МУК 4.1.1146-02. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств фамоксадона в воде, почве, клубнях картофеля, зеленой массе, соломе и зерне зерновых колосовых культур методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Минздравом России)

Г. Г. Онищенко

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ФАМОКСАДОНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ, СОЛОМЕ И ЗЕРНЕ ЗЕРНОВЫХ КОЛОСОВЫХ КУЛЬТУР МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1 января 2003 года

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: Дюпон, США.

Торговое название: Танос.

Синонимы: JE-874.

Название действующего вещества по ИСО: Фамоксадон.

Название действующего вещества по IUPAC: 3-анилино-5-метил-5-(4-феноксифенил)-2,4-оксазолидиндион.

Структурная формула (не приводится).

C H № O М. м. 374,4 22 18 2 4

Химически чистый фамоксадон представляет собой светлый кремовый порошок.

                                -7             8
    Давление  паров:  6,4  x  10   Ра (4,8 x 10  мм Hq) при 20 °C.

Температура плавления: 140,3 — 141,8 °C.

Коэффициент распределения н-октанол-вода: 4,8 (pH 5); 4,65 (pH 7); 5,55 (pH 9).

Растворимость в воде зависит от кислотности среды и составляет

         -6                            -6
243  x 10    г/л   при pH 5;   111 x 10   г/л при pH 7,  при  pH 9
вещество  быстро  гидролизуется.  Растворимость   в   органических
растворителях (г/л при 20 °C):   ацетон - 274,  ацетонитрил - 125,
гексан - 0,0476, дихлорметан  - 239, метанол - 10,  толуол - 13,3,

этилацетат — 124, н-октанол — 1,78.

Фамоксадон не стабилен в водных растворах. Гидролиз наблюдается в диапазоне pH 5 — 9, и время полураспада составляет 41 день, 2 дня и 93 минуты при pH 5,0; 7,0 и 9,0 соответственно. Период полураспада при фотолизе составляет 4,6 дня и 3,9 часа при pH 5 и 7,75 соответственно.

Краткая гигиеническая характеристика

Фамоксадон относится к малоопасным соединениям по острой (ЛД 50 для крыс — более 5000 мг/кг) и дермальной токсичности (ЛД для 50

крыс  -  более  2000  мг/кг) и  умеренно  опасным по ингаляционной
(ЛК   (4 часа)   -   5300 мг/куб. м)  токсичности,   не   вызывает

50 раздражения глаз и кожи.

В РФ установлены следующие гигиенические нормативы:

ДСД — 0,01 мг/кг массы человека;

ОДК в почве — 0,1 мг/кг;

ПДК в воде водоемов — 0,01 мг/куб. дм;

ВМДУ в картофеле — 0,05 мг/кг.

Область применения

Фамоксадон (JE-874) — фунгицид из группы оксазолидиндионов контактного действия с глубинным эффектом. Является ингибитором митохондриального дыхания, специфически связываясь с активным центром убихинол-цитохром С оксидоредуктазы. Используется в заводских смесях с цимоксанилом и флусилазолом в антирезистентных системах применения фунгицидов.

Высокоэффективен против возбудителей из класса оомицетов, в т.ч. против рас возбудителей, устойчивых к фениламидам. Зарегистрирован в России под названием Танос (DPX — КР 481), диспергируемые в воде гранулы, 50% (25% фамоксадона + 25% цимоксанила) на картофеле с нормой расхода 0,6 кг/га, трехкратная обработка за сезон, проходил испытания на огурцах открытого и закрытого грунта.

2. Методика определения фамоксадона в воде, почве, клубнях картофеля, зеленой массе, соломе и зерне пшеницы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении фамоксадона методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием ультрафиолетового детектора после его экстракции из образцов органическим растворителем, концентрирования экстракта упариванием в вакууме и очистки на колонках с флоризилом. Идентификация веществ проводится по времени удерживания, а количественное определение — методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в табл. 1 — 2.

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Анализируемый объект	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
	предел обнаружения, мг/кг (мг/л)	диапазон определяемых концентраций, мг/кг (мг/л)	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S	доверительный интервал среднего результата, %, +/-
Вода	0,0002	0,0002 — 0,002	84,3	3,37	1,58
Почва	0,02	0,02 — 0,2	80,1	1,24	2,60
Клубни картофеля	0,02	0,02 — 0,2	82,3	6,420	3,00
Пшеница (зеленая масса)	0,05	0,05 — 0,5	83,0	2,46	1,15
Пшеница (зерно)	0,05	0,05 — 0,5	82,3	4,46	2,09
Пшеница (солома)	0,05	0,05 — 0,5	73,4	3,0	1,24

И ЗЕРНЕ ПШЕНИЦЫ (5 ПОВТОРНОСТЕЙ ДЛЯ КАЖДОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ)

