной и нематоцидной активностью. Антибактериальной и антигрибковой активности не обнаружено. Ивермектин рекомендуется к применению в качестве антипаразитарного и антигельминтного препарата для сельскохозяйственных животных (свиней, крупного и мелкого рогатого скота).

Гигиенические нормативы в России не установлены.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в таблицах 2 и 3.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый	Метрологические параметры, Р = 0,95, п = 20
объект	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, %
Печень	0,001	0,001 — 0,02	81,36	2,27	3,31
Почки	0,001	0,001 — 0,02	81,31	3,06	4,46
Мясо	0,001	0,001 — 0,02	82,69	3,81	5,55
Жир свиной	0,002	0,002 — 0,04	79,99	3,92	5,71
Молоко	0,001	0,001 — 0,02	91,30	2,80	4,08

Таблица 3

(5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено ивермектина, мг/кг	Обнаружено ивермектина, мг/кг	Полнота извлечения, %
Печень свиная	0,001 0,002 0,01 0,02	0,0008073 +/- 0,00006 0,0016324 +/- 0,00009 0,008186 +/- 0,00019 0,016248 +/- 0,00054	80,73 81,62 81,86 81,24
Почки свиные	0,001 0,002 0,01 0,02	0,0008124 +/- 0,00007 0,0016164 +/- 0,00010 0,008108 +/- 0,00016 0,016418 +/- 0,00062	81,24 80,82 81,08 82,09
Мясо	0,001 0,002 0,01 0,02	0,0008385 +/- 0,00006 0,0016490 +/- 0,00010 0,008241 +/- 0,00017 0,016412 +/- 0,00060	83,85 82,45 82,41 82,06
Жир свиной (сало)	0,002 0,004 0,02 0,04	0,0015934 +/- 0,00014 0,0031968 +/- 0,00022 0,016088 +/- 0,00085 0,031980 +/- 0,00142	79,67 79,92 80,44 79,95
Молоко	0,001 0,002 0,01 0,02	0,0009060 +/- 0,00005 0,0018316 +/- 0,00008 0,009174 +/- 0,00014 0,018260 +/- 0,00047	90,60 91,58 91,74 91,30

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с флуориметрическим детектором после экстракции из анализируемой пробы молока, органов и тканей сельскохозяйственных животных ацетонитрилом, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами. Экстракты органов и тканей сельскохозяйственных животных подвергают дополнительной очистке на концентрирующем патроне с флоризилом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

реактивы и материалы

3.1 Средства измерений

Жидкостный хроматограф с флуориметрическим        Номер Госреестра
детектором, с переменной длиной волны             15945-97

(фирмы Perkin-Elmer, США)

Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104

Весы лабораторные общего назначения, с ГОСТ 7328 наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Колбы мерные вместимостью 50, 100 и 1000 куб. см  ГОСТ 1770
Пипетки градуированные 2-го класса точности       ГОСТ 29227

вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 куб. см

Пипетки с одной меткой 2-го класса точности ГОСТ 29169 вместимостью 15 куб. см

Пробирки градуированные вместимостью 5 или ГОСТ 1770 10 куб. см

Цилиндры мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770 вместимостью 10, 25, 50, 100, 200, 500 и 1000 куб. см

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2 Реактивы

Ивермектин с содержанием компонента Н В >= 90,0% («INVESA Internacional», 2 1а S.A., Испания)

Ацетонитрил для хроматографии, хч ТУ-6-09-4326-76

Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над KMnO ГОСТ 6709 4

н-Гексан, хч                                       ТУ-6-09-3375
Метиловый спирт (метанол), хч                      ГОСТ 6995

N-метилимидазол, puriss. for DNA synthesis,

= 99%, Fluka

Трифторуксусный ангидрид, purum; >= 98,0% (GC), Fluka

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3 Вспомогательные устройства, материалы

Аллонж прямой с отводом для вакуума (для работы с концентрирующими патронами)

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с               ТУ 64-1-2851-78
Бумажные фильтры "красная лента", обеззоленные     ТУ 6-09-2678-77

Баня ультразвуковая фирмы Донау (Швейцария)

Воронки делительные вместимостью 50 и 250 куб. см ГОСТ 25336

Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336

Гомогенизатор

Груша резиновая

Колбы плоскодонные вместимостью 200 — 250 куб. см ГОСТ 9737

Колбы круглодонные на шлифе вместимостью ГОСТ 9737 10, 100 и 250 куб. см

Мембранные фильтры капроновые диаметром 47 мм

Насос водоструйный ГОСТ 10696

Патроны для твердофазной экстракции Florisil Sep Pak (Waters, США)

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ТУ 25-11-917-74 ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария

Стаканы химические вместимостью 100, 400 и ГОСТ 25336 1000 куб. см

Стекловата

Стеклянные палочки

Установка для перегонки растворителей

Набор для фильтрации растворителей через мембрану

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая

Кромасил 100 С18, зернением 7 мкм

Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Шприц медицинский с разъемом Льюера ГОСТ 22090

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1005.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка патронов для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на патронах для твердофазной экстракции.

