МУК 4.1.1140-02. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение остаточных количеств Люфенурона в воде, почве, яблоках и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания

(утв. Минздравом России)

4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ

ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ЛЮФЕНУРОНА В ВОДЕ, ПОЧВЕ, ЯБЛОКАХ И КЛУБНЯХ КАРТОФЕЛЯ МЕТОДОМ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ

1. Методические указания подготовлены: Федеральным научным центром гигиены им. Ф.Ф. Эрисмана (чл.-корр. РАМН, проф. В.Н. Ракитский, проф. Т.В. Юдина); Московской сельскохозяйственной академией им. К.А. Тимирязева (проф. В.А. Калинин, к. хим. н. Довгилевич А.В.); Всероссийским НИИ фитопатологии (А.М. Макеев и др.); Всероссийским НИИ защиты растений (В.И. Долженко и др.); Санкт-Петербургским НИИ лесного хозяйства (Маслаков С.Е., Л.В. Григорьева и др.), при участии Департамента госсанэпиднадзора Минздрава России (А.П. Веселов).

2. Методические указания рекомендованы к утверждению Комиссией по государственному санитарно-эпидемиологическому нормированию при Минздраве России.

3. Утверждены и введены в действие Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации, Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации, академиком РАМН Г.Г. Онищенко.

4. Введены впервые.

1. Вводная часть

Фирма-производитель: Сингента (Швейцария).

Торговое название: МАТЧ.

Действующее вещество: Люфенурон (ЦГА 184699).

(RS)-1-/2,5-дихлор-4-(1,1,2,3,3,3-гексафторпропокси)фенил/-3-(2,6-дифторбензоил)мочевина (ИЮПАК).

Структурная формула (не приводится).

    C  H Cl F N O                                      М. м. 511,2
     17 8  2 8 2 3

Бесцветное кристаллическое вещество без запаха.

Температура плавления: 168,7 — 169,4 °C. -6

    Давление паров при 25 °C: 4 x 10   Па.
    Коэффициент распределения н-октанол-вода: К   log P = 5,12.

                                           ow

Хорошо растворим в ацетоне (460 г/л), толуоле (72 г/л), этаноле (41 г/л); плохо растворим в гексане (0,13 г/л) и практически не растворим в воде (0,06 мг/л).

Стабильность к гидролизу при 20 °C: DТ = 160 дней (pH 5), 50 70 дней (pH 7) и 32 дня (pH 9).

Стабилен на воздухе и на свету.

    В  биологически  активных почвах в аэробных условиях Люфенурон
быстро разлагается: DТ   = 13 - 20 дней.

                  50

Краткая токсикологическая характеристика

Острая пероральная токсичность (LD ) для мышей и крыс — более 50 2000 мг/кг; острая дермальная токсичность (LD ) для крыс — более 50 2000 мг/кг; острая ингаляционная токсичность (LС ) для крыс — 50

более  2,35  мг/л  воздуха.  Люфенурон  не оказывает раздражающего
действия  на  кожу и слизистую оболочку глаз кролика. LС   для рыб

                                                    50

30 — 70 мг/л (96 ч).

Инсектицид не токсичен для диких животных, птиц, пчел, земляных червей, почвенных микроорганизмов и токсичен для дафний.

Гигиенические нормативы для Люфенурона в России: ОДК в почве — 0,1 мг/кг; ПДК в воде водоемов — 0,005 мг/куб. дм; МДУ для яблок и картофеля — 0,04 мг/кг.

Область применения препарата

Люфенурон — инсектоакарицид из группы ингибиторов синтеза хитина, эффективно уничтожает листогрызущие личинки чешуекрылых и жесткокрылых, эриофиидных клещей на хлопчатнике, сое, овощных культурах, винограде, семечковых плодовых, картофеле и кукурузе в течение вегетационного периода.

