--- title: "\"МУК 4.1.1012-01. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации аверсектина С в органах и тканях животных, плазме и молоке методом флуоресцентной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания\"" number: "МУК 4.1.1012-01" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-1-1012-01" --- ## "МУК 4.1.1012-01. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации аверсектина С в органах и тканях животных, плазме и молоке методом флуоресцентной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания" # "МУК 4.1.1012-01. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение массовой концентрации аверсектина С в органах и тканях животных, плазме и молоке методом флуоресцентной высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания" (утв. Минздравом России 22.01.2001) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень методов (методик) определения остаточных количеств действующих веществ пестицидов в продукции (товарах), подлежащий государственному санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) на таможенной границе и таможенной территории Евразийского экономического союза (Решение Комиссии Таможенного союза от 28.05.2010 N 299). > Документ включен в Перечень нормативной документации, разрешенной для использования в государственных ветеринарных лабораториях при диагностике болезней животных, рыб, пчел, а также контроля безопасности сырья животного и растительного происхождения (утв. Россельхознадзором 30.07.2009 N 02-03-48/563). > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). > Документ [введен](#p100002) в действие с 22 января 2001 года.
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
22 января 2001 года
#### 4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **ОПРЕДЕЛЕНИЕ МАССОВОЙ КОНЦЕНТРАЦИИ АВЕРСЕКТИНА С В ОРГАНАХ** **И ТКАНЯХ ЖИВОТНЫХ, ПЛАЗМЕ И МОЛОКЕ МЕТОДОМ ФЛУОРЕСЦЕНТНОЙ** **ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ**
**МУК 4.1.1012-01**
Дата введения:
с момента утверждения
1. Разработаны ООО НБЦ "Фармбиомед" (В.Г. Тер-Симонян, С.В. Авчук). 2. Рекомендованы к утверждению Комиссией по госсанэпиднормированию при Минздраве России (протокол N 5 от 26.12.00). 3. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации 22 января 2001 г.
4. Введены впервые.
## 1. Назначение и область применения Настоящие методические указания методом хроматографии устанавливают количественный анализ продуктов питания животного происхождения (органы и ткани животных, плазма, молоко) на содержание аверсектина С с нижним пределом измерения 0,001 мг/кг и предназначены для проведения лабораторных исследований безопасности пищевой продукции учреждениями госсанэпидслужбы Российской Федерации, а также для предприятий и учреждений, осуществляющих контроль качества пищевых продуктов в соответствии с Санитарными [правилами](https://bukva.ai/docs/trebovaniya-27) и нормами "Гигиенические требования к качеству и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. СанПиН 2.3.2.560-96" и аккредитованных в установленном порядке. ## 2. Характеристика вещества #### 2.1 Структурная формула основных компонентов аверсектина С - авермектинов В и В 1 2 R С х С 26 22 23 В С Н или СН -СН=СН- 1 2 5 3 В С Н или СН -СН -СНОН. 2 2 5 3 2 #### 2.2 Эмпирическая формула для В С Н О 1 48 72 14 или С Н О 47 70 14 для В С Н О 2 или 48 74 15 С Н О
47 72 15.