7.1 Подготовка органических растворителей

7.1.1. Очистка ацетонитрила. Ацетонитрил кипятят с обратным холодильником над пентоксидом фосфора не менее 1 ч, после чего перегоняют, непосредственно перед употреблением ацетонитрил повторно перегоняют над прокаленным карбонатом калия.

7.1.2. Очистка Н-гексана. Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, далее водой до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 980 куб. см метанола, добавляют 20 куб. см бидистиллированной или деионизированной воды, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.3 Кондиционирование хроматографической колонки

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.2) при скорости подачи растворителя 1,7 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.4 Приготовление реактива для дериватизации

Смешивают трифторуксусный ангидрид и свежеперегнанный ацетонитрил в объеме 1:2. Реактив годен к употреблению в течение рабочего дня.

7.5 Приготовление градуировочных растворов

7.5.1. Исходный раствор ивермектина для градуировки (концентрация 100 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,0100 г ивермектина, растворяют в 50 — 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в морозильной камере в течение месяца.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного стандартного раствора.

7.5.2. Раствор № 1 ивермектина для градуировки (концентрация 1 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного стандартного раствора ивермектина с концентрацией 100 мкг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют метанолом до метки. Раствор хранится в морозильной камере в течение 10 дней.

Этот стандартный раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения ивермектина из исследуемых образцов.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 ивермектина для градуировки (концентрация 0,005 — 0,1 мкг/куб. см). В 5 мерных колб вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5, 1,0, 2,5, 5,0 и 10,0 куб. см стандартного раствора № 1 с концентрацией 1 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки ацетонитрилом, тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией ивермектина 0,005, 0,01, 0,025, 0,05 и 0,10 мкг/куб. см соответственно. Растворы хранятся в морозильной камере не более недели.

7.6 Установление градуированной характеристики

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации ивермектина в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 5 растворам флуорогенного производного ивермектина для градуировки.

Для построения градуировочной характеристики в градуировочные пробирки вместимостью 5 куб. см вносят по 1 куб. см каждого из 5 рабочих растворов ивермектина № 2 — 5, прибавляют по 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, помещая пробирки в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.4), перемешивают и выдерживают 2 ч при комнатной температуре.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб.мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.7 Подготовка патрона для очистки экстрактов

Патрон для твердофазной экстракции устанавливают на аллонж с прямым отводом для вакуума <*>, сверху в патрон вставляют шприц с разъемом Льюера объемом не менее 10 куб. см, используемый в качестве емкости для элюента.

---

<*> В отсутствии специального аллонжа, жидкость продавливают через патрон с помощью шприца, скорость продавливания раствора не должна превышать 1 — 2 капли в с.

Концентрирующий патрон промывают 5 куб. см метанола, высушивают пропусканием воздуха (с использованием вакуума) в течение 5 мин. Затем через патрон пропускают 5 куб. см гексана. Процедуру проводят с использованием вакуума, скорость потока растворов через патрон не должна превышать 5 куб. см/мин, при этом нельзя допускать высыхания поверхности патрона.

8. Отбор проб

Отбор продуктов питания осуществляется в соответствии с требованиями ГОСТ на исследуемые продукты: ГОСТ 7269-79 «Мясо», ГОСТ 3622-68 «Молоко и молочные продукты».

Отобранные образцы продуктов герметично упаковывают в полиэтиленовые мешки, стеклянные банки с притертыми крышками. Образцы анализируют непосредственно после отбора проб или хранят в морозильной камере при -20 °С (допускается хранение до 2 мес.).

Непосредственно перед анализом образцы размораживают, пробы органов и тканей массой 200 — 300 г тщательно измельчают с использованием гомогенизатора. Пробу гомогенизированного образца печени, почек и мяса массой 10 г, жира массой 5 г, а также молока массой 5 г взвешивают на аналитических весах в плоскодонных колбах вместимостью 250 куб. см.