2. Методика определения остаточных количеств Люфенурона в воде, почве, яблоках и клубнях картофеля методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на определении Люфенурона с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на обращенной фазе с ультрафиолетовым детектором после экстракции его из воды смесью гексан-диэтиловый эфир (9:1), из почвы водным метанолом, из растительного материала метанолом, очистки экстракта перераспределением в системе несмешивающихся растворителей, а также на колонке с силикагелем и концентрирующем патроне Диапак.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при возделывании яблоневых садов и картофеля.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ПАРАМЕТРЫ МЕТОДА

Анализируемый	Метрологические параметры, P = 0,95, n = 20
объект	предел обнаружения, мг/куб. дм, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/куб. м, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение, S, %	относительное стандартное отклонение, DS, %	доверительный интервал среднего, %
Вода	0,0004	0,0004 — 0,004	92,0	4,6	2,0	+/- 4,2
Почва	0,01	0,01 — 0,1	89,7	5,1	2,3	+/- 4,7
Яблоки	0,02	0,02 — 0,2	90,1	6,1	2,7	+/- 5,6
Клубни картофеля	0,02	0,02 — 0,2	86,0	8,4	3,8	+/- 7,9

Таблица 2

ПОЛНОТА ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЮФЕРОНА (n = 5)

Матрица	Внесено Люферона, мг/куб. дм, мг/кг	Открыто Люферона, %	Доверительный интервал среднего результата, %
Вода	0,0004 0,0008 0,002 0,004	88,0 92,2 95,0 92,8	+/- 6,9 +/- 3,7 +/- 2,9 +/- 3,6
Почва	0,01 0,02 0,05 0,10	88,0 87,5 91,1 92,2	+/- 6,9 +/- 6,5 +/- 3,9 +/- 5,2
Яблоки	0,02 0,04 0,10 0,20	86,6 90,6 89,4 93,9	+/- 6,3 +/- 7,5 +/- 7,8 +/- 3,3
Клубни картофеля	0,02 0,04 0,10 0,20	80,0 84,0 91,3 88,8	+/- 7,9 +/- 8,5 +/- 7,9 +/- 7,4

2.2. Реактивы, растворы, материалы

Люфенурон с содержанием д.в. 99,7%

Ацетонитрил, ч ТУ 6-09-3534-82

Вода бидистиллированная ГОСТ 7602-72

Гексан, ч ТУ 6-09-3375-78

Натрий серно-кислый, безводный, хч ГОСТ 4166-76

Натрий хлористый, хч ГОСТ 4233-77

Спирт метиловый, хч ГОСТ 6995-77

Этилацетат ГОСТ 22300-76

Эфир диэтиловый ГОСТ 6265-74

Элюент № 1 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат, 90:10 по объему

Элюент № 2 для колоночной хроматографии: смесь гексан-этилацетат, 80:20 по объему

Элюент № 1 для Диапака: смесь ацетонитрил-вода, 40:60 по объему

Элюент № 2 для Диапака: смесь ацетонитрил-вода, 50:50 по объему

Концентрирующий патрон Диапак С8 (АО БиоХимМак, РФ)

Силикагель для адсорбционной хроматографии (Вельм, Германия) I степени активности или силикагель КСК (60 — 100 меш.)

Фильтры бумажные «синяя лента» ТУ 6-09-1678

2.3. Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором фирмы Altex (США) или аналогичный

Хроматографическая колонка стальная длиной 25 см, внутренним диаметром 4 мм, заполненная Диасорбом 130-С16Т (АО БиоХимМак, РФ; 119899, Москва, Ленинские горы)

Шприц для ввода образца в жидкостный хроматограф

Медицинский шприц с разъемом типа Люер для ввода образцов в концентрирующий патрон Диапак

Весы аналитические типа ВЛР-200                    ГОСТ 19401-74
Водоструйный насос                                 ГОСТ 10696-75
Встряхиватель механический                         ТУ 64-1-1081-73
Гомогенизатор                                      МРТУ 42-1505-63

Прибор для перегонки при атмосферном давлении

Ротационный испаритель тип ИР-1М ТУ 25-11-917-76

Сито с диаметром отверстий 1 мм

Баня водяная                                       ТУ 46-22-603-75
Воронка Бюхнера                                    ГОСТ 9147-73

Воронки делительные вместимостью 100, ГОСТ 25336-82 250 и 500 мл

Воронки для фильтрования стеклянные                ГОСТ 8613-75
Колба Бунзена                                      ГОСТ 5614-75
Колбы круглодонные на шлифе вместимостью 100,      ГОСТ 9737-70

250 и 500 мл

Колбы конические с притертыми пробками ГОСТ 25336-82 вместимостью 250 мл

Колбы мерные вместимостью 25, 50, 100 и 1000 мл ГОСТ 1770-74

Колбы грушевидные вместимостью 100, 250 и 500 мл ГОСТ 25336-82

Пипетки мерные вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл ГОСТ 20292-74Е

Пробирки градуированные с притертыми ГОСТ 10515-75 пробками вместимостью 5 и 10 мл

Цилиндры мерные вместимостью 50, 100, 250 и ГОСТ 1770-74 500 мл

2.4. Отбор проб

Отбор проб производится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79).

