МУК 4.1.1408-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств десмедифама в почве, корнеплодах и ботве сахарной, столовой и кормовой свеклы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Минздравом России 24.06.2003)

24 июня 2003 года

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ДЕСМЕДИФАМА В ПОЧВЕ, КОРНЕПЛОДАХ И БОТВЕ САХАРНОЙ, СТОЛОВОЙ И КОРМОВОЙ СВЕКЛЫ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

30 июня 2003 года

1. Сборник подготовлен: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (акад. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к.х.н. А.В. Довгилевич); при участии Департамента Госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов). Разработчики методик указаны в конце каждой из них.

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России.

3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко 24 июня 2003 г.

4. Введены с 30 июня 2003 г.

5. Введены впервые.

Настоящие методические указания устанавливают метод высокоэффективной жидкостной хроматографии для определения в почве, корнеплодах и ботве сахарной, столовой и кормовой свеклы массовой концентрации десмедифама в диапазоне 0,05 — 0,5 мг/кг.

Десмедифам — действующее вещество препарата БЕТАНЕС, КЭ (70 г/л десмедифама + 90 г/л фенмедифама + 110 г/л этофумезата), фирма-производитель «Август», Россия.

Этил 3-фенилкарбамоилоксифенилкарбамат (IUPAC)

    Эмпирическая формула: C16H16N2O4                  М. м.: 300,3

    Бесцветное  кристаллическое  вещество со слабым  ароматическим
запахом. Температура плавления 120 °С. Давление  паров  при 25 °С:

    -7

3,8 х 10   мм рт. ст. Растворимость  в  органических растворителях
при      20 °С     (г/куб. дм):     изопропанол,     ацетон - 400,
этилацетат - 149;   толуол - 1,2;    метанол - 180;  гексан - 0,5.
Растворимость в  воде при 25 °С - 7 мг/куб. дм.

Десмедифам стабилен в водной кислой среде, гидролизуется в нейтральной и щелочной средах: DT50 — 70 дней (рН 5); 20 ч (рН 7); 10 мин. (рН 9).

Краткая токсикологическая характеристика. Острая пероральная токсичность (LD50) для крыс > 10250 мг/кг, для мышей > 5000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD50) для кроликов > 4000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LK50) для крыс > 7400 мг/куб. м.

Область применения препарата. Десмедифам рекомендуется к применению в качестве контактного селективного гербицида против однолетних двудольных и злаковых сорняков на посевах свеклы сахарной, столовой, кормовой.

Гигиенические нормативы. ДСД — 0,025 мг/кг массы тела; ПДК в воде водоемов — 0,05 мг/куб. дм; ПДК в почве — 0,25 мг/кг; МДУ в свекле сахарной, столовой и кормовой — 0,1 мг/кг.

1. Метрологические характеристики метода

Метрологические характеристики метода представлены в табл. 1 и 2.

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ

Анализируемый объект	Метрологические параметры, Р = 0,95, n = 24
	предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	доверительный интервал среднего результата, %
Корнеплоды сахарной свеклы	0,05	0,05 — 0,5	85,71	2,72	4,0
Корнеплоды столовой свеклы	0,05	0,05 — 0,5	86,48	2,45	3,6
Корнеплоды кормовой свеклы	0,05	0,05 — 0,5	86,10	2,70	3,9
Ботва столовой свеклы	0,05	0,05 — 0,5	86,73	2,63	3,8
Почва	0,05	0,05 — 0,5	82,12	3,16	4,6

