--- title: "\"МУ 3.5.5.1034-01. 3.5.5. Дезинфекционные средства и технологии. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР. Методические указания\"" number: "МУ 3.5.5.1034-01" status: утратил силу canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-mu-3-5-5-1034-01" --- ## "МУ 3.5.5.1034-01. 3.5.5. Дезинфекционные средства и технологии. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР. Методические указания" # "МУ 3.5.5.1034-01. 3.5.5. Дезинфекционные средства и технологии. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР. Методические указания" (утв. Минздравом России 23.05.2001) > [!WARNING] > Документ утратил силу в связи с изданием Методических указаний МУ 1.3.2569-09, утв. Роспотребнадзором 22.12.2009 > Документ [введен](#p100002) в действие с 1 октября 2001 года. > Документ утратил силу в связи с изданием Методических указаний МУ 1.3.2569-09, утв. Роспотребнадзором 22.12.2009. > [!NOTE] > ИСТОРИЯ ИЗМЕНЕНИЙ НОРМАТИВНО-ТЕХНИЧЕСКИХ АКТОВ ```mermaid flowchart LR n0["МУ 3.5.5.1034-01"]:::rst click n0 "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-mu-3-5-5-1034-01" "МУ 3.5.5.1034-01. 3.5.5. Дезинфекционные средства и технологии. Обеззараживание исследуемого материала, инфицированного бактериями I - IV групп патогенности, при работе методом ПЦР" n1["МУ 1.3.2569-09"]:::doc n0 --> n1 classDef rst fill:#FFEBEB,stroke:#8B0000,color:#000; classDef doc fill:#EBFFEB,stroke:#006400,color:#000; classDef notEnt fill:#FFFFEB,stroke:#FF8C00,color:#000; ```
Утверждаю
Главный государственный
санитарный врач
Российской Федерации,
Первый заместитель
Министра здравоохранения
Российской Федерации
**Г.Г.ОНИЩЕНКО**
23 мая 2001 года ##### 3.5.5 ДЕЗИНФЕКЦИОННЫЕ СРЕДСТВА И ТЕХНОЛОГИИ **ОБЕЗЗАРАЖИВАНИЕ ИССЛЕДУЕМОГО МАТЕРИАЛА, ИНФИЦИРОВАННОГО** **БАКТЕРИЯМИ I - IV ГРУПП ПАТОГЕННОСТИ,** **ПРИ РАБОТЕ МЕТОДОМ ПЦР** **МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** МУ 3.5.5.1034-01
Дата введения
1 октября 2001 года 1. Разработаны Российским научно-исследовательским противочумным институтом "Микроб" (Куличенко А.Н., Касьян И.А., Гаранина С.Б., Майоров Н.В., Тучков И.В., Еремин С.А., Дроздов И.Г., Кутырев В.В.). 2. Утверждены Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации - Первым заместителем Министра здравоохранения Российской Федерации Г.Г. Онищенко 23.05.01.
3. Введены впервые.
## 1. Область применения В настоящих Указаниях предложены способы обеззараживания материала, зараженного или подозрительного на зараженность бактериями I - IV групп патогенности, при проведении генодиагностических исследований методом ПЦР. Указания предназначены для специалистов санитарно-гигиенических, лечебно-профилактических учреждений, генодиагностических центров и лабораторий, применяющих метод ПЦР для обнаружения ДНК возбудителей инфекционных заболеваний. ## 2. Введение Внедрение в практику лабораторной диагностики инфекционных болезней полимеразной цепной реакции (ПЦР) должно быть обеспечено соответствующими методами подготовки проб, предусматривающими обеззараживание исследуемого материала. Используемые обычно в практике табельные средства стерилизации (растворы формалина, хлорамина, перекиси водорода и др.) не могут быть применены при ПЦР-анализе вследствие повреждающего действия на ДНК или ингибирования реакции. В существующих [СП 1.2.011-94](https://bukva.ai/docs/sanitarnye-pravila-011) "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности" не предусмотрено выполнение современных генетических методов, в т.ч. полимеразной цепной реакции, которая в настоящее время широко используется для обнаружения различных микроорганизмов, включая и возбудителей опасных инфекций. В настоящих Методических указаниях для работы с не образующими споры бактериями I - II групп патогенности предлагается обработка объектов мертиолятом натрия и затем лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом. При работе с возбудителем холеры может быть использован метод прогревания при 100 °С в течение 30 мин. Для инактивации не образующих споры микроорганизмов III - IV групп патогенности может быть использован метод термической обработки при 100 °С в течение 30 мин. или лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом. Для обеззараживания материала, содержащего спорообразующие микроорганизмы, в т.