Среда	Добавлено, мг/кг (мг/л)	Обнаружено, мг/кг (мг/л)	Доверительный интервал, +/-	Полнота определения, %
Вода	0,0002	0,00164	0,0059	81,7
	0,0004	0,003392	0,0226	84,8
	0,001	0,008554	0,0309	85,5
	0,002	0,01699	0,0743	85,0
среднее				84,3
Почва	0,02	0,0174	0,001	87,0
	0,04	0,0314	0,003	78,5
	0,1	0,0772	0,0020	77,2
	0,2	0,1556	0,0021	77,8
	0,1	0,0846	0,0103	84,6
среднее				81,0
Клубни картофеля	0,02	0,0166	0,0011	83,0
	0,04	0,0342	0,0043	85,5
	0,1	0,0762	0,0020	76,2
	0,2	0,1686	0,0121	84,8
среднее				82,3
Зеленая масса пшеницы	0,05	0,04	0,001	84,4
	0,1	0,08	0,002	81,8
	0,2	0,16	0,002	80,3
	0,5	0,42	0,01	84,6
среднее				83,0
Зерно пшеницы	0,05	0,04	0,003	74,0
	0,1	0,08	0,003	80,8
	0,2	0,17	0,005	86,1
среднее				82,3
Солома пшеницы	0,05	0,04	0,002	74,0
	0,1	0,07	0,002	73,2
	0,2	0,15	0,007	73,2
	0,4	0,29	0,008	71,8
	0,5	0,39	0,017	77,9
среднее				73,4

2.1.3 Избирательность метода

В прилагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании пшеницы.

2.2. Реактивы, растворы, материалы и оборудование

2.2.1 Реактивы, материалы и растворы

Фамоксадон, аналитический стандарт с содержанием д.в. 99,6%, фирма Дюпон

Ацетонитрил ТУ 6-09-3534-87

Бумага индикаторная универсальная

Вода бидистиллированная <*>, ГОСТ 7602-72 деионизированная

н-Гексан, ч                                ТУ 6-09-3375
Гелий газообразный очищенный марки "А"     ТУ 51-940-80

Кислота ортофосфорная, хч ГОСТ 6552-80

Калий марганцово-кислый, чда ГОСТ 20490-75

Натрий серно-кислый, безводный, хч ГОСТ 4166-76

Натрий хлористый, хч

Подвижная фаза для ВЭЖХ: ацетонитрил — 650 мл + 3,1 мМ ортофосфорная кислота (H PO ) в воде — 350 мл 3 4

Флоризил для колоночной хроматографии, 60 — 100 меш, фирма Мерк

Фильтры бумажные «красная лента» ТУ-6-09-1678-86

Фильтры для очистки растворителей диаметром 20 мм с отверстиями 20 мкм, фирма Уотерс

Этиловый эфир уксусной кислоты (этилацетат)

---

<*> Бидистиллят кипятят в течение 6 часов с марганцово-кислым калием, добавленным из расчета 1 г/л, и затем перегоняют.

2.2.2 Приборы и оборудование

Хроматограф жидкостный Уотерс 510 с ультрафиолетовым детектором, с изменяемой длиной волны и чувствительностью не выше 0,0025 единиц адсорбции на шкалу или другой аналогичного типа

Колонка хроматографическая стальная длиной 250 мм, внутренним диаметром 4,6 мм, содержащая Zorbax SB С18, зернением 2 мкм

Ванна ультразвуковая

Весы аналитические ВЛА-200 или аналогичные ГОСТ 34104-80Е

Весы лабораторные общего назначения с ГОСТ 19491-74 наибольшим пределом взвешивания до 500 г и пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г

Воронки делительные на 250 и 500 мл ГОСТ 25336-82Е

Воронки конические стеклянные диаметром 30 — 33 мм ГОСТ 25336-82Е

Встряхиватель механический или аналогичный         ТУ 64-673М
Колбы конические, плоскодонные на 250 и 500 мл     ГОСТ 9737-70
Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл                    ГОСТ 1770-74
Концентраторы грушевидные КТУ-100-14/19            ГОСТ 10394-72

Микрошприц для жидкостного хроматографа на 50 — 100 мкл

Насос водоструйный ГОСТ 10696-75

Пипетки мерные на 0,2; 1,0; 5,0; 10,0 и 25,0 мл ГОСТ 20292-74

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М ТУ 25-11-917-74 или аналогичный

Стаканы стеклянные на 100 — 500 мл ГОСТ 25366-80Е

2.3. Подготовка к определению

2.3.1 Подготовка и кондиционирование колонки для жидкостной хроматографии

Колонку Zorbax SB C18 устанавливают в термостате хроматографа и стабилизируют при t° = 25 °C и скорости потока подвижной фазы 1 мл/мин. в течение 3 — 4 часов.