Таблица 2

(6 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Внесено десмедифама, мг/кг	Обнаружено десмедифама, мг/кг	Полнота извлечения, %
Корнеплоды сахарной свеклы	0,05 0,1 0,25 0,5	0,04338 + 0,00174 0,08294 + 0,00359 0,21092 + 0,00801 0,44390 + 0,01687	86,76 82,94 84,37 88,78
Корнеплоды столовой свеклы	0,05 0,1 0,25 0,5	0,04117 +/- 0,00140 0,08547 +/- 0,00359 0,21975 +/- 0,00791 0,45115 +/- 0,01398	82,34 85,47 87,90 90,23
Корнеплоды кормовой свеклы	0,05 0,1 0,25 0,5	0,04284 +/- 0,00176 0,08114 +/- 0,00316 0,21605 +/- 0,00951 0,45585 +/- 0,01641	85,69 81,14 86,42 91,17
Ботва столовой свеклы	0,05 0,1 0,25 0,5	0,04408 +/- 0,00203 0,08602 +/- 0,00335 0,21297 +/- 0,00745 0,43775 +/- 0,01471	88,17 86,02 85,19 87,55
Почва	0,05 0,1 0,25 0,5	0,04041 +/- 0,00202 0,08276 +/- 0,00355 0,21302 +/- 0,01001 0,39840 +/- 0,01792	80,83 82,76 85,21 79,68

2. Метод измерений

Методика основана на определении вещества с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) с ультрафиолетовым детектором после экстракции из анализируемой пробы почвы или растительного материала смесью ацетон-вода, очистки экстракта перераспределением между двумя несмешивающимися фазами и на колонке с силикагелем.

В предлагаемых условиях определения метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых в технологии выращивания свеклы кормовой, столовой, сахарной, в т.ч. этофумезата и фенмедифама.

3. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

3.1. Средства измерений

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором с переменной длиной волны (фирмы Perkin-Elmer, США) Номер Госреестра 15945-97 Весы аналитические ВЛА-200 ГОСТ 24104 Весы лабораторные общего назначения, с наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г ГОСТ 7328 Колбы мерные, вместимостью 50, 100 и 1000 куб. см ГОСТ 1770 Пипетки градуированные 2 класса точности, вместимостью 1,0, 2,0, 5,0, 10 куб. см ГОСТ 29227 Пипетки с одной меткой 2-го класса точности, вместимостью 20 куб. см ГОСТ 29169 Пробирки градуированные, вместимостью 5 или 10 куб. см ГОСТ 1770 Цилиндры мерные 2 класса точности

и 1000 куб. см ГОСТ 1770

Допускается использование средств измерения с аналогичными или лучшими характеристиками.

3.2. Реактивы

Десмедифам с содержанием действующего вещества 99,5% (ВНИИХСЗР, Россия) Ацетон, ос.ч. ГОСТ 2306 Вода бидистиллированная, деионизованная или перегнанная над КМnО4

н-Гексан, х.ч.                                        ТУ 6-09-3375
Изопропиловый спирт (пропанол-2), х.ч.              ТУ 6-09-402-75

Кислота ортофосфорная, х.ч., 85% ГОСТ 6552 Метилен хлористый (дихлорметан), х.ч. ГОСТ 12794 Метиловый спирт (метанол), х.ч. ГОСТ 6995 Натрий сернокислый, безводный, х.ч. ГОСТ 4166 Натрий хлористый, х.ч. ГОСТ 4233 Силикагель для колоночной хроматографии L 100 — 160 меш. (фирмы «Лахема», Чехия) Этиловый эфир уксусной кислоты, ч. ГОСТ 22300

Допускается использование реактивов иных производителей с аналогичной или более высокой квалификацией.

3.3. Вспомогательные устройства, материалы

Аппарат для встряхивания типа АВУ-6с ТУ 64-1-2851-78 Баня водяная Бумажные фильтры «красная лента», обеззоленные ТУ 6-09-2678-77 Воронки делительные, вместимостью 250 куб. см ГОСТ 25336 Воронка Бюхнера ГОСТ 25336 Воронки конусные диаметром 30 — 37 и 60 мм ГОСТ 25336 Гомогенизатор Груша резиновая Колба Бунзена ГОСТ 25336 Колбы плоскодонные, вместимостью 200 — 250 куб. см ГОСТ 9737 Колбы круглодонные на шлифе, вместимостью 10, 25, 100, 150 и 250 куб. см ГОСТ 9737 Мембранные фильтры капроновые, диаметром 47 мм Насос водоструйный ГОСТ 10696 Ректификационная колонна с числом теоретических тарелок не менее 50 Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М или ротационный вакуумный испаритель В-169 фирмы Buchi, Швейцария ТУ 25-11-917-74 Сито с диаметром отверстий 1 мм Стаканы химические, вместимостью 100 и 400 куб. см ГОСТ 25336 Стекловата Стеклянная колонка длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм Стеклянные палочки Установка для перегонки растворителей Набор для фильтрации растворителей через мембрану Хроматографическая колонка стальная, длиной 25 см, внутренним диаметром 2,1 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2, зернением 5 мкм Шкаф сушильный ТУ 64-1-1411-76 Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа вместимостью 50 — 100 куб. мм

