МУК 4.1.1274-03. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение массовой доли бенз(а)пирена в пробах почв, грунтов, донных отложений и твердых отходов методом ВЭЖХ с использованием флуориметрического детектора. Методические указания

(утв. Минздравом России 01.04.2003)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ИЗМЕРЕНИЕ МАССОВОЙ ДОЛИ БЕНЗ(А)ПИРЕНА В ПРОБАХ ПОЧВ, ГРУНТОВ, ДОННЫХ ОТЛОЖЕНИЙ И ТВЕРДЫХ ОТХОДОВ МЕТОДОМ ВЭЖХ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ФЛУОРИМЕТРИЧЕСКОГО ДЕТЕКТОРА

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Разработаны: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (Т.В. Юдина), НПФ «Люмэкс», Санкт-Петербург (Е.А. Волосникова, Д.Б. Гладилович, И.Б. Любченко, Н.А. Майорова, Н.А. Тишкова, Н.А. Лебедева), Федеральным центром госсанэпиднадзора Минздрава России (И.В. Брагина, Е.С. Шальникова, Н.С. Ластенко).

2. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 1 апреля 2003 г.

3. Введены взамен МУК 4.1.057 — 4.1.081-96.

1. Введение

1.1. Назначение и область применения

Настоящие методические указания устанавливают методику количественного химического анализа проб почв, грунтов, твердых промышленных отходов для определения в них бенз(а)пирена методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (далее — ВЭЖХ) с флуориметрическим детектированием.

Диапазон измеряемых содержаний бенз(а)пирена при массе анализируемой навески пробы 1 г составляет 0,005 — 2,0 мг/кг.

1.2. Физико-химические и токсикологические свойства бенз(а)пирена

(Структурная формула не приводится.)

Бенз(а)пирен (3,4-бензпирен) относится к классу полиядерных ароматических углеводородов (ПАУ), молярная масса 252,32 г/моль. Структурная формула молекулы представлена ниже (не приводится). Вещество является продуктом неполного сгорания (пиролиза) органических соединений, присутствует в продуктах переработки угля, нефти (тяжелые фракции), а также образуется в больших количествах при производстве алюминия. Бенз(а)пирен вместе с другими ПАУ оседает в частицах сажи и смолы на поверхности почвы. Бенз(а)пирен обладает канцерогенной активностью.

Бенз(а)пирен относится к веществам класса опасности 1. Предельно допустимая концентрация бенз(а)пирена в почве составляет 0,02 мг/кг с учетом фона (Почва, очистка населенных мест, бытовые и промышленные отходы, санитарная охрана почвы. Гигиеническая оценка качества почвы населенных мест. МУ 2.1.7.730-99).

2. Характеристика погрешности измерений

Характеристика погрешности измерений (граница допускаемой относительной погрешности измерений для доверительной вероятности Р = 0,95) приведена в табл. 1.

Таблица 1

Диапазон измерения, мг/кг	Характеристика погрешности измерений, +/- дельта, %
от 0,005 до 0,040 включительно	35
свыше 0,040 до 2,0 включительно	25

3. Метод измерений

Метод измерения основан на экстракции бенз(а)пирена из проб почв и других анализируемых по методике объектов хлористым метиленом, концентрировании экстракта, очистке его методом колоночной хроматографии, хроматографическом разделении, регистрации сигнала компонентов с использованием флуоресцентного детектора, идентификации пика бенз(а)пирена на хроматограмме по времени удерживания и расчете массовой доли бенз(а)пирена в пробе с использованием градуировочной зависимости.

4. Средства измерений, вспомогательные устройства, реактивы и материалы

4.1. Средства измерений и стандартные образцы

Анализатор жидкости «Флюорат-02» или ТУ 4321-001-20506233-94 иной флуориметрический детектор, обеспечивающий интервал длин волн возбуждения 270 — 360 нм и регистрации 390 — 450 нм

Жидкостный хроматограф или хроматографическая приставка.

Хроматографическая колонка должна быть заполнена обращенно-фазным сорбентом и в условиях выполнения анализа должна иметь эффективность не менее 5000 теоретических тарелок по пику бенз(а)пирена. Минимально определяемая концентрация бенз(а)пирена в растворе (соотношение сигнал/шум, равное трем) должна быть не более 0,002 мкг/куб. см. Колонку снабжают предколонкой, заполненной обращенно-фазным сорбентом.

Весы лабораторные общего назначения с ГОСТ 24104 наибольшим пределом взвешивания 200 г и ценой деления 1,0 мг любого типа

Колбы мерные 2-го класса точности ГОСТ 1770 вместимостью 25, 50, 100 куб. см

Пипетки градуированные 2-го класса ГОСТ 29227 точности вместимостью 1, 2, 5 и 10 куб. см

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100 и ГОСТ 1770 1000 куб. см

Линейка металлическая с ценой деления 1 мм ГОСТ 427 или интегратор, или

система сбора и обработки данных                   Госреестр СИ РФ
"Мультихром" на основе персонального               N 13473-98

компьютера, или другие программные средства, внесенные в Госреестр

Государственный стандартный образец ГСО 7515-98. (ГСО) состава раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле (массовая концентрация 100 мкг/куб. см с погрешностью аттестованного значения не более +/- 2%)

Средства измерений должны быть проверены в установленные сроки. Допускается использование других средств измерений и стандартных образцов, имеющих аналогичные или лучшие характеристики.