#### 2.3 Молекулярная масса для В 872 или 858 1 для В 890 или 876.
2
#### 2.4 Регистрационный номер по САS В 65195-55-3 В 65195-57-5 1а 2а В 65195-56-4 В 65195-58-6. 1в 2в #### 2.5 Физико-химические свойства Аверсектин С - противопаразитарный препарат, представляющий собой комплекс близких в химическом отношении веществ - авермектинов, образуемых культурой Str. avermitilis (см. [формулу](#p100013)). Аверсектин С - порошок белого или желтовато-белого цвета, легко растворим в хлорированных углеводородах, ацетоне, бензоле, растворим в низших спиртах, практически не растворим в воде, петролейном эфире. Т - 150 °С с разложением. пл. Основными компонентами авермектинового комплекса являются авермектины В и В , содержание которых в комплексе составляет не 1 2 менее 65% всего авермектинового комплекса. Агрегатное состояние в воздухе - аэрозоль. #### 2.6 Токсикологическая характеристика Аверсектин С обладает нервно-паралитическим действием. Класс опасности - первый. Предельно допустимая доза аверсектина С в продуктах питания животного происхождения 0,004 мг/кг. ## 3. Погрешность измерения Метод обладает специфичностью. Суммарная погрешность измерений не превышает 10% при доверительной вероятности - 0,95. ## 4. Метод измерений Измерения массовой концентрации аверсектина С основаны на использовании высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением флуоресцентного детектора на колонке с обращенной фазой после экстракции его органическими растворителями из органов и тканей животных, плазмы и молока с последующей очисткой экстрактов и получением флуоресцирующих производных путем обработки трифторуксусным ангидридом в растворе ацетонитрила в присутствии 1-метил-имидазола. Детектирование ведут по интенсивности флуоресценции при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно. Чувствительность метода составляет 0,71 нг в пробе, нанесенной на колонку. ## 5. Средства измерения, вспомогательные устройства, материалы, реактивы, растворы Аналитический хроматограф, модель Du Pont 8800 (США) или аналогичный с флуоресцентным детектором, инжектором с объемом дозирующей петли 20 мкл, с компьютерной системой обработки хроматографических данных (или с интегратором) Колонка аналитическая 250 х 4 с предколонкой 50 х 4 мм, заполненные обращенной фазой Диасорб 130-Сс 16Т с размером частиц 6 мкм Весы аналитические 2 класса точности ГОСТ 24104-88 Весы микроаналитические, точность взвешивания до 4 десятичного знака, Cahn (США) или аналогичные Центрифуга, центрифужные полиэтиленовые пробирки вместимостью 50 и 15 мл Ультразвуковой диспергатор УЗДН-1М Миксер или гомогенизатор Холодильник Аппарат для упаривания - Vortex Evaporater и др. Роторный испаритель Сушильный шкаф Автоматические пипетки ТУ 64-1-3329-81 Колбы мерные вместимостью 100 мл ГОСТ 1770-74 Цилиндры градуированные вместимостью 100 мл ГОСТ 1770-74 Делительные воронки емкостью 2 л ГОСТ 25336-82 Пробирки стеклянные ГОСТ 25336-82 Круглодонная колба емкостью 1 л для роторного испарителя Колбы плоскодонные вместимостью 5 л, 2 л ГОСТ 1770-74 Ацетон, ч.д.а. ГОСТ 2603-63 Гексан, ч. ТУ 6-09-33-75-78 Изооктан (импортный) Этилацетат (импортный) Спирт этиловый ГОСТ 5964-84 Спирт метиловый ГОСТ 6995-67 Ацетонитрил хроматографически чистый ТУ ИРЕА 22-66 или импортный 1-метилимидазол импортный, фирма МЕРК Трифторуксусный ангидрид, импортный, фирма МЕРК Стандартный образец авермектина В РСО 9340-202- 1 00494189 (абамектина) с активностью 938 мкг/мг, содержащий 88,9% авермектина В и 5,3% 1а авермектина В , поставляемый ВГНКИ контроля, 1в стандартизации и сертификации ветпрепаратов. ## 6. Требования безопасности 6.1. При работе с реактивами соблюдают требования безопасности, установленные для работы с токсичными, едкими и легковоспламеняющимися веществами по ГОСТу 12.1.005-88. 6.2. При проведении анализов горючих и вредных веществ соблюдают меры противопожарной безопасности по [ГОСТу 12.1.004-76](https://bukva.ai/docs/gost-12-1-004-76). 6.3. При выполнении измерений с использованием хроматографа соблюдают правила электробезопасности в соответствии с ГОСТом 12.1.019-79 и инструкцией по эксплуатации прибора. ## 7. Требования к квалификации оператора К выполнению измерений и обработке результатов допускают лиц с высшим и средним специальным образованием, имеющих навыки работы на жидкостном хроматографе. ## 8. Условия измерений 8.1. Приготовление растворов и подготовку проб к анализу проводят при температуре воздуха (20 +/- 10) °С, атмосферном давлении 84 - 106 кПа и влажности воздуха не более 80%. 8.2. Измерения на жидкостном хроматографе проводят в условиях, рекомендованных технической документацией к прибору. ## 9. Подготовка к выполнению измерения #### 9.1 Приготовление растворов ##### 9.1.1 Стандартный раствор авермектина В (абамектина) с 1 концентрацией 200 мкг/мл - раствор N 1 - готовят путем растворения
точной навески стандартного образца в метиловом спирте. Раствор