Допускается применение хроматографических колонок и другого оборудования с аналогичными или лучшими техническими характеристиками.

4. Требования безопасности

4.1. При работе с реактивами соблюдать требования безопасности, установленные для работ с токсичными, едкими, легковоспламеняющимися веществами по ГОСТ 12.1.005.

4.2. При выполнении измерений с использованием жидкостного хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТ 12.1.019 и инструкцией по эксплуатации прибора.

5. Требования к квалификации операторов

К выполнению измерений допускают специалистов, имеющих квалификацию не ниже лаборанта-исследователя, с опытом работы на жидкостном хроматографе.

6. Условия измерений

При выполнении измерений соблюдают следующие условия:

• процессы приготовления растворов и подготовки проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 5) °С и относительной влажности не более 80%;
• выполнение измерений на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору.

7. Подготовка к выполнению измерений

Выполнению измерений предшествуют следующие операции: очистка органических растворителей (при необходимости), приготовление растворов, подвижной фазы для ВЭЖХ, кондиционирование хроматографической колонки, установление градуировочной характеристики, подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов, проверка хроматографического поведения вещества на колонке с силикагелем.

7.1 Подготовка органических растворителей.

7.1.1 Очистка этилацетата и хлористого метилена.

Этилацетат (хлористый метилен) промывают последовательно 5%-ным водным раствором карбоната натрия, насыщенным раствором хлористого кальция, сушат над безводным карбонатом калия и перегоняют или подвергают ректификационной перегонке на колонне с числом теоретических тарелок не менее 50.

7.1.2 Очистка н-гексана.

Растворитель последовательно промывают порциями концентрированной серной кислоты до тех пор, пока она не перестанет окрашиваться в желтый цвет, водой — до нейтральной реакции промывных вод, перегоняют над поташом.

7.2 Приготовление смеси растворителей для экстракции.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 800 куб. см ацетона и 200 куб. см дистиллированной воды, тщательно перемешивают.

7.3 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ.

В мерную колбу вместимостью 1000 куб. см помещают 480 куб. см метанола, 50 куб. см изопропанола, добавляют 470 куб. см бидистиллированной воды и вносят 0,1 куб. см ортофосфорной кислоты, перемешивают, фильтруют и дегазируют.

7.4 Кондиционирование хроматографической колонки.

Промывают колонку подвижной фазой (приготовленной по п. 7.3) в течение 30 мин. при скорости подачи растворителя 0,3 куб. см/мин. до установления стабильной базовой линии.

7.5 Приготовление градуировочных растворов.

7.5.1. Исходный раствор десмедифама для градуировки (концентрация 1 мг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 0,1 г десмедифама, растворяют в 50 — 70 куб. см метанола, доводят метанолом до метки, тщательно перемешивают. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Растворы № 1 — 5 готовят объемным методом путем последовательного разбавления исходного стандартного раствора.

7.5.2. Раствор № 1 десмедифама для градуировки (концентрация 10 мкг/куб. см). В мерную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 1 куб. см исходного стандартного раствора десмедифама с концентрацией 1 мг/куб. см (п. 7.5.1), разбавляют метанолом до метки. Раствор хранится в холодильнике в течение месяца.

Этот стандартный раствор используют для приготовления проб с внесением при оценке полноты извлечения десмедифама из исследуемых образцов.