4.2. Вспомогательные устройства и материалы

Испаритель роторный пленочный любого типа или иное устройство для удаления растворителя (например, набор для удаления растворителя НПФ «Люмэкс»)

Муфельная печь или электропечь сопротивления, обеспечивающая поддержание температурного режима от 150 до 600 °С с погрешностью не более +/- 25 °С

Устройство для встряхивания проб, например, типа ПЭ-6300, 6410, 6500 («Экрос», Санкт-Петербург) или аналогичное Холодильник бытовой любого типа

Сито с размером ячейки 1 мм

Баня водяная

Насос водоструйный ГОСТ 25336

Бюкс (стаканчик для взвешивания) ГОСТ 25336

Воронки химические ГОСТ 25336

Установка для перегонки растворителей, из круглодонной колбы вместимостью 1000 куб. см, дефлегматора, насадки типа П-10 (Вюрца), холодильника типа ХПТ (Либиха), аллонжа типа АИ; все части установки соединяются между собой взаимозаменяемыми нормальными шлифами

Колбы круглодонные или грушевидные для ГОСТ 25336-82 перегонки вместимостью 50, 100 куб. см НШ 29

Колбы плоскодонные вместимостью 100 и ГОСТ 25336 250 куб. см с пришлифованной пробкой (П-1-100(250)-29/32)

Стаканы химические вместимостью 100 куб. см ГОСТ 25336

Фарфоровая ступка с пестиком ГОСТ 19908

Колонка хроматографическая стеклянная с пришлифованной пробкой (внутренний диаметр не менее 14 мм, длина 20 см)

Эксикатор, заполненный осушителем ГОСТ 25336 (типа безводного хлористого кальция)

Вата хлопковая ГОСТ 5556

Фильтры бумажные «красная лента» ТУ 6-09-1678-86.

4.3. Реактивы

Ацетонитрил для жидкостной хроматографии, ос.ч. ТУ 6-09-5449-89 (например, предприятия «Криохром», сорт 1 — 3)

Вода дистиллированная ГОСТ 6709

Гексан, ч.д.а. ТУ 6-09-3375-78

Кислота серная, ч. ГОСТ 4204

Натрий серно-кислый безводный, х.ч. ГОСТ 4166

Оксид алюминия для хроматографии ТУ 6-09-3916-75 любой основности, фракция 50 — 150 мкм (например, «Fluka» (Швейцария), номера по каталогу 06290, 06300, 06310, 06320)

Хлористый метилен, ч.д.а., перегнанный ГОСТ 9968.

Допускается использование реактивов аналогичной или более высокой квалификации, изготовленных по другой нормативно-технической документации, в т.ч. импортных.

4.4. Приготовление растворов

4.4.1 Растворы бенз(а)пирена заданной концентрации

Растворы бенз(а)пирена должны храниться в темноте при температуре не выше 6 °С, в герметичной посуде, исключающей возможность испарения растворителя и контакт раствора с материалами иными, чем стекло и фторопласт. Растворы каждой концентрации готовят по потребности.

4.4.1.1 Раствор бенз(а)пирена, массовая концентрация 1 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 0,5 куб. см ГСО состава раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле номинальной концентрации 100 мкг/куб. см (или другой, указанной в паспорте), разбавляют до метки ацетонитрилом и перемешивают. Срок хранения в указанных выше условиях — 1 год.

4.4.1.2 Раствор бенз(а)пирена, массовая концентрация 0,1 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 25 куб. см помещают 2,5 куб. см раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/куб. см по п. 4.4.1.1, разбавляют до метки ацетонитрилом и перемешивают. Срок хранения в указанных выше условиях — 6 месяцев.

4.4.1.3 Раствор бенз(а)пирена, массовая концентрация 0,05 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 50 куб. см помещают 2,5 куб. см раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 1 мкг/куб. см по п. 4.4.1.1, разбавляют до метки ацетонитрилом и перемешивают. Срок хранения в указанных выше условиях — 6 месяцев.

4.4.1.4 Раствор бенз(а)пирена, массовая концентрация 0,01 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 25 куб. см помещают 5 куб. см раствора бенз(а)пирена с концентрацией 0,05 мкг/куб. см по п. 4.4.1.3, разбавляют до метки ацетонитрилом и перемешивают. Срок хранения в указанных выше условиях — 3 месяца.

4.4.1.5 Раствор бенз(а)пирена, массовая концентрация 0,005 мкг/куб. см

В мерную колбу вместимостью 25 куб. см помещают 2,5 куб. см раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,05 мкг/куб. см по п. 4.4.1.3, разбавляют до метки ацетонитрилом и перемешивают. Срок хранения в указанных выше условиях — 2 недели.

4.4.2 Приготовление раствора бенз(а)пирена в гексане

4.4.2.1 Раствор бенз(а)пирена в гексане для пробного элюирования

Отбирают 1 куб. см раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле массовой концентрации 0,05 мкг/куб. см по п. 4.4.1.3, удаляют растворитель упариванием при температуре 40 — 45 °С в вакууме водоструйного насоса, растворяют сухой остаток в 1 куб. см гексана. Концентрация бенз(а)пирена в полученном растворе составляет 0,05 мкг/куб. см. Используют свежеприготовленный раствор.

4.4.2.2 Раствор бенз(а)пирена в гексане для внесения добавки

Отбирают определенный объем (V , куб. см) раствора ац бенз(а)пирена в ацетонитриле по п. 4.4.1.2 - 4.4.1.5, который рассчитывают по формуле:

                              V     х С
                               гек     гек
                        V   = ------------,                    (1)
                         ац        С

                                ац

где:
С     - концентрация раствора бенз(а)пирена в ацетонитриле  по
 ац

п. 4.4.1.2 - 4.4.1.5, использованного для приготовления раствора в гексане, мкг/куб. см; С — концентрация бенз(а)пирена в полученном растворе для гек добавки, мкг/куб. см; V — объем гексана, взятого для приготовления раствора, куб. гек см.