2.3.2 Приготовление стандартных растворов

Взвешивают 50 мг фамоксадона в мерной колбе объемом 50 мл. Навеску растворяют в ацетонитриле и доводят объем до метки ацетонитрилом (стандартный раствор № 1, концентрация фамоксадона 1 мг/мл). Затем методом последовательного разведения ацетонитрилом готовят растворы, содержащие по 1,0; 0,5; 0,2; 0,1 мг/мл вещества, и используют эти растворы для построения калибровочного графика и фортификации образцов.

2.3.3 Приготовление растворов для жидкостной хроматографии

Для приготовления подвижной фазы используют свежеперегнанные ацетонитрил и дистиллированную воду.

    В  плоскодонную колбу объемом 1 л помещают 650 мл ацетонитрила
и 350 мл 3,1 мМ H PO  в воде <*>.  Смесь  тщательно  перемешивают,
                 3  4
затем   пропускают  через  нее  газообразный  гелий  со  скоростью

20 мл/мин. в течение 5 минут, после чего помещают в ультразвуковую ванну для удаления растворенного гелия на 1 минуту. Полученный раствор используют в качестве подвижной фазы.

---

<*> Для приготовления 3,1 мМ ортофосфорной кислоты прибавляют к 4 л воды 840 мкл концентрированной ортофосфорной кислоты.

2.3.4 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика вводят в хроматограф последовательно по 5 раз по 20 мкл каждого из полученных четырех растворов, измеряют высоту или площадь пиков, рассчитывают среднее значение высоты пика или его площади для каждой концентрации и строят график зависимости высоты пика или площади от концентрации фамоксадона мкг/мл.

2.3.5 Подготовка колонки для очистки экстракта

В пластиковую или стеклянную колонку диаметром 15 мм помещают 4 г флоризила, дезактивированного путем добавления 5% очищенной воды. Сверху на флоризил насыпают 1 г безводного сульфата натрия. Перед использованием колонку промывают 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1, избыток растворителя с колонки удаляют путем продавливания воздуха. Затем колонку дополнительно промывают 10 мл гексана. Перед внесением образца колонку увлажняют 5 мл гексана.

Примечание. Для дезактивации вначале флоризил выдерживают в сушильном шкафу при температуре 120 °C в течение 4 часов, а затем при постоянном перемешивании в стеклянной колбе с притертой пробкой к 95 г флоризила (60 — 100 меш, Merck) добавляют постепенно 5 г очищенной воды.

2.3.6 Проверка хроматографического поведения фамоксадона на колонке

В круглодонную колбу объемом 50 мл вносят 1 мл стандартного раствора фамоксадона с концентрацией 1 мкг/мл и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилацетата, затем добавляют в колбу 5 мл гексана и полученную смесь вносят на колонку. Затем промывают колонку 15 мл смеси гексан-этилацетат 10:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки последовательно 6-ю порциями объемом 5 мл смеси гексана с этилацетатом в соотношении 3:1, каждую порцию собирают отдельно в концентраторы и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток каждой фракции растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл пробы вводят в хроматограф.

Рассчитывают содержание вещества в элюате, определяют полноту смывания с колонки и необходимый для очистки объем элюата.

Примечание. Хроматографическое поведение фамоксадона на колонке обязательно проверяют при отработке методики и каждый раз при использовании новой партии флоризила.

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Пробы зеленой массы пшеницы и клубней картофеля хранят в морозильной камере при температуре -18 °C. Для длительного хранения пробы почвы, соломы и зерна подсушивают при комнатной температуре в отсутствии прямого солнечного света. Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, зерно и солому размалывают на лабораторной мельнице.

2.5. Описание определения

2.5.1 Вода

2.5.1.1. Экстракция. Пробу воды объемом 500 мл помещают в делительную воронку емкостью 1000 мл и трижды экстрагируют хлористым метиленом порциями по 50 мл, встряхивая каждый раз воронку в течение 1 — 2 мин. После разделения фаз в воронке нижний слой сливают в концентратор, пропуская его через безводный сульфат натрия. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

2.5.1.2. Очистка экстракта на колонке. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл этилацетата, обмывая стенки концентратора, затем в концентратор прибавляют 5 мл гексана, тщательно перемешивают и полученную смесь вносят на колонку. Затем колонку промывают последовательно 15 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 10:1 и 10 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1 и элюат отбрасывают. Фамоксадон элюируют с колонки 20 мл смеси гексан-этилацетат в соотношении 3:1, собирают в концентратор и упаривают досуха при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 1 мл ацетонитрила и 20 мкл раствора вводят в хроматограф.