7.5.3. Рабочие растворы № 2 — 5 десмедифама для градуировки (концентрация 0,05 — 0,5 мкг/куб. см). В 4 мерные колбы вместимостью 100 куб. см помещают по 0,5, 1,0, 2,5 и 5,0 куб. см стандартного раствора № 1 с концентрацией 10 мкг/куб. см (п. 7.5.2), доводят до метки подвижной фазой для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.3), тщательно перемешивают, получают рабочие растворы № 2 — 5 с концентрацией десмедифама 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/куб. см, соответственно. Растворы хранятся в холодильнике не более 10 дней.

7.6 Установление градуировочной характеристики.

Градуировочную характеристику, выражающую зависимость площади пика (отн. единицы) от концентрации десмедифама в растворе (мкг/куб. см), устанавливают методом абсолютной калибровки по 4-м растворам для градуировки № 2 — 5.

В инжектор хроматографа вводят по 20 куб. мм каждого градуировочного раствора и анализируют в условиях хроматографирования по п. 9.4. Осуществляют не менее 3 параллельных измерений.

7.7 Подготовка колонки с силикагелем для очистки экстрактов.

Нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см, внутренним диаметром 8 — 10 мм уплотняют тампоном из стекловаты, медленно выливают в колонку (при открытом кране) суспензию 5 г силикагеля в 20 — 25 куб. см гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 0,5 см. Колонку промывают 25 куб. см смеси этилацетат-гексан (1:1, по объему), затем 25 куб. см гексана со скоростью 1 — 2 капли в с. После этого колонка готова к работе.

7.8. Проверка хроматографического поведения десмедифама на колонке с силикагелем.

В круглодонную колбу вместимостью 10 куб. см помещают 0,5 куб. см стандартного раствора № 1 (п. 7.5.2). Упаривают растворитель досуха, остаток растворяют в 3 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан-этилацетата (9:1, по объему), элюат отбрасывают.

Затем колонку промывают 50 куб. см смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в с. Фракционно (по 10 куб. см) отбирают элюат, упаривают, остатки растворяют в 2 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.3), анализируют на содержание десмедифама по п. 9.4.

Фракции, содержащие десмедифам, объединяют вместе и вновь анализируют по п. 9.4.

Рассчитывают содержание вещества в элюатах, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюента.

Примечание. Проверку хроматографического поведения десмедифама следует проводить обязательно, поскольку профиль вымывания может изменяться при использовании новой партии сорбентов и растворителей.

8. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы, ботвы и корнеплодов свеклы хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более 3 дней. Для длительного хранения пробы растительного материала замораживают и хранят при температуре -18 °С, пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, образцы корнеплодов и ботвы свеклы измельчают.

9. Выполнение определения

9.1 Экстракция.

Образец измельченных корнеплодов или ботвы свеклы массой 20 г помещают в коническую колбу (или химический стакан) вместимостью 400 куб. см, вносят 40 куб. см смеси ацетон-вода (80:20, по объему), гомогенизируют в течение 1 мин., затем добавляют 60 куб. см смеси ацетон-вода (80:20, по объему) и помещают на встряхиватель на 30 мин.

Образец суховоздушной почвы массой 20 г помещают в круглодонную колбу вместимостью 250 куб. см, смачивают 20 куб. см дистиллированной воды, добавляют 80 куб. см ацетона, колбу подсоединяют к обратному холодильнику и помещают на водяную баню, нагретую до 70 — 75 °С, на 1 ч, по окончании процесса охлаждают.

Раствор (с осадком корнеплодов, ботвы свеклы или почвы) фильтруют на воронке Бюхнера через двойной бумажный фильтр «красная лента» под вакуумом. Осадок на фильтре промывают 50 куб. см смеси ацетон-вода (80:20, по объему). Экстракт и промывку переносят в мерный цилиндр вместимостью 250 куб. см с пришлифованной пробкой, перемешивают, измеряют объем раствора, 1/2 его часть (эквивалентную 10 г образца) переносят в круглодонную колбу. Далее проводят очистку экстракта по п. 9.2.

9.2. Очистка экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей.