Затем удаляют растворитель упариванием при температуре 40 — 45 °С в вакууме водоструйного насоса и сухой остаток растворяют в гексане. Раствор используют свежеприготовленным.

4.4.3 Элюент (подвижная фаза): смесь ацетонитрил-вода в объемном соотношении 8:2

В тщательно вымытый по п. 6.2 цилиндр вместимостью 1000 куб. см помещают 200 куб. см дистиллированной воды. Доводят объем смеси до 1000 куб. см ацетонитрилом, раствор переливают в заранее подготовленную стеклянную плотно закрывающуюся емкость для постоянного хранения и тщательно в ней перемешивают <*>. Недопустимо использование резиновых, корковых и полимерных пробок (за исключением тефлона).

---

<*> Для хранения целесообразно использовать предварительно высушенные емкости из-под ацетонитрила или гексана производства фирмы «Криохром».

Перед употреблением элюент выдерживают для дегазации не менее 4 ч. Для быстрой дегазации готовой смеси проводят вакуумирование емкости с элюентом, подключая ее к водоструйному насосу либо поместив на ультразвуковую баню. Срок хранения в условиях, исключающих испарение растворителя, не ограничен.

4.4.4 Приготовление элюента для колоночной хроматографии: смесь гексан-хлористый метилен в объемном соотношении 90:10

К 90 куб. см гексана приливают 10 куб. см перегнанного хлористого метилена, смесь осторожно перемешивают. Элюент рекомендуется готовить в стеклянной посуде непосредственно перед использованием во избежание испарения хлористого метилена и изменения состава смеси.

Смеси гексан — хлористый метилен с другим соотношением компонентов готовятся аналогично.

5. Требования безопасности

В дополнение к требованиям безопасности, сформулированным в разделе «Общие положения», необходимо соблюдать следующие требования при работе с растворами бенз(а)пирена.

Растворы бенз(а)пирена должны храниться в холодильнике в герметично закупоренных емкостях. Поскольку бенз(а)пирен обладает выраженной канцерогенной активностью, то необходимо избегать контакта кожных покровов с его растворами и по окончании работы, а также при попадании раствора на кожу или на стол необходимо смыть загрязнение проточной водой с моющим средством, а затем обработать участок кожи и загрязненные поверхности этиловым спиртом.

6. Подготовка к выполнению измерений

Перед выполнением измерений должны быть проведены следующие работы: отбор проб, приготовление растворов, подготовка стеклянной посуды и хроматографической колонки, выбор условий регистрации хроматограммы, проверка и градуировка хроматографической системы.

6.1. Отбор и подготовка пробы

Пробы почв, грунтов, твердых отходов и донных отложений массой приблизительно 100 г отбирают в стеклянную посуду и доставляют в лабораторию. Влажные образцы высушивают при комнатной температуре до воздушно-сухого состояния. Затем образец измельчают в фарфоровой ступке и просеивают через сито с диаметром отверстий 1 мм.

6.2. Подготовка стеклянной посуды

Посуду для приготовления и хранения подвижной фазы моют только серной кислотой (без применения других моющих средств) и ополаскивают дистиллированной водой и ацетонитрилом.

Остальную стеклянную посуду моют горячей водой с моющим средством, тщательно ополаскивают дистиллированной водой и сушат при температуре 120 °С. Охладив, ополаскивают ацетоном и хранят в укупоренном виде.

6.3. Анализ холостой пробы

Анализ холостой пробы проводят до начала анализа рабочих проб!

В сухую плоскодонную колбу вместимостью 100 куб. см помещают 15 — 20 куб. см хлористого метилена и продолжают выполнять все операции по п. 7.1 - 7.4. Содержание бенз(а)пирена в холостой пробе должно быть ниже 2 нг/куб. см.

В противном случае находят и устраняют причины загрязнения холостой пробы (посуда или реактивы). Наиболее распространенной причиной загрязнения холостой пробы является недостаточная чистота используемого гексана, поэтому при неудовлетворительном результате контроля холостой пробы, в первую очередь, контролируют используемый растворитель по п. 6.4 <*>.

---

<*> Гексан производства предприятия «Криохром», как правило, не содержит бенз(а)пирен, и загрязнение холостой пробы в случае его применения скорее всего обусловлено другими используемыми реактивами.

6.4. Контроль чистоты растворителей

Данный пункт опускают при удовлетворительных результатах контроля холостой пробы.

При подозрении на недостаточную чистоту растворителей (гексана, хлористого метилена) осуществляется контроль их пригодности для выполнения определения бенз(а)пирена. С этой целью в колбу для перегонки вместимостью 100 куб. см отбирают растворитель в объеме, равном суммарному объему данного растворителя, используемого при обработке пробы, и упаривают досуха. Затем в колбу вносят 1 куб. см ацетонитрила, тщательно обмывая стенки колбы, и выдерживают не менее 15 мин. Полученный раствор дозируют в хроматограф. Растворитель считается пригодным, если содержание бенз(а)пирена ниже 2 нг/куб. см.

В противном случае растворитель необходимо заменить или подвергнуть тщательной перегонке с активированным углем (из расчета 10 г на 1 куб. дм растворителя), собирая среднюю фракцию с температурой кипения 68 — 69 °С (гексан) или 39 — 40 °С (хлористый метилен) <**>.

---

<**> В сосуд с растворителем добавляют активированный уголь, смесь тщательно перемешивают и оставляют на 8 — 12 ч. Растворитель переносят в колбу для перегонки, засыпают свежую порцию активированного угля и перегоняют, собирая среднюю фракцию.

6.5. Описание хроматографической системы

Подготовку хроматографической системы к работе проводят в соответствии с руководством по эксплуатации.