Отобранные пробы почвы, яблок и клубней картофеля хранят в стеклянной или полиэтиленовой таре в холодильнике не более трех дней. Для длительного хранения пробы почвы доводят до воздушно-сухого состояния и хранят в холодильнике; пробы яблок и клубней хранят до анализа в морозильной камере при температуре -18 °C. Пробы воды хранят при температуре не выше 4 °C в течение 3 дней, при температуре -18 °C — в течение месяца.

Перед анализом сухую почву просеивают через сито с отверстиями диаметром 1 мм, а яблоки и клубни измельчают.

2.5. Подготовка к определению

2.5.1 Подготовка и очистка реактивов и растворителей

Органические растворители перед началом работы сушат и перегоняют в соответствии с типовыми методиками.

2.5.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ

Отмеряют 600 мл ацетонитрила, переносят в колбу на 1000 мл, добавляют 400 мл бидистиллированной воды, перемешивают и дегазируют.

2.5.3 Кондиционирование колонки

Промыть колонку для ВЭЖХ смесью ацетонитрил-вода (6:4 по объему) в течение 30 мин. при скорости подачи растворителя 1 мл/мин. Включить детектор и подождать стабилизации базовой линии (5 — 15 мин.).

2.5.4 Приготовление стандартных растворов

Основной стандартный раствор Люфенурона с содержанием 100 мкг/мл готовят растворением 0,010 г препарата, содержащего 99,7% д.в., в ацетонитриле в мерной колбе на 100 мл. Раствор хранят в холодильнике не более месяца.

Рабочие стандартные растворы с концентрациями 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл готовят из основного стандартного раствора Люфенурона соответствующим последовательным разбавлением подвижной фазой для ВЭЖХ (п. 2.5.2). Рабочие растворы хранят в холодильнике не более недели.

2.5.5 Построение калибровочного графика

Для построения калибровочного графика в инжектор хроматографа вводят по 100 мкл рабочего стандартного раствора Люфенурона с концентрацией 0,05, 0,1, 0,25 и 0,5 мкг/мл. Осуществляют не менее 5 параллельных измерений и находят среднее значение высоты хроматографического пика для каждой концентрации. Строят калибровочный график зависимости высоты хроматографического пика в мм от концентрации Люфенурона в растворе в мкг/мл.

2.5.6 Подготовка колонки с силикагелем и концентрирующего патрона Диапак С8 для очистки экстрактов

В нижнюю часть стеклянной колонки длиной 25 см и внутренним диаметром 0,8 см вставляют тампон из стекловаты, закрывают кран и приливают 10 мл гексана. Затем в колонку вносят суспензию 5 г силикагеля в 20 мл гексана. Дают растворителю стечь до верхнего края сорбента и помещают на него слой безводного сульфата натрия высотой 1 см. Колонку промывают 20 мл гексана со скоростью 1 — 2 капли в секунду, после чего она готова к работе.

Концентрирующий патрон Диапак С8 промывают последовательно с помощью медицинского шприца 5 мл ацетонитрила и 5 мл бидистиллированной воды со скоростью 5 мл/мин.

2.6. Описание определения

2.6.1 Экстракция Люфенурона

2.6.1.1. Вода. 250 мл предварительно отфильтрованной воды помещают в делительную воронку емкостью 500 мл. Добавляют 30 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1 по объему) и встряхивают 1 минуту. Верхний органический слой отделяют, собирая в коническую колбу емкостью 250 мл. Водный слой экстрагируют смесью гексан-диэтиловый эфир еще дважды порциями по 30 мл. Объединенную органическую фазу пропускают через слой безводного сульфата натрия и упаривают на роторном вакуумном испарителе досуха при температуре 30 °C. Остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание Люфенурона по п. 2.7.

2.6.1.2. Яблоки, клубни картофеля. К навеске (25 г) измельченного материала добавляют 100 мл метанола, гомогенизируют 3 минуты при 10000 об./мин. и суспензию перемешивают в течение 20 минут на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр в колбу емкостью 500 мл. Остаток на фильтре промывают 20 мл метанола. Растительный материал повторно экстрагируют 60 мл метанола при встряхивании в течение 10 минут и суспензию фильтруют. К объединенным экстрактам добавляют метанол до объема 200 мл и отбирают аликвоту раствора (40 мл), эквивалентную 5 г растительного материала.