хранится в течение 2 мес. в холодильнике. Рабочий стандартный
раствор с концентрацией 2 мкг/мл - раствор N 2 - готовят путем
разведения раствора N 1 метиловым спиртом. Раствор хранят 2 недели в холодильнике. 9.1.2. Раствор элюента готовят путем смешивания метилового спирта с водой в соотношении 98:2. #### 9.2 Подготовка прибора Общую подготовку прибора осуществляют согласно инструкции по эксплуатации. #### 9.3 Установление градуировочной характеристики Градуировочную характеристику, включающую взаимосвязь величины хроматографического сигнала от массы анализируемого вещества в хроматографируемом объеме пробы, устанавливают по методу абсолютной калибровки с использованием серии градуировочных растворов, которые готовят согласно таблице 1 в пробирках с притертыми пробками. Таблица 1
**РАСТВОРЫ ДЛЯ УСТАНОВЛЕНИЯ ГРАДУИРОВОЧНОЙ ХАРАКТЕРИСТИКИ**
| Номер стандарта | Стандартный раствор N 2, мкл | Этиловый спирт, мкл | Содержание авермектина В , нг/мл 1 | Количество в-ва, наносимого на колонку, нг | | --- | --- | --- | --- | --- | | 0 | 0 | 1000 | - | - | | 1 | 10 | 990 | 20 | 0,71 | | 2 | 20 | 980 | 40 | 1,43 | | 3 | 30 | 970 | 60 | 2,14 | | 4 | 40 | 960 | 80 | 2,86 | | 5 | 50 | 950 | 100 | 3,57 | Проведение дериватизации проб Из приготовленных растворов отбирают по 0,5 мл, переносят в чистые стеклянные пробирки и упаривают досуха на Vortex'е при температуре 40 - 50 °С. В пробирки с сухим остатком вносят по 0,5 мл ацетонитрила. Пробирки энергично встряхивают и обрабатывают ультразвуком в течение 30 с. Процедуру повторяют дважды, чтобы полностью перевести в раствор авермектины, адсорбированные на стенках пробирки. Пробирки помещают в холодильник на 10 - 15 мин. Примечание: Необходимо следить, чтобы в образцы перед проведением дериватизации не попала влага. В пробирки с подготовленным ацетонитрильным раствором после растворения вносят с помощью градуированной микропипетки или микрошприца 0,05 мл 1-метилимидазола. Пробирки закрывают, тщательно перемешивают содержимое в течение 5 - 10 с, обрабатывают ультразвуком, центрифугируют и помещают в холодильник при 0 °С на 10 - 15 мин. Готовят реакционную смесь из трифторуксусного ангидрида и ацетонитрила в соотношении 1:2 и помещают ее в холодильник при 0 °С на 10 - 15 мин. Примечание: Пользуются только свежеприготовленной реакционной смесью. После охлаждения в пробирки с образцами вносят по 0,15 мл охлажденной смеси трифторуксусного ангидрида с ацетонитрилом. Пробирки закрывают, перемешивают содержимое и выдерживают в холодильнике в течение 1 ч. На аналитическую колонку наносят по 50 мкл подготовленных дериватизированных стандартных образцов, содержащих 0,71; 1,43; 2,14; 2,86; 3,57 ng авермектина В . 1 Подвижная фаза - метиловый спирт - вода 98:2. Скорость потока - 0,8 куб. см/мин. Давление - 120 - 160 атм. Детектирование ведут по интенсивности флуоресцентности при длинах волн возбуждения и эмиссии 365 и 470 нм соответственно. Калибровочную кривую строят по сумме площадей двух компонентов стандарта. Полную градуировку проводят не реже одного раза в месяц. Для ежедневной градуировки используют только два раствора с концентрацией авермектина В 20 и 60 нг/мл. 1 В день забоя животных пробы органов и тканей берут по 200 - 500 г, помещают в целлофановые пакеты (для каждого органа - свой пакет). Пакеты снабжают этикетками, на которых указывают: дату забоя животного, название органа. Пробы для анализа хранят в морозильнике при -20 °С (допускается хранение до 2-х месяцев). #### 9.5 Подготовка проб к определению ##### 9.5.1 Экстракция и очистка экстрактов Органы и ткани. Пробу ткани, хранившуюся в холодильнике, размораживают, мелко измельчают в гомогенизаторе (или острыми ножницами). Навеску измельченной ткани (5 г) помещают в плоскодонную колбу с пришлифованной пробкой емкостью 100 мл, куда добавляют 30 мл этилацетата.