6.5.1 Конфигурация хроматографической системы

Используется система для ВЭЖХ следующей конфигурации:

• колонка для ВЭЖХ, обеспечивающая в условиях выполнения анализа эффективность не менее 6000 теоретических тарелок по пику бенз(а)пирена, внутренним диаметром 2 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом;
• предколонка внутренним диаметром 2 мм, заполненная обращенно-фазным сорбентом;
• подвижная фаза — смесь ацетонитрил/вода 8:2;
• петлевой кран-дозатор (инжектор) с объемом петли 10 куб. мм;
• объемная скорость подачи подвижной фазы — 200 куб. мм/мин. (при внутреннем диаметре колонки 2 мм).

Приведенная конфигурация и параметры могут быть изменены в зависимости от используемого оборудования.

6.5.2. Параметры работы системы с использованием анализатора жидкости «Флюорат-02» в качестве флуориметрического детектора

6.5.2.1 Модификация «Флюорат-02-1(3)»

При выполнении всех измерений в канале возбуждения используют светофильтр «292», а в канале регистрации — светофильтр «Х3». Рекомендуемые параметры и режимы работы анализатора модификации «Флюорат-02» (см. также «Руководство по эксплуатации анализатора жидкости „Флюорат-02“):»

• число усредняемых измерений N = 50 — 100 (при регистрации на компьютер выставляют N = 1 — 3);
• чувствительность F1 = 00 или F1 = 01.

Для записи хроматограммы на самописец или принтер необходимо выбрать режим F6, в котором следует задать размах шкалы I, вычитание фона Ф (при регистрации на компьютер не имеют значения), а также в режиме F7 задать время записи хроматограммы, используя следующую комбинацию клавиш: «F» — «7» — «#» — «200» — «#» — «5000» — «#» (соответствует 25 мин.).

6.5.2.2 Модификация «Флюорат-02-2М»

При выполнении всех измерений в канале возбуждения используют светофильтр «292», а в канале регистрации — светофильтр «Х3». Рекомендуемые параметры и режимы работы анализатора модификации «Флюорат-02-2М» (см. также «Руководство по эксплуатации анализатора») приведены в табл. 2.

Режим	Хроматография
Регистрация	Время	Выбирается по результатам регистрации пробной хроматограммы (обычно не более 30:00)
	Сглаживание	15
	Шкала	Выбирается по результатам регистрации пробной хроматограммы (при регистрации на ПК не используется)
	Фон	Выбирается по результатам регистрации пробной хроматограммы (при регистрации на ПК не используется)
	Печать среднего из	Устанавливается автоматически (величина согласована с параметром «Время», но может быть изменена)
	Диапазон ЦАП	Выбирается исходя из параметров используемого самописца (при регистрации на ПК не используется)
Параметры	Чувствительность	Средняя
	Коррекция опорн.	Нет
	Коррекция проп.	Есть

Рекомендуемые условия регистрации ориентированы на запись хроматограммы при помощи самописца или на принтер. Для первичной оценки значений «Шкала» и «Фон» проводят пробную регистрацию хроматограммы раствора бенз(а)пирена массовой концентрации 0,05 мкг/куб. см по п. 4.4.1.3 (задают значения «Шкала» — «1» и «Фон» — «0»), выбирают необходимые значения, затем приступают к проверке работоспособности хроматографической системы (см. «Руководство по эксплуатации хроматографического комплекса»).

При использовании системы сбора и обработки данных на основе персонального компьютера необходимые настройки производят в соответствии с руководством пользователя программного обеспечения (например, ПО «Мультихром»).

6.5.2.3 Модификация «Флюорат-02-Панорама»

При использовании анализатора модификации «Флюорат-02-Панорама» выставить соответствующие рабочие длины волн монохроматоров возбуждения — 292 нм и регистрации — 405 нм.

Остальные рекомендуемые параметры и режимы работы анализатора модификации «Флюорат-02-Панорама» приведены в «Руководстве по эксплуатации» и в «Описании программного обеспечения». Описание проведения хроматографических измерений содержится в «Рекомендациях по проведению хроматографических измерений с использованием анализатора „Флюорат-02-Панорама“.»

6.6. Краткий алгоритм проведения хроматографических измерений

При подготовке и проведении измерений необходимо:

• проверить правильность сборки хроматографической системы в соответствии с «Руководством по эксплуатации хроматографического комплекса»;
• подготовить насос к работе в соответствии с его «Руководством по эксплуатации»;
• установить скорость подачи (расход) подвижной фазы 200 куб. мм/мин.;
• запустить насос и дождаться прекращения роста давления в хроматографической системе;
• настроить регистрирующее устройство на прием хроматографических данных;
• включить детектор («Флюорат-02») и дождаться стабилизации базовой линии;
• промыть шприц и петлю крана-дозатора ацетонитрилом;
• заполнить петлю крана-дозатора анализируемым раствором (избегая попадания в нее пузырьков воздуха), вводя приблизительно 50 — 70 куб. мм, при этом кран-дозатор должен находиться в положении «ПЕТЛЯ» (перед вводом в кран-дозатор при наличии капли на конце иглы шприца ее следует удалить фильтровальной бумагой);
• ввести пробу, для чего, не вынимая шприц, переключить кран-дозатор в положение «КОЛОНКА». Одновременно запустить детектор и регистратор;
• перед следующим вводом пробы переключить кран-дозатор в положение «ПЕТЛЯ» и вынуть шприц, после чего промыть шприц и петлю крана-дозатора ацетонитрилом;
• перед очередным запуском хроматограммы детектор должен быть остановлен.