2.6.1.3. Почва. Навеску (20 г) воздушно-сухой почвы помещают в коническую колбу емкостью 250 мл, приливают 20 мл дистиллированной воды и спустя 5 минут 80 мл метанола. Суспензию перемешивают в течение 1 часа на аппарате для встряхивания. Добавляют 2 г целита и фильтруют под вакуумом на воронке Бюхнера через бумажный фильтр. Осадок на фильтре промывают 20 мл метанола. К объединенному фильтрату добавляют метанол до объема 120 мл и отбирают аликвоту раствора (60 мл), эквивалентную 10 г почвы.

2.6.2 Очистка экстракта

Аликвоты растительного (из п. 2.6.1.2) и почвенного (из п. 2.6.1.3) экстрактов переносят в делительную воронку вместимостью 250 мл, приливают соответственно 40 или 50 мл дистиллированной воды, 20 или 30 мл насыщенного раствора хлорида натрия и 30 мл смеси гексан-диэтиловый эфир (9:1 по объему). Смесь встряхивают в течение 1 минуты и после ее разделения отделяют гексановый слой и пропускают его через стеклянный фильтр, заполненный безводным сульфатом натрия, в грушевидную колбу вместимостью 100 мл. Экстракцию водно-метанольной фракции смесью гексан-диэтиловый эфир повторяют еще два раза (по 20 мл). Объединенный гексановый экстракт упаривают на роторном испарителе досуха при температуре 30 °C.

2.6.3 Очистка на колонке с силикагелем

Остаток в колбе, полученный при упаривании очищенных по п. 2.6.2 экстрактов растительного материала и почвы, количественно переносят тремя 1-мл порциями смеси гексан-этилацетат (9:1 по объему) в подготовленную хроматографическую колонку (п. 2.5.6). Промывают колонку 50 мл смеси гексан-этилацетат (9:1 по объему), которые отбрасывают. Люфенурон элюируют 50 мл смеси гексан-этилацетат (8:2 по объему), собирая элюат в грушевидную колбу емкостью 100 мл. Раствор упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 30 °C. Сухие остатки экстрактов почвы и яблок растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют по п. 2.7.

2.6.4 Очистка на концентрирующем патроне Диапак

Сухой остаток экстракта клубней картофеля (п. 2.6.3) количественно переносят двумя 1-мл порциями смеси ацетонитрил-вода (4:6 по объему) в подготовленный концентрирующий патрон Диапак С8 (п. 2.5.6). Патрон промывают 7 мл смеси ацетонитрил-вода (4:6 по объему) со скоростью 5 мл/мин., которые отбрасывают. Люфенурон элюируют 15 мл смеси ацетонитрил-вода (5:5 по объему) со скоростью 5 мл/мин. Элюат упаривают досуха на роторном испарителе при температуре 40 °C. Сухой остаток растворяют в 2 мл подвижной фазы для ВЭЖХ (п. 2.5.2) и анализируют на содержание Люфенурона по п. 2.7.

2.7. Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф с ультрафиолетовым детектором Altex (США)

    Температура колонки         комнатная
    Подвижная фаза              ацетонитрил-вода (60:40 по объему)
    Скорость потока элюента     1 мл/мин.
    Рабочая длина волны         254 нм
    Чувствительность            0,005 ед. абсорбции на шкалу
    Объем вводимой пробы        100 мкл

2.7.1 Неподвижная фаза: Диасорб 130-С16Т, зернением 7 мкм

Время выхода Люфенурона: около 16 минут.

2.7.2 Альтернативная неподвижная фаза: Lichrosorb RP-8 (5 мкм)

    Время выхода Люфенурона                         около 13 минут
    Линейный диапазон детектирования                5 - 50 нг

Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор с концентрацией 0,5 мкг/мл, разбавляют подвижной фазой для ВЭЖХ.

2.8. Обработка результатов анализа

Содержание Люфенурона рассчитывают методом абсолютной калибровки по формуле:

                         H  x A x V
                          1

X = ----------, H x m 0

где:

X — содержание Люфенурона в пробе, мг/кг или мг/куб. дм;

H — высота пика образца, мм; 1

H — высота пика стандарта, мм; 0

A — концентрация стандартного раствора Люфенурона, мкг/мл;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

m — объем анализируемого образца (мл) или масса анализируемой части образца, г.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами.

4. Разработчики

Дубовая Л.В.; Талалакина Т.Н.; Макеев А.М., к. биол. н.; Чкаников Д.И., профессор, д. биол. н.

---