--- title: "\"МУК 4.1.032-95. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки. Методические указания\"" number: "МУК 4.1.032-95" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-muk-4-1-032-95" --- ## "МУК 4.1.032-95. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки. Методические указания" # "МУК 4.1.032-95. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Определение аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки. Методические указания" (утв. Госкомсанэпиднадзором России 24.07.1995) > [!IMPORTANT] > Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 N 01/14262-8-32). > Документ [введен](#p100002) в действие с 24 июля 1995 года.
Утверждаю
Председатель
Госкомсанэпиднадзора России -
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации
**Е.Н.БЕЛЯЕВ**
24 июля 1995 года #### 4.1 МЕТОДЫ КОНТРОЛЯ. ХИМИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ **ОПРЕДЕЛЕНИЕ АМАНИТИНОВ И ФАЛЛОИДИНА В СЫРЫХ ГРИБАХ** **И ПРОДУКТАХ ИХ ПЕРЕРАБОТКИ** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **МУК 4.1.032-95**
Дата введения:
с момента утверждения 1. Разработаны: Институтом питания РАМН (Тутельян В.А., Хотимченко С.А., Бессонов В.В.); Российским Республиканским информационно-аналитическим центром Госкомсанэпиднадзора России (Агеев В.П.); Госкомсанэпиднадзором России (Петухов А.И.). 2. Утверждены и введены в действие Председателем Госкомсанэпиднадзора России - Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации Е.Н. Беляевым 24 июля 1995 г. 3. Введены впервые. ## Область применения Настоящие Методические указания устанавливают ТСХ и ВЭЖХ/УФ-спектрофотометрические методы определения аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки. Метод ТСХ предназначается для проведения рутинных и скрининговых исследований, а метод ВЭЖХ предназначается для проведения арбитражных анализов и подтверждения результатов определений, полученных методом ТСХ. Методические указания предназначены для учреждений госсанэпиднадзора и других ведомств, осуществляющих контроль качества и безопасности продовольственного сырья и пищевых продуктов. ## 1. Метод определения аманитинов и фаллоидина тонкослойной хроматографией ### 1.1. Сущность метода Анализ включает в себя пробоподготовку методом жидкостно-жидкостной экстракции метанолом, разделения токсинов хроматографией в тонком слое сорбента, детектировании зон абсорбции и количественное определение содержания токсинов визуальным методом либо с применением денситометра (отражательного спектрофотометра). Идентификацию токсинов осуществляют сравнением подвижностей обнаруженных в условиях ТСХ веществ с подвижностью соответствующего стандарта. Нижний предел определения аманитинов и фаллоидина - 0,03 мг/кг продукта. ### 1.2. Отбор проб Навеска массой 50 - 150 г отбирается из средней пробы, подготовленной в соответствии с действующими ГОСТами на конкретный вид продукции. Отобранные образцы можно хранить в морозильной камере при температуре -8 °С до 10 суток, при температуре -18 °С - до 3-х месяцев. ### 1.3. Приборы и материалы Весы технические по ГОСТу 19491-74 и весы аналитические по ГОСТу 24104-80. Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по ГОСТу 13268-83, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТу 14919-83). Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76. Насос водоструйный по ГОСТу 10696-75. Денситометр фирмы "Shimadzu" или подобный. Контактные термометры по ГОСТу 9871-75. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТу 24104-80 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г с пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г. Микрошприц МШ-10 на 10 мкл или калиброванные стеклянные капилляры. Аппарат Сокслета. Воронка Бюхнера по ГОСТу 9147-80. Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТу 15906-79. Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ по ТУ 6-09-1678-77. Цилиндры мерные на 25, 50, 100, 200 мл по ГОСТу 1770-74. Колбы мерные или пробирки мерные 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТу 1770-74. Колбы круглодонные на 1000, 500, 250, 100 и 50 мл по ТУ 48-52. Диэтиловый эфир по ГОСТу 842006-82. Спирт метиловый по ГОСТу 6995-77. Хлороводородная кислота по [ГОСТу 14261-77](https://bukva.ai/docs/gost-14261-77). Уксусная кислота по ГОСТу 61-75. Хлороформ по ГОСТу 20015-74. Коричный альдегид. Вода дистиллированная по ГОСТу 6709-72. Пластинки для ТСХ. Стандартные и рабочие растворы: альфа-аманитин, бета-аманитин, фаллоидин - раствор в метаноле концентрации 1 мг/мл. ### 1.4. Требования техники безопасности при проведении испытаний Помещение, в котором производится определение токсинов, обязательно должно быть оборудовано приточно-вытяжной вентиляцией. Работу с образцами, стандартами, другими химическими соединениями и растворителями проводить в вытяжном шкафу с использованием индивидуальных средств защиты (очки, перчатки и др.). В лаборатории, где проводится работа с высокотоксичными токсинами, необходимо всегда иметь достаточное количество этилового спирта для детоксикации, при попадании его на рабочие места и пол. Транспортировка и хранение токсинов осуществляется в стеклянных запаянных ампулах, обернутых в бумагу и упакованных в металлическую тару. ### 1.5. Подготовка к испытанию ##### 1.5.1 Приготовление стандартных растворов. Стандартные растворы токсинов с концентрацией 1 мг/мл используются при анализе в качестве калибровочного стандарта, готовятся из 1 мг сухого стандарта токсина с чистотой 90%, растворив его в 1 мл метанола для хроматографии. Срок хранения стандартного раствора - 3 месяца при -3 °С. ##### 1.5.2 Подготовка хроматографической пластинки. Хроматографическую пластинку непосредственно перед анализом промывают диэтиловым эфиром и активируют в сушильном шкафу в течение 1 часа при температуре 110 °С. ##### 1.5.3 Подготовка системы для ТСХ. Разделение токсинов проводят в системе растворителей: хлороформ - 5%-ный раствор коричного альдегида в метаноле - уксусная кислота - вода в соотношении 77:33:5:7,5. Систему помещают в камеру для ТСХ для предварительного ее насыщения парами растворителей в течение 1 часа. ### 1.6. Выделение токсинов из навески образца Навеску 50 - 80 г измельченных в мясорубке или гомогенизаторе грибов помещают в аппарат Сокслета, добавляют 100 мл метанола и регулируют нагрев таким образом, чтобы один цикл экстракции завершался за 15 минут. После прохождения 6 циклов метанольный экстракт сливают, отфильтровывают, помещают в круглодонную колбу и упаривают на ротационном испарителе при температуре не выше 60 °С досуха. Сухой остаток перерастворяют в 2 мл метанола. ### 1.7. Проведение анализа в тонком слое сорбента На линию старта хроматографической пластинки, подготовленной по [п. 1.5.2](#p100054), микрошприцами наносят: 50 мкл полученного метанольного экстракта, растворы стандартных образцов, соответствующих 50 мкг (50 мкл стандартного раствора), 25 мкг (25 мкл стандартного раствора) и 75 мкг токсина в пятне. Помещают хроматографическую пластинку в камеру с системой для ТСХ, предварительно насыщенную парами растворителей, как указано в [п. 1.5.3](#p100056). По достижении линией фронта верхнего края пластинки, пластинку вынимают, высушивают на воздухе и помещают в эксикатор, на дно которого налита концентрированная хлороводородная кислота. При этом зоны абсорбции визуализуются: аманитины окрашиваются в фиолетовый цвет, фаллоидины - в розовый, сопутствующие вещества - в желтый. Порядок элюирования токсинов - бета-аманитин, альфа-аманитин, фаллоидин. Токсины считаются надежно идентифицированными, если разница величин Rf исследуемого пятна и пятна стандартного образца не превышает 0,04. ### 1.8. Количественное определение токсинов Количественное определение проводится визуальным методом, сравнивая величину и интенсивность пятен исследуемого вещества и стандартного образца или с использованием денситометра (отражательного спектрофотометра). Условия денситометрии: длина волны 550 нм, скорость сканирования 0,5 см/сек. При использовании денситометра необходимо проведение предварительной калибровки прибора по стандартным образцам токсинов. ## 2. Спектрофотометрический метод ### 2.1. Сущность метода Метод определения аманитинов и фаллоидина в сырых грибах и продуктах их переработки основан на выделении фракции, содержащей токсины, путем экстракции метанолом и очистки экстракта на силикагеле; концентрировании экстракта; разделении и количественном определении содержащихся в концентрате веществ, поглощающих в УФ-области. Идентификацию токсинов осуществляют сравнением времен выхода в условиях ВЭЖХ веществ, поглощающих в УФ-области с временем выхода соответствующего стандарта. Нижний предел определения токсинов - 0,001 мг/кг продукта. ### 2.2. Отбор проб См. [раздел 1.2](#p100018). ### 2.3. Аппаратура, материалы, реактивы Весы аналитические по ГОСТу 24104-80. Шкаф сушильный, нагревательные приборы (электронагреватель по ГОСТу 13268-83, колбонагреватель или электроплитка по ГОСТу 14919-83). Ротационный испаритель с ловушкой по ТУ 25-11-917-76. Насос водоструйный по ГОСТу 10696-75. Контактные термометры по ГОСТу 9871-75. Жидкостной хроматограф "Shimadzu LC-10A" с УФ-детектором с переменной длиной волны или подобный; колонка и предколонка с силикагелем, химически связанным с октадецилсиланом, размер частиц 5 мкм, длина колонки 25 см, предколонки - 4,5 см, внутренний диаметр - 4,6 мм, объем вводимой пробы 20 мкл. Шприц для ввода образцов для жидкостного хроматографа. Весы лабораторные общего назначения по ГОСТу 24104-80 с наибольшим пределом взвешивания до 500 г с пределом допустимой погрешности +/- 0,038 г. Воронка Бюхнера по ГОСТу 9147-80. Бумажные фильтры обеззоленные марки ФОМ по ТУ 6-09-1678-77. Аппарат Сокслета. Мясорубка или гомогенизатор по ГОСТу 15906-79. Силикагель с размером частиц 40 - 100 меш. Цилиндры мерные на 50, 100, 200 мл по ГОСТу 1770-74. Колбы мерные или пробирки мерные 2, 5, 25, 50 мл по ГОСТу 1770-74. Холодильник обратный по ГОСТу 23932-79 и 25336-82. Колбы круглодонные на 1000, 500, 250, 100 и 50 мл по ТУ 48-52. Ацетонитрил по ТУ 6-09-3534-74. Вода дистиллированная по ГОСТу 6709-72. Спирт метиловый по ГОСТу 6995-77. Стандартные и рабочие растворы: альфа-аманитин, бета-аманитин, фаллоидин - растворы в метаноле концентрации С1 = 0,01 мг/мл. ### 2.4. Требования техники безопасности при проведении испытаний См. [раздел 1.4](#p100046). ### 2.5. Подготовка к испытанию ##### 2.5.1 Приготовление стандартных растворов. 2.5.1.1. Содержимое ампулы стандартного раствора токсина (1 мг) растворяют в 100 мл метанола и получают стандартный образец концентрации 0,01 мг/мл, плотно закрывают и хранят в холодильнике при температуре -3 °С не более 3 месяцев. 2.5.1.2. Стандартный раствор токсина с концентрацией 1 мкг/мл, используемый при анализе в качестве калибровочного стандарта, готовят из 1 мл стандартного раствора токсина с концентрацией С = 0,01 мг/мл, перенеся его в мерную колбу на 10 мл и доведя метанолом до метки. Стандартные растворы хранят в темном месте в холодильнике в посуде с пришлифованной пробкой не более 3 месяцев. 2.5.1.3. Подготовка к анализу растворителей и реактивов, контроль их чистоты. Метанол - перегнанный в стекле. Ацетонитрил - перегнанный в стекле. Контроль чистоты реактивов: По 10 - 20 мл ацетонитрила и метанола раздельно упаривают до объема приблизительно 1 мл и анализируют концентрат на наличие посторонних примесей, поглощающих при 303 нм УФ-области. При отсутствии поглощения - реагенты используются в работе, при наличии поглощения - подвергаются дополнительной очистке путем перегонки на ректификационной насадочной колонне или заменяются на новую партию. ##### 2.5.2 Подготовка подвижной фазы для ВЭЖХ. Отмеряют 200 мл ацетонитрила, прозрачного при 303 нм, переносят в мерную колбу на 1000 мл, доводят до метки