6.7. Подготовка оксида алюминия II степени активности по Брокману

Оксид алюминия прокаливают в фарфоровой или кварцевой чашке в муфельной печи при 500 — 600 °С в течение 4 ч. Охлаждают в печи до температуры 150 — 200 °С, после чего помещают в эксикатор с осушителем и охлаждают до комнатной температуры. Оксид быстро переносят в предварительно взвешенный стеклянный сосуд с пришлифованной пробкой, взвешивают, после чего добавляют дистиллированную воду в количестве 3% от массы оксида, тщательно перемешивают интенсивным встряхиванием и выдерживают перед употреблением в течение суток.

Срок хранения в эксикаторе, заполненном осушителем (безводным хлористым кальцием), в посуде с пришлифованной пробкой — 1 месяц.

6.8. Подготовка хроматографической колонки

Непосредственно перед выполнением анализа необходимо подготовить хроматографическую колонку.

В носик колонки помещают небольшое количество ваты, предварительно промытой хлористым метиленом. В чистом стаканчике взвешивают 6 г оксида алюминия, приливают к нему 10 — 15 куб. см осушенного сульфатом натрия гексана, перемешивают до получения однородной суспензии и в несколько приемов переносят в колонку. При заполнении колонки используется воронка, чтобы оксид алюминия не попал на шлиф. По этой же причине уровень гексана всегда должен быть ниже шлифа.

Когда оксид алюминия осядет, в колонку добавляют 1 г безводного сульфата натрия. Стенки колонки обмывают гексаном и устанавливают скорость прохождения гексана около 1 куб. см/мин. (~ 1 капля/с) при высоте столба растворителя 10 — 12 см. Для этого несколько раз постукивают по колонке, выжидают примерно минуту и определяют скорость элюирования. Если скорость выше, процедуру повторяют. Приготовленную колонку используют однократно.

В процессе работы с колонкой нельзя допускать высыхания сорбента, для этого необходимо поддерживать над осушителем слой растворителя.

6.9. Контроль условий элюирования бенз(а)пирена

При использовании каждой новой партии адсорбента перед работой необходимо проводить контрольные исследования условий элюирования стандартного раствора бенз(а)пирена с колонки.

Для этого заполняют стеклянную колонку оксидом алюминия (п. 6.7), наносят на нее 1 куб. см раствора бенз(а)пирена в гексане (п. 4.4.2) и элюируют бенз(а)пирен, как описано в п. 7.2, последовательно, сначала 40 куб. см смеси гексан-хлористый метилен 95:5 (5%), далее 40 куб. см смеси 90:10 (10%) и затем 40 куб. см смеси 80:20 (20%) (п. 4.4.4). Элюаты упаривают досуха (п. 7.3), остатки растворяют в 1 куб. см ацетонитрила, тщательно ополаскивая стенки колбы, выдерживают 15 мин. и дозируют в хроматограф. По полученным хроматограммам рассчитывают значения массовой концентрации бенз(а)пирена для каждой фракции по формуле (1), например:

                              С   х S
                               гр    5%
                        Х   = ---------,                       (2)
                         5%      S

                              гр

где:
Х    -  найденное значение массовой концентрации бенз(а)пирена
 5%

при элюировании смесью, содержащей 5% хлористого метилена (5%-ный элюат), мкг/куб. см; С — концентрация бенз(а)пирена в градуировочном растворе, гр мкг/куб. см (0,05); S — площадь (высота) пика бенз(а)пирена в градуировочном гр растворе; S — площадь (высота) пика бенз(а)пирена в 5%-ном элюате. 5%

При использовании программного обеспечения «МультиХром для Windows» концентрация бенз(а)пирена вычисляется автоматически по заложенной в метод градуировочной зависимости и выводится в отчет.

Затем вычисляют степень извлечения бенз(а)пирена после прохождения через колонку для каждой из фракций, например:

                              Х
                               5%

эта = ---, (3) С гр

где:
эта - степень извлечения бенз(а)пирена;
Х   - найденное значение массовой концентрации бенз(а)пирена в
 5%

5%-ном элюате, мкг/куб. см.

Фракцию, для которой степень извлечения составляет от 0,85 до 1,1, считают оптимальной и приступают к анализу проб, используя для элюирования бенз(а)пирена из колонки смесь гексан-хлористый метилен найденного состава.

Если бенз(а)пирен вымывается в две фракции и суммарное извлечение составляет от 0,85 до 1,1, то для элюирования бенз(а)пирена выбирают смесь с более высоким содержанием хлористого метилена.

На стадии освоения методики процедуру контроля проводят не менее трех раз, каждый раз заново готовя колонку. Вычисляют степень извлечения бенз(а)пирена при каждой повторности. Результаты освоения элюирования бенз(а)пирена признаются удовлетворительными, если все или последние три результата удовлетворяют условию 0,85 <= эта <= 1,1.

При удовлетворительных результатах контроля можно приступать к анализу проб. В противном случае процедуру повторяют.

Примечание. При расчете содержания бенз(а)пирена в пробах почв при соблюдении условия 0,85 <= эта <= 1,1 поправку на степень извлечения бенз(а)пирена допускается не вносить (см. расчетные формулы (9) и (10), п. 8).

6.10. Градуировка хроматографической системы

Градуировку хроматографической системы проводят не реже одного раза в 3 месяца. Внеочередная градуировка системы производится при неудовлетворительных результатах ее контроля по п. 6.11 и/или 6.12. Необходимость новой градуировки чаще всего возникает в следующих случаях:

• при смене колонки и/или предколонки;
• при замене стандартного образца и/или реактивов;
• после проведения ремонта или длительного простоя хроматографической системы;
• когда есть основания полагать, что изменилась эффективность хроматографической системы или чувствительность детектора.