Экстракт, полученный по п. 9.1 и помещенный в круглодонную колбу, упаривают на ротационном вакуумном испарителе до водного остатка (~20 куб. см) при температуре не выше 35 °С, внимательно следя за процессом и не допуская переброса жидкости при вспенивании. Водный остаток переносят в делительную воронку вместимостью 250 куб. см, добавляют 20 куб. см насыщенного раствора хлорида натрия, 50 куб. см смеси гексан-хлористый метилен (65:35, по объему), интенсивно встряхивают делительную воронку в течение 2 мин. После полного разделения фаз верхний органический слой отделяют, фильтруют через слой безводного сульфата натрия, помещенный на бумажном фильтре в конусной воронке, в плоскодонную колбу вместимостью 250 куб. см. Водную фазу вновь переносят в делительную воронку. Операцию экстракции повторяют еще дважды, используя по 20 куб. см смеси гексан-хлористый метилен (65:35, по объему). Объединенную органическую фазу, пропущенную через слой сульфата натрия, переносят в мерный цилиндр вместимостью 100 куб. см с пришлифованной пробкой. Измеряют объем раствора, 1/2 его часть (около 70 куб. см), эквивалентную 5 г образца почвы или растительного материала, переносят в круглодонную колбу вместимостью 150 куб. см, упаривают досуха и подвергают дополнительной очистке на колонке по п. 9.3.

9.3 Очистка экстракта на колонке с силикагелем.

Остаток в круглодонной колбе, полученный по п. 9.2, растворяют в 3 куб. см гексана и наносят на колонку, подготовленную по п. 7.7. Колбу обмывают трижды порциями гексана по 3 куб. см, которые также наносят на колонку. Промывают колонку 25 куб. см смеси гексан-этилацетат (9:1, по объему), элюат отбрасывают. Десмедифам элюируют с колонки 30 куб. см смеси гексан-этилацетат (7:3, по объему) со скоростью 1 — 2 капли в с, собирая элюат непосредственно в круглодонную колбу. Раствор упаривают досуха при температуре не выше 35 °С. Остаток в колбе растворяют в 5 куб. см подвижной фазы для ВЭЖХ (подготовленной по п. 7.3) и анализируют на содержание десмедифама по п. 9.4.

9.4 Условия хроматографирования.

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором (фирмы Perkin-Elmer, США).

Колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 2,1 мм, содержащая Spherisorb S5 ODS 2, зернением 5 мкм.

Температура колонки: комнатная.

Подвижная фаза: метанол — изопропанол — вода — ортофосфорная кислота (48:5:47:0,1, по объему).

Скорость потока элюента: 0,3 куб. см/мин.

Рабочая длина волны: 240 нм.

Чувствительность: 0,02 ед. абсорбции на шкалу.

Объем вводимой пробы: 20 куб. мм.

Ориентировочное время выхода десмедифама: 11,96 — 12,5 мин.

Образцы, дающие пики, большие, чем стандартный раствор демедифама с концентрацией 0,5 мкг/куб. см, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ (приготовленной по п. 7.3).

10. Обработка результатов анализа

Содержание десмедифама в пробе рассчитывают по формуле:

                         (A х K) х V

Х = -----------, m

где:

Х — содержание десмедифама в пробе, мг/кг;

А — концентрация десмедифама, найденная по градуировочному графику, мкг/куб. см;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, куб. см;

К — коэффициент пересчета, учитывающий объем экстрактов проб, используемый для анализа, равен 4.

11. Контроль погрешности измерений

Оперативный контроль погрешности и воспроизводимости измерений осуществляется в соответствии с рекомендациями МИ 2335-95. ГСИ «Внутренний контроль качества результатов количественного химического анализа».

12. Разработчики

Юдина Т.В., Федорова Н.Е., Волкова В.Н., Гарбузова А.А.

Федеральный научный центр гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (ФНЦГ им. Ф.Ф. Эрисмана).

141000, г. Мытищи Московской обл., ул. Семашко, д. 2, лаборатория аналитических методов контроля.

---