дистиллированной водой, фильтруют, дегазируют. ### 2.6. Экстракция и очистка токсинов из образца Навеску 50 - 80 г измельченных в мясорубке или гомогенизаторе грибов помещают в аппарат Сокслета, заливают 100 мл метанола и регулируют нагрев таким образом, чтобы один цикл экстракции завершался за 15 мин. После прохождения 6 циклов метанольный экстракт сливают, отфильтровывают на бумажном фильтре, на воронке Бюхнера. На фильтр предварительно наносят слой силикагеля в виде суспензии в метаноле с таким расчетом, чтобы получить слой силикагеля толщиной около 5 мм. По окончании фильтрации промывают фильтр 100 мл метанола. Полученный маточный раствор после фильтрации переносят в мерную колбу на 500 мл, доводят до метки метанолом и используют для анализа. ### 2.7. Проведение анализа ##### 2.7.1 Условия ВЭЖХ. Скорость подвижной фазы 1 мл/мин. Детектирование проводится при длине волны 303 нм при 0,0025 ед. AUFS. *Примечание.* При приведенных условиях хроматографирования время выхода пика стандартных растворов: бета-аманитин (время выхода около 2 мин.), альфа-аманитин (время выхода 4 - 5 мин.), фаллоидин (8,5 - 9,5 мин.). ##### 2.7.2 Калибровка. 2.7.2.1. Вводят в петлю инжектора 20 мкл стандартного раствора аманитина с концентрацией 1 мкг/мл, измеряют площадь полученного пика стандартного раствора. 2.7.2.2. Повторяют по [п. 2.7.2.1](#p100125) дважды, последовательно введя в хроматограф 10 мкл и 5 мкл стандартного образца. В диапазоне концентраций 5 - 20 мкг/мл зависимость площади пика от массы введенного токсина линейна. Строят градуировочный график. ##### 2.7.3 Измерение концентрации токсинов в образце. 2.7.3.1. Отбирают 20 мкл от полученного по [п. 2.6](#p100115) экстракта (доведенного до 500 мл). Вводят его в хроматограф и определяют площадь пика, совпадающего по времени выхода с пиком стандартного раствора. 2.7.3.2. При отсутствии в введенном образце пика, совпадающего по времени выхода с временем выхода стандартного раствора какого-либо токсина (альфа-аманитина, бета-аманитина, фаллоидина), от 500 мл образца отбирают аликвоту 50 мл, упаривают ее в ротационном испарителе (не досуха) при нагреве не выше 60 °С, остаток растворителя удаляют в слабом токе азота. Остаток растворяют в 0,5 мл метанола, отбирают из него 20 мкл и вводят в хроматограф. 2.7.3.3. При отсутствии пиков токсинов в упаренной аликвоте, считается, что токсин отсутствует в образце в пределах чувствительности метода. ##### 2.7.4 Подтверждение наличия токсина в анализируемом образце. 2.7.4.1. При наличии пика токсина в анализируемом образце, смешивают в шприце 10 мкл образца и 10 мкл стандартного раствора токсина с той концентрацией (10 или 100 мкг/мл), площадь пика которой при калибровке более близка к площади пика токсина в образце. Вводят смешанную пробу в хроматограф. Наличие какого-либо из токсинов в образце считается подтвержденным, если полученный в результате совместного ввода пик аманитина не разделяется на два пика, имеет правильную симметричную форму. ### 2.8. Количественное определение токсинов Измеряют площадь пика токсина в образце (N), и проводят расчет по приведенной формуле: С х N х V х 100 1 К = ------------------ (мкг/кг), S х П х V х R х % 2 где: К - концентрация токсина в сырых грибах и продуктах их переработки, мкг/кг; N - площадь пика токсина в исследуемом образце, кв. см; П - навеска продукта, кг; V - объем анализируемой пробы, мкл; 1 V - объем введенной пробы, мкл; 2 С - концентрация токсина, введенного в хроматограф из стандартного раствора, мкг; S - площадь пика токсина, полученного при вводе стандартного раствора, кв. см; % - степень извлечения токсина из образца; R - коэффициент, учитывающий концентрирование образца (при концентрировании по [п. 2.7.3.2](#p100130) R = 100). Статистическая обработка результатов анализа грибов и продуктов их переработки показала, что относительное стандартное отклонение колеблется от 20 до 30% (при n = 5, Р = 0,89). ---