Градуировка системы проводится путем регистрации хроматограммы раствора бенз(а)пирена с концентрацией 0,05 мкг/куб. см, приготовленного по п. 4.4.1.3. Регистрируют не менее двух хроматограмм, измеряют высоту пика бенз(а)пирена и находят среднее арифметическое. Различие между измеренными величинами времен удерживания должно быть не более 5% от их среднего значения, а значения площади (высоты) пика не должны превышать 7%, т.е. должны выполняться условия:

                                      _

                      |t  - t | <= 0,05 х t,                   (4)
                        1    2

где:

    t   и  t  - время  удерживания  пика бенз(а)пирена на первой и
     1      2

второй хроматограммах соответственно, мин.; _

    t - среднее арифметическое значений t  и t , мин.
                                         1    2

                                      _

                      |S  - S | <= 0,07 х S,                   (5)
                        1    2

где:

    S  и S  - площадь (высота)  пика  бенз(а)пирена  на  первой  и
     1    2

второй хроматограммах соответственно;
_

    S - среднее арифметическое значений S  и S .
                                         1    2

Если хотя бы одно из указанных условий не выполняется, заново хроматографируют растворы. При выявлении постоянно проявляющейся нестабильности высот пиков и/или времени удерживания заново тестируют хроматографическую систему.

Полученное среднее значение площади (высоты) пика используют для расчета содержания бенз(а)пирена в рабочих пробах.

После построения градуировочной зависимости ее обязательно проверяют по п. 6.11.

Методика регистрации и обработки хроматограмм при помощи программного обеспечения «МультиХром для Windows» производится в соответствии с руководством пользователя к программе.

6.11. Контроль построения градуировочной зависимости

Контроль построения градуировочной зависимости проводят после градуировки хроматографической системы по п. 6.10.

Образцами для контроля являются растворы бенз(а)пирена, приготовленные по п. п. 4.4.1.2 - 4.4.1.5. Число образцов для контроля должно быть не менее трех, при этом обязательно используют раствор с наименьшей (0,005 мкг/куб. см) концентрацией, а остальные — в соответствии с диапазоном ожидаемых концентраций бенз(а)пирена в анализируемых пробах. Регистрируют не менее двух хроматограмм раствора и проверяют сходимость времен удерживания и площадей (высот) пиков по формулам (3) и (5) соответственно.

Примечание. При использовании программного обеспечения «МультиХром для Windows» концентрация бенз(а)пирена в образце для контроля вычисляется автоматически по заложенной в метод градуировочной зависимости и выводится в отчет.

При помощи формулы (4) находят концентрацию бенз(а)пирена в образце для контроля:

                              С   х S
                               гр    К
                         Х  = --------,                        (6)
                          К      S

                              гр

где:
Х  - найденная массовая концентрация бенз(а)пирена в растворе,
 К

используемом для контроля, мкг/куб. см; С — концентрация градуировочного раствора, мкг/куб. см гр (0,05); S — площадь (высота) пика градуировочного раствора; гр S — площадь (высота) пика раствора бенз(а)пирена, К используемого для контроля.

Градуировочная зависимость признается удовлетворительной, если выполняется условие:

|Х — С| <= 0,01 х G х С, (7) К

где:

    С    -    действительное    значение   массовой   концентрации
бенз(а)пирена  в  растворе,  используемом  для контроля построения

градуировочной характеристики, мкг/куб. см; G — норматив контроля построения градуировочной характеристики, %.

В диапазоне концентраций от 0,002 до 0,005 мкг/куб. см (включительно) G = 25%, в диапазоне свыше 0,005 до 0,1 мкг/куб. см G = 15%.

Если условие (7) не выполняется, то процедуру контроля повторяют и при повторении неудовлетворительного результата контроля градуировку системы проводят заново. Перед тем как принять решение о переградуировке, следует убедиться, что результат контроля не был случайным (неудачный ввод и т.д.) и может быть воспроизведен.

По результатам контроля градуировочной характеристики также уточняют время удерживания, параметры «размах шкалы» и «вычитание фона» (при регистрации хроматограмм на принтер или самописец), и оценивают общую работоспособность хроматографического комплекса.

6.12. Контроль стабильности градуировочной зависимости

Контроль стабильности градуировочной зависимости проводят ежедневно перед началом работы.

В качестве образцов для контроля можно использовать один из растворов по п. п. 4.4.1.2 - 4.4.1.5 (концентрацию раствора для проведения контроля выбирают исходя из предполагаемого содержания бенз(а)пирена в анализируемых пробах, рекомендуется 0,01 мкг/куб. см). Регистрируют не менее двух хроматограмм раствора и проверяют сходимость времен удерживания и площадей (высот) пиков по формулам (3) и (5) соответственно.

Вычисляют концентрацию бенз(а)пирена в образце для контроля по формуле (4). Градуировочная зависимость признается стабильной, если выполняется условие (7).

Если условие (7) не выполняется, то процедуру контроля повторяют и при повторении неудовлетворительного результата контроля градуировку системы проводят заново. Перед тем как принять решение о переградуировке, следует убедиться, что результат контроля не был случайным (неудачный ввод и т.д.) и может быть воспроизведен.

7. Выполнение измерений

7.1. Экстракция бенз(а)пирена из пробы

Пробу почвы массой 1 г, взвешенную с точностью до 0,01 г, помещают в коническую колбу вместимостью 100 куб. см, заливают 15 — 20 куб. см хлористого метилена и неплотно закрывают стеклянной пробкой. Колбу помещают на перемешивающее устройство и перемешивают в течение 30 мин. Полученный экстракт декантируют через бумажный фильтр «красная лента» в колбу для отгонки растворителя. К анализируемому образцу приливают еще 15 куб. см хлористого метилена и экстракцию повторяют в течение 10 мин. Осадок на фильтре промывают 5 — 7 куб. см хлористого метилена.