Экстракцию проводят в течение 24 ч, после чего экстракт
отделяют центрифугированием и переносят его через фильтр с
безводным Na SO в круглодонную колбу. К остатку добавляют еще 20 2 4 - 30 мл этилацетата и проводят вторую экстракцию в течение 1 ч (при встряхивании). Экстракт отделяют центрифугированием и через фильтр с безводным Na SO переносят в круглодонную колбу с первым 2 4 экстрактом. Экстракты упаривают на роторном испарителе при температуре 40 - 50 °С досуха, остаток растворяют в 10 мл сухого ацетонитрила. Растворение ведут в ультразвуковой бане. Раствор переносят в делительную воронку. Колбу, где находился сухой остаток, обмывают 5 мл ацетонитрила, который также переносят в делительную воронку. Ацетонитрильный раствор 4 раза промывают гексаном, беря на каждую промывку по 5 - 8 мл гексана. Гексановые экстракты отбрасывают. Примечание: Экстракцию гексаном можно проводить в пробирках со шлифом, отбирая гексановый экстракт пипеткой. Измеряют объем ацетонитрильного раствора, промытого гексаном, и делят его на равные части. Одну из них помещают в холодильник на случай возникновения необходимости в повторении анализа. Вторую часть раствора помещают в пробирку и упаривают на Vortex'е в токе азота досуха (допускается упаривание ацетонитрильного раствора на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С). Сухой остаток используют для проведения дериватизации. Плазма. 1,0 мл плазмы крови помещают в гомогенизатор (Super-Mixer), туда же добавляют 3 мл смеси этиловый спирт - вода в соотношении 1:1. Обработку ведут при 4500 об./мин. в течение 10 мин. Из полученной эмульсии аверсектин экстрагируют этилацетатом 3 раза порциями по 8 мл. Экстракцию ведут в центрифужных пробирках при встряхивании с последующим центрифугированием. Этилацетатные экстракты (верхний слой) отбирают пипеткой и переносят в круглодонную колбу вместимостью 100 мл. Этилацетат отгоняют в вакууме на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С. Остаток растворяют в 4 мл ацетонитрила (растворение ведут на ультразвуковой бане). Раствор переносят в широкую пробирку с притертой пробкой. Колбу, в которой производилась отгонка этилацетата, обмывают 2 мл ацетонитрила и промывку также переносят в пробирку. Ацетонитрильный раствор 3 - 5 раз промывают 3 - 4 мл гексана. Гексановые экстракты (верхний слой) отбирают пипеткой и отбрасывают, а ацетонитрильный раствор, промытый гексаном, делят на две равные части. Одну часть хранят в холодильнике, а вторую часть помещают в центрифужную пробирку, упаривают в токе азота в системе Vortex досуха (допускается упаривание ацетонитрильных растворов на роторном испарителе при температуре не выше 50 °С). Сухой остаток используют для проведения дериватизации. Молоко. 1,0 мл молока помещают в гомогенизатор (Super-Mixer), туда же добавляют 5 мл смеси ацетон - вода в соотношении 1:1 и обрабатывают в течение 5 мин. при 4500 об./мин. Из полученной эмульсии аверсектин экстрагируют изооктаном. Экстракцию проводят дважды, беря на каждую экстракцию по 5 мл изооктана. Экстракцию ведут при встряхивании и последующем центрифугировании. Экстракты объединяют и упаривают на роторном испарителе досуха. Остаток растворяют в 8 мл ацетонитрила. Ацетонитрильный раствор трижды экстрагируют 5 мл гексана (промывку гексаном можно проводить в пробирках со шлифами, отбирая каждый раз пипеткой верхний слой). Гексановые экстракты отбрасывают. Ацетонитрильный раствор делят на две равные части. Одну из них хранят в холодильнике для повторного анализа (в случае необходимости), вторую часть помещают в центрифужную пробирку и упаривают в токе азота в системе Vortex досуха (допускается упаривание на роторном испарителе). Сухой остаток используют для проведения дериватизации. ##### 9.5.2 Проведение дериватизации В пробирки с сухими остатками вносят по 0,5 мл ацетонитрила и растворяют остатки с помощью ультразвука. Дериватизацию исследуемых проб проводят так, как это описано для стандартных образцов. Примечание: Дериватизацию авермектинов исследуемого образца (образцов) проводят одновременно с дериватизацией рабочих стандартов. Допускается хранение дериватизированных проб в холодильнике в течение одних суток. ## 10. Выполнение измерений Анализ ВЭЖХ включает не более 10 испытуемых образцов. Перед началом и в конце работы проводят анализ стандартного образца, чтобы убедиться в стабильности работы системы. Объем наносимой на колонку пробы для всех объектов составляет 50 мкл. Режим хроматографирования такой же, как это описано для стандартного образца. ## 11. Расчет концентраций На хроматограммах исследуемых образцов измеряют площадь пиков, производных по времени удерживания, соответствующих стандарту В .