9. Выполнение определения

9.1 Экстракция

К пробе гомогенизированного образца (10 г печени, почек, мяса, 5 г жира и молока), помещенной в колбу вместимостью 250 куб. см, приливают 100 куб. см ацетонитрила, тщательно перемешивают путем встряхивания, выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин., помещают на встряхиватель на 30 мин., дополнительно выдерживают на ультразвуковой бане 5 мин. и снова помещают на встряхиватель на 30 мин.

Экстракты тканей и органов декантируют в центрифужные сосуды емкостью 100 куб. см и центрифугируют при 4 °С со скоростью 3000 об./мин. в течение 10 мин., экстракту пробы молока дают отстояться. Прозрачную надосадочную жидкость переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, фильтруя ее через тампон из стекловаты, помещенный в конусную воронку. Добавляют 70 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин. После полного разделения фаз нижний ацетонитрильный слой сливают в круглодонную колбу и упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяют в смеси 14 куб. см ацетонитрила и 56 куб. см воды, помещая на ультразвуковую баню на 1 мин. Раствор переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 70 куб. см гексана, интенсивно встряхивают воронку в течение 1 мин. Верхний органический слой собирают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Водно-ацетонитрильную фазу вновь переносят в делительную воронку и повторяют операцию экстракции, используя 70 куб. см гексана.

Объединенную органическую фазу упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не более 40 °С. Сухой остаток растворяют в 1 куб. см ацетонитрила и подвергают дериватизации по п. 9.2.

9.2 Дериватизация

К ацетонитрильному раствору прибавляют 0,1 куб. см 1-N-метилимидазола, перемешивают. Смесь охлаждают до 0 — 5 °С, помещая колбу в ледяную баню, добавляют по каплям 0,3 куб. см реактива для дериватизации (п. 7.4), перемешивают и выдерживают 2 ч при комнатной температуре.

Дериватизованные экстракты проб молока анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.3.

Дериватизованные экстракты проб почек, печени, мяса и жира подвергают дополнительной очистке по п. 9.3.

9.3 Очистка экстракта

Аликвоту раствора после дериватизации объемом 0,7 куб. см переносят в градуированную пробирку вместимостью 5 куб. см, добавляют 5 куб. см гексана, интенсивно встряхивают в течение 1 мин, верхний гексановый слой отбирают с помощью пипетки, перенося в стакан вместимостью 50 куб. см, операцию экстракции повторяют новой порцией гексана объемом 5 куб. см. Верхний гексановый слой также переносят в химический стакан, объединяя с первым экстрактом. Объединенный гексановый экстракт вносят на патрон для твердофазной экстракции Florisil Sep Pak, подготовленный по п. 7.7. Скорость прохождения раствора через патрон не должна превышать 1 — 2 капли в с. Элюат собирают непосредственно в круглодонную колбу.

Флуорогенное производное ивермектина дополнительно элюируют с патрона 5 куб. см гексана, также объединяя элюат с первой порцией в круглодонной колбе. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 1,4 куб. см ацетонитрила и анализируют на содержание ивермектина по п. 9.4.

9.4 Условия хроматографирования

Колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 4,0 мм, содержащая Кромасил 100 С18, зернением 7 мкм

Температура колонки: комнатная

Подвижная фаза: метанол-вода (98:2 по объему)

Скорость потока элюента: 1,7 куб. см/мин.

Длина волны: возбуждение 364 нм

Эмиссия 470 нм

Показание аттенюатора: 64

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм

Ориентировочное время выхода флуорогенного производного ивермектина: 11,1 — 11,5 мин.

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор ивермектина с концентрацией 0,005 мкг/куб. см, разбавляют ацетонитрилом.

10. Обработка результатов анализа

Содержание ивермектина в пробе рассчитывают по формуле:

                         (А х К) V

Х = ---------, m

где:

Х — содержание ивермектина в пробе, мг/кг;

А — концентрация ивермектина, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

К — коэффициент пересчета, учитывающий объем реакционной смеси после дериватизации экстрактов проб, используемый для анализа, равный для молока — 1, печени, почек, мяса и жира — 2.

4. Разработчики

Юдина Т.В., д.б.н., проф., Федорова Н.Е., д.б.н., Волкова В.Н., к.х.н.

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).

141000, г. Мытищи Московской обл., ул. Семашко, д. 2, лаборатория аналитических методов контроля.

---