Объединенные экстракты упаривают до объема 1 — 2 куб. см, к остатку приливают 3 — 5 куб. см гексана и вновь упаривают до объема менее 0,5 куб. см (но не досуха!).

7.2. Элюирование бенз(а)пирена

К полученному по п. 7.2 сконцентрированному экстракту добавляют гексан до объема 1,5 — 2 куб. см; полученный раствор (выпадающий иногда осадок переносится на колонку полностью!) переносят на колонку и промывают 20 куб. см гексана, отбрасывая выходящий из колонки элюат <*>. Затем элюируют полициклические ароматические углеводороды, в т.ч. и бенз(а)пирен, 50 куб. см смеси хлористого метилена и гексана с соотношением компонентов, найденным по п. 6.9. Смесь готовится по п. 4.4.4. Весь элюат собирают в колбу для упаривания.

---

<*> Для очистки сильно загрязненных образцов перед процедурой элюирования бенз(а)пирена колонку с нанесенным экстрактом рекомендуется промыть вместо гексана 15 — 20 куб. см слабополярного растворителя, например, смесью гексана и хлористого метилена в соотношении 95:5. Перед этим необходимо убедиться (п. 6.9), что этим растворителем бенз(а)пирен не элюируется из колонки.

7.3. Подготовка элюата к хроматографическому анализу

Полученные по п. 7.2 элюаты упаривают досуха в вакууме водоструйного насоса при 40 — 50 °С. Сухие остатки растворяют в 5 куб. см ацетонитрила (в зависимости от предполагаемой концентрации бенз(а)пирена в образце допускается изменять диапазон конечного объема от 1 до 10 и более куб. см), тщательно обмывая стенки сосуда, выдерживают перед измерениями не менее 15 мин. Полученные таким образом растворы далее будут называться концентратами.

Далее проводят хроматографический анализ концентратов проб в соответствии с п. 7.4.

Примечание. Для концентрирования экстрактов допускается использовать любую аппаратуру, позволяющую проводить экстракцию без значимых потерь бенз(а)пирена.

7.4. Проведение хроматографических измерений

Регистрируют хроматограммы концентратов (каждого не менее двух

раз)  в  тех  же  условиях, при которых была проведена градуировка
системы.   Идентификацию   бенз(а)пирена   в   пробе  проводят  по
совпадению  времени  удерживания  определяемого  пика  со временем
удерживания   пика  бенз(а)пирена  в  концентрате  градуировочного
раствора,  т.е.  проверяют  выполнение  условия, представленного в

формуле (3), однако в качестве t берут время удерживания пика 1 бенз(а)пирена на хроматограмме градуировочного раствора, a t — 2 время удерживания пика бенз(а)пирена на хроматограмме концентрата.

Если бенз(а)пирен в пробе обнаружен, измеряют высоту (площадь) полученного пика для каждого из двух измерений. Расхождение между ними не должно превышать 7% от их среднего арифметического значения, т.е. должно выполняться условие (5). Если условие (5) не выполняется, находят и устраняют причины нестабильности, после чего ввод концентрата пробы повторяют.

Для дальнейшего подтверждения правильности идентификации в случае сложных проб рекомендуется выполнить добавку раствора бенз(а)пирена к концентрату пробы. О достоверности идентификации можно судить по увеличению высоты (площади) предполагаемого пика бенз(а)пирена. Величина добавки должна составлять 50 — 150% от найденного содержания бенз(а)пирена в концентрате пробы, кроме того, необходимо учитывать разбавление концентрата при введении добавки и для его снижения использовать более концентрированные растворы.

Если содержание бенз(а)пирена в концентрате превышает 0,1 мкг/куб. см, то концентрат необходимо разбавить. Коэффициент разбавления (Q) вычисляют по формуле:

                             V
                              р

Q = --, (8) V а

где:
V   -  объем  разбавленного концентрата пробы, куб. см;
 р
V  -  объем аликвотной  порции  исходного  концентрата  пробы,
 а

взятой для разбавления, куб. см.

8. Обработка результатов измерений

При использовании программного обеспечения «МультиХром для Windows» содержание бенз(а)пирена в пробе вычисляют по формуле:

                          С    х V    х Q
                           кон    кон
                      Х = ---------------,                     (9)

                             m

где:
Х - содержание бенз(а)пирена в пробе, мг/кг;
С       -   содержание   бенз(а)пирена   в  концентрате пробы,
 кон

мкг/куб. см; V — объем концентрата пробы, куб. см; кон m — навеска пробы почвы, г; Q — коэффициент разбавления концентрата пробы по п. 7.4.

Содержание бенз(а)пирена в пробе при регистрации хроматограмм на принтер или самописец вычисляют по формуле:

                       С   х S  х V    х Q х I
                        гр    Х    кон        х
                   Х = ------------------------,              (10)
                            S   х m х I
                             гр        гр

где:
Х - содержание бенз(а)пирена в пробе, мг/кг;
С    -  концентрация градуировочного раствора бенз(а)пирена по
 гр

п. 0, мкг/куб. см; S — площадь (высота) пика бенз(а)пирена на хроматограмме гр градуировочного раствора по п. 6.10; S — площадь (высота) пика бенз(а)пирена на хроматограмме Х концентрата пробы; V — объем концентрата пробы, куб. см; кон m — навеска пробы почвы, г; I — размах шкалы при регистрации хроматограммы гр градуировочного раствора бенз(а)пирена; I — размах шкалы при регистрации хроматограммы концентрата х пробы; Q — коэффициент разбавления концентрата пробы по (8).