2.5.2 Почва

2.5.2.1. Экстракция. Образец почвы массой 10 г помещают в коническую колбу объемом 250 мл, добавляют 10 мл дистиллированной воды и дают выстояться в течение 10 минут. Затем в колбу прибавляют 30 мл смеси ацетонитрила с водой в соотношении 8:2 и встряхивают колбу на механическом встряхивателе в течение 30 мин. Экстракт переносят в центрифужный стакан и центрифугируют при 2500 об./мин. 5 мин. Супернатант фильтруют в делительную воронку объемом 250 мл через фильтр «красная лента». Фамоксадон экстрагируют еще 2 раза, используя по 30 мл смеси ацетонитрил-вода 8:2, встряхивая в течение 0,5 часа. Экстракты объединяют и переносят в делительную воронку объемом 250 мл.

2.5.2.2. Предварительная очистка экстракта. К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени и после разделения слоев в делительной воронке нижний водный слой с остатком нерастворившегося хлорида натрия отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному экстракту прибавляют 40 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 мл ацетонитрила, добавляют в концентратор 50 мл дистиллированной воды и полученную смесь переносят в делительную воронку. Фамоксадон экстрагируют хлористым метиленом трижды, используя по 20 мл растворителя и интенсивно встряхивая смесь в течение 2 мин. Нижний метиленхлоридный слой объединяют в концентраторе, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Экстракт упаривают досуха на роторном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п. 2.5.1.2.

2.5.3 Картофель (клубни)

Навеску 10 г измельченных клубней картофеля помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 30 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя 30 мл и 10 мл ацетонитрила и встряхивая смесь 30 и 5 мин соответственно. Экстракт фильтруют и объединяют в делительную воронку. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила. Экстракты объединяют в делительной воронке. Далее поступают, как описано в п. 2.5.2.2.

2.5.4 Зеленая масса пшеницы

Навеску 10 г измельченной зеленой массы пшеницы помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 100 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.

К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 5 г хлорида натрия, интенсивно встряхивают и оставляют на 10 минут. По истечении этого времени и после разделения слоев в делительной воронке нижний водный слой с остатком нерастворившегося хлорида натрия отбрасывают. К оставшемуся в делительной воронке ацетонитрильному экстракту прибавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C. Далее проводят очистку экстракта на колонке, как указано в разделе 2.5.1.2.

2.5.5 Солома пшеницы

Навеску 5 г измельченной соломы помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 100 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.

К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п. 2.5.1.2.

2.5.6 Зерно

Навеску 10 г измельченного зерна помещают в плоскодонную стеклянную колбу на 250 мл, добавляют 50 мл ацетонитрила и встряхивают смесь в течение 0,5 часа. Экстракцию повторяют еще 2 раза, используя по 50 мл ацетонитрила и встряхивая смесь каждый раз по 15 мин. Экстракты фильтруют и объединяют в делительной воронке.

К полученному экстракту в делительной воронке добавляют 50 мл гексана и воронку интенсивно встряхивают в течение 2 мин. После разделения слоев нижнюю ацетонитрильную фракцию собирают в концентратор, пропуская через 10 г безводного сульфата натрия. Затем осушитель промывают 10 мл ацетонитрила. Объединенный экстракт упаривают досуха на ротационном вакуумном испарителе при температуре не выше 30 °C.

Затем проводят очистку образца на колонке с флоризилом, как указано в п. 2.5.1.2.

2.6. Условия хроматографирования и обработка результатов

2.6.1 Условия хроматографирования

Хроматограф «Waters» или другой с аналогичными характеристиками с ультрафиолетовым детектором с измеряемой длиной волны

    Колонка стальная Zorbax SB-C18      4,6 мм x 25 см
    Температура колонки                 25 °C
    Подвижная фаза                      ацетонитрил-3,1 мМ H PO
                                                            3  4

                                    в воде в соотношении 65:35

    Скорость потока элюента             1 мл/мин.
    Рабочая длина волны                 255 нм
    Чувствительность                    0,0025 ед. оптической

                                    плотности на шкалу

    Объем вводимой пробы                20 мкл
    Время удерживания фамоксадона       9,9 мин.
    Линейный диапазон детектирования    2 - 20 нг

2.6.2 Обработка результатов анализа

Содержание фамоксадона рассчитывают по формуле:

                      S   x A x V
                       пр

X = -----------, 100S x m ст

где:

X — содержание фамоксадона в пробе, мг/кг или мг/л;

S — высота (площадь) пика стандарта, мм; ст

S — высота (площадь) пика образца, мм; пр

A — концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m — масса анализируемого образца, г (мл);

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

4. Разработчики

Калинин В.А., профессор, к. с-х. н.; Калинина Т.С, к. с-х. н.; Довгилевич Е.В., к. биол. н.; Довгилевич А.В., к. хим. н.; Устименко Н.В., к. биол. н.

Московская сельскохозяйственная академия им. К.А. Тимирязева. 127550, Москва, Тимирязевский пр., 2, кафедра химических средств защиты растений. Телефон: 976-43-26.

---