ч. Bacillus anthracis применяют методический подход, заключающийся в герминации спор с последующей обработкой пенициллином, прогреванием при 100 °С и обработкой лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом. Разработанные способы инактивации приводят к полному обеззараживанию материала, не повреждают ДНК и не ингибируют ПЦР. ## 3. Нормативные ссылки [СП 1.2.011-94](https://bukva.ai/docs/sanitarnye-pravila-011) "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности" (М., 1994). [СП 1.2.731-99](https://bukva.ai/docs/postanovlenie-4-2) "Безопасность работы с микроорганизмами III - IV групп патогенности и гельминтами" (М., 1999). Инструкция по контролю специфической стерильности экспериментальных препаратов, приготовленных из культур чумного или холерного микробов (Саратов, 1982). Временная фармакопейная статья (ВФС) 42-62-ВС-86 для диагностикума бруцеллезного жидкого для реакции агглютинации. Методические указания "Современные методы микробиологической диагностики туберкулеза" (М., 1975). Руководство по профилактике чумы (Саратов, 1992). ## 4. Описание метода Формула метода Рекомендуемые средства стерилизации материала при ПЦР-анализе имеют следующие механизмы антимикробного действия. Мертиолят натрия необратимо связывается с SH-, NH - и COOH-группами
2
белковых молекул с дальнейшим ингибированием дыхательной цепи микроорганизма. Инактивирующий эффект лизирующего буфера обусловлен действием хаотропного агента - гуанидинтиоцианата, обеспечивающего разрушение клеточных мембран и лизис клеток с последующим выходом ДНК. Метод обеззараживания содержащих споры микроорганизмов основан на прорастании споры в вегетативные клетки при культивировании в благоприятных для герминации условиях. Далее под воздействием температуры (для сибиреязвенного микроба еще и пенициллина) происходит разрушение клеточной мембраны и выход ДНК. Материально-техническое обеспечение Средства измерения [<*>](#p100038) - Весы PG 203 - прецизионные одночашечковые электронные цифровые с функцией обнуления тары и другими вспомогательными функциями, стандартного уровня, максимальная загрузка - 210 г, погрешность при измерении - 0,001 г, (Mettler, Швейцария); - иономер pH-150 (pH-метр-милливольтметр); используется для определения pH буферных растворов, диапазон pH - от 1 до 14, точность - 0,01 pH, температура анализируемой среды - от 10 до 100 °С (Белоруссия). Оборудование <*> --- <*> Указанные средства измерения и оборудование могут быть заменены на аналогичные по характеристикам производства других фирм. - Дистиллятор А1013 - производительность 7,6 л/ч (Barustead, США); - термостат EB - объем от 18 до 1000 л с регулируемым диапазоном температур от 5 до 80 °С (Jouan, Франция); - встряхиватель V-4 типа вортекс - регулируемый (Elmi, Латвия); - микроцентрифуга для пробирок типа "Eppendorf" - CM-50 - 12 х 1,5 ((0,5) мл, до 12000 об./мин., ротор - угловой (Elmi, Латвия); - баня водяная J-12 (18, 30) с корпусом из нержавеющей стали с термометром, на 12, 18, 30 л, вместимостью соответственно 72, 108 и 192, пробирки диаметром 16 мм; максимальная температура 100 °С (Jouan, Франция). Вспомогательные изделия и материалы Вата медицинская [ГОСТ 5556-81](https://bukva.ai/docs/gost-5556-81) Микроцентрифужные пробирки-виалы типа "Eppendorf" 0,5 - 1,5 мл Колбы мерные 50, 100, 200 мл [ГОСТ 12738-77](https://bukva.ai/docs/usloviya-gost-12738-77) Лабораторный штатив ТУ64-17-07-72 Микродозаторы "Ленпипет" Россия, 1 - 20, 20 - 200, 200 - 1000 мкл; Наконечники для микродозаторов
"Ленпипет", Россия
Пробирки ГОСТ 10515-75
Пипетки мерные [ГОСТ 20292-74](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20292-74)
Цилиндры мерные 1 - 25, 1 - 100, 1 - 1000 мл ГОСТ 1770-74 Реактивы и растворы Вода деионизованная стерильная ГОСТ 6709-72 ЭДТА (этилендиаминтетрауксусная кислота) ГОСТ 10652-73 Натрия гидроокись ГОСТ 4328-77 Гуанидинтиоцианат "Serva", Германия Дитиотрейтол "Sigma", США Соляная кислота, х.ч. ГОСТ 3118-67 Спирт этиловый (ректификат) ГОСТ 18300-87 Мертиолят натрия "Sigma", США Бензилпенициллина натриевая соль ## 5. Способы обеззараживания материала, исследуемого методом ПЦР Вся работа с исследуемым материалом, подозрительным на зараженность микроорганизмами I - II групп патогенности, проводится в соответствии с [СП 1.2.011-94](https://bukva.ai/docs/sanitarnye-pravila-011) "Безопасность работы с микроорганизмами I - II групп патогенности". Отобранные для исследования пробы могут быть инактивированы следующими способами