9. Оформление результатов измерений

За результат анализа (X, мг/кг) принимают результат, полученный в соответствии с п. 8, и в документах, предусматривающих его использование, представляют в виде:

• результат анализа X (мг/кг), дельта (%), Р = 0,95, где дельта — характеристика погрешности, %;

• X +/- ДЕЛЬТА, мг/кг, Р = 0,95, где:

                            дельта х Х
  

ДЕЛЬТА = ----------. (11) 100

Результат измерений должен оканчиваться тем же десятичным разрядом, что и погрешность. Результаты измерений регистрируют в протоколах, в которых указывают:

• ссылку на настоящий документ;
• описание пробы (номер, источник, дата отбора и анализа и т.п.);
• отклонения от методики при проведении измерений, если таковые имелись, и факторы, отрицательно влияющие на результаты анализа;
• результат измерения;
• фамилию исполнителя.

10. Контроль точности измерений

10.1. Контроль воспроизводимости измерений

Периодичность контроля воспроизводимости измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются пробы почв, грунтов, донных отложений, твердых отходов. Отбирают две навески пробы и каждую из них анализируют в точном соответствии с прописью методики, максимально варьируя условия проведения анализа, т.е. получают два результата анализа либо с участием разных исполнителей, либо с участием одного исполнителя, но в разное время. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                                  _

                  |Х  - Х | <= 0,01 х Х х D,                  (12)
                    1    2

где:
X  - результат анализа рабочей пробы, мг/кг;
 1
Х   -  результат  анализа  этой  же  пробы,  полученный другим
 2

аналитиком либо в другое время, мг/кг; _

    X - среднее арифметическое значений X  и Х , мг/кг;
                                         1    2

D - допускаемые расхождения между результатами анализа одной и

той же пробы (табл. 3), %.

Значения D выбирают для среднего арифметического результатов _ измерений X.

При превышении норматива контроля воспроизводимости измерений процедуру контроля повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Диапазон, мг/кг	Норматив контроля воспроизводимости D (m = 2, P = 0,95)
от 0,005 до 0,040 включительно	36
свыше 0,040 до 2,0 включительно	28

10.2. Контроль погрешности измерений

Периодичность контроля погрешности измерений зависит от количества рабочих измерений за контролируемый период и определяется планами контроля.

Образцами для контроля являются стандартные образцы состава анализируемых по методике объектов с аттестованными значениями содержания бенз(а)пирена либо рабочие пробы почв, грунтов, донных отложений, твердых отходов. В последнем случае используется метод добавок.

10.2.1 Контроль погрешности измерений с использованием стандартных образцов состава анализируемых объектов

Отбирают навеску стандартного образца и анализируют в точном соответствии с прописью методики, получая результат анализа X, мг/кг. Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

|Х — С| <= 0,01 х С х К , (13) 0

где:
С   -   аттестованное   значение  содержания  бенз(а)пирена  в

стандартном образце, мг/кг; К — норматив контроля погрешности измерений (табл. 4), %. 0

Диапазон измерения, мг/кг	Норматив контроля погрешности измерений, К , % 0
	Внешний контроль	Внутрилабораторный контроль
от 0,005 до 0,040 включительно	35	29
свыше 0,040 до 2,0 включительно	25	21

При превышении норматива контроля погрешности процедуру контроля повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

10.2.2 Контроль погрешности с использованием метода добавок

Образцами для контроля являются рабочие пробы почв, грунтов, донных отложений, твердых отходов, к которым делаются добавки бенз(а)пирена в виде раствора в гексане (ГСО бенз(а)пирена в гексане или раствор бенз(а)пирена в гексане, приготовленный по п. 4.4.2). Отбирают две навески пробы и к одной из них делают добавку бенз(а)пирена таким образом, чтобы содержание бенз(а)пирена увеличилось по сравнению с исходным на 50 — 150%. Каждую навеску анализируют в точном соответствии с прописью методики и получают результат анализа исходной рабочей пробы — X и рабочей пробы с добавкой — X'.

Величину добавки бенз(а)пирена, С , мг/кг, вычисляют по доб формуле:

                              С    х V
                               гек    гек
                       С    = -----------,                    (14)
                        доб        m

где:
С    - массовая концентрация раствора бенз(а)пирена в гексане,
 гек

введенная в качестве добавки, мкг/куб. см; V — объем раствора бенз(а)пирена в гексане, введенный в гек качестве добавки, куб. см; m — масса навески, г.

Результаты контроля признаются удовлетворительными, если выполняется условие:

                   |Х' - Х - С   | <= К   ,                   (15)
                              доб      доб

    где К    - норматив контроля погрешности измерений, мг/кг.

     доб

При внешнем контроле (Р = 0,95) норматив вычисляют по формуле:

                     _________________

                        /     2         2
               К    = \/ДЕЛЬТА  + ДЕЛЬТА  ,                   (16)
                доб           Х         Х'

    где ДЕЛЬТА , ДЕЛЬТА   - характеристика абсолютной  погрешности
              Х        Х'
измерения  бенз(а)пирена  в  исходной  пробе  и  пробе  с добавкой

бенз(а)пирена соответственно, мг/кг:

                  ДЕЛЬТА  = 0,01 х дельта  х Х;
                        Х                Х

                                                          (17)

                  ДЕЛЬТА   = 0,01 х ДЕЛЬТА   х Х',
                        Х'                Х'

    где   дельта ,   дельта     -   характеристика   относительной
                Х          Х'
погрешности  измерения  бенз(а)пирена  в  исходной пробе и пробе с

добавкой бенз(а)пирена соответственно (табл. 1), %.

При внутрилабораторном контроле (Р = 0,90) норматив вычисляют по формуле:

                            _________________

                               /     2         2
               К    = 0,84 х \/ДЕЛЬТА  + ДЕЛЬТА  .            (18)
                доб                  Х         Х'

При превышении норматива контроля погрешности измерений процедуру контроля повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам контроля, и устраняют их.

Приложение А

Приложение Б

---