1
По калибровочному графику находят содержание авермектина В в 1 объеме инжектированной пробы испытуемого образца. Содержание аверсектина С в исследуемом образце ведут по формуле: С х V х К В 2 1 1 С = -------------, ав Р х V х К 1 2 где: С - концентрация аверсектина С в образце, нг/г; ав С - содержание авермектина В в объеме пробы, нанесенной на В 1 1 колонку; определяется по калибровочному графику; V - объем пробы, нанесенной на колонку, мкл (50 мкл); 1 V - объем пробы, подготовленной для ВЭЖХ, мкл (700 мкл); 2 Р - навеска образца, г; К [<*>](#p100128) - коэффициент, учитывающий все компоненты аверсектина 1 С (2,5); К [<**>](#p100129) - коэффициент, учитывающий степень извлечения 2 аверсектина С. -------------------------------- <*> Коэффициент К выведен на основании данных о содержании 1 авермектина В в авермектиновом комплексе - аверсектине С. 1 Содержание его составляет (40 +/- 5)%. <**> Коэффициент К , учитывающий степень извлечения 2 авермектинового комплекса из объектов, получен при постановке модельных опытов с внесением в объекты известных количеств аверсектина С. ## 12. Оформление результатов анализа Результат количественного анализа представляют в виде С +/- ДЕЛЬТА, мг/куб. м, Р = 0,95, где ДЕЛЬТА - характеристика погрешности, мг/куб. м, ДЕЛЬТА = 0,15С + 0,0000034 мг/куб. м. ## 13. Контроль погрешности методики Значения полученных метрологических характеристик погрешности, норматива оперативного контроля точности и норматива оперативного контроля воспроизводимости приведены в [табл. 2](#p100139) в виде зависимости от значения массовой концентрации анализируемого компонента в пробе С, которую определяют как среднеарифметическое результатов параллельных определений.
Оперативный контроль воспроизводимости
Отбирают реальные навески из одной пробы испытуемого объекта.
Анализируют в соответствии с прописью методики, максимально
варьируя условия проведения анализа: партии реактивов, наборы мерной посуды и т.д., и получают два результата С и С анализов. 1 2 Результаты анализа не должны отличаться друг от друга на величину большую, чем норматив оперативного контроля воспроизводимости D: |С - С | < D. 1 2 При превышении расхождения между двумя результатами норматива оперативного контроля воспроизводимости эксперимент повторяют. При повторном превышении указанного норматива выясняют причины, приводящие к неудовлетворительным результатам, и устраняют их. Таблица 2
**РЕЗУЛЬТАТЫ МЕТРОЛОГИЧЕСКОЙ АТТЕСТАЦИИ МЕТОДИКИ КХА**
Диапазон определяемыхНаименование метрологической характеристики
концентраций аверсектина С, мг/кгХарактеристика погрешности, мг/кг; Р = 0,95Норматив оперативного контроля воспроизводимости D, мг/кг; Р = 0,95, m = 2
Мышцы 0,004 до 0,0240,095С + 0,000290,095С + 0,00047
Жир 0,004 до 0,240,10С + 0,000260,11С + 0,00043
Печень 0,004 до 0,0240,065С + 0,000420,034С + 0,00075
Почки 0,004 до 0,0240,084С + 0,000110,064С + 0,00024
Молоко 0,004 до 0,0240,062С + 0,000360,006С + 0,00082
## 14. Нормы затраты времени на анализ Для проведения анализов из 3 образцов требуется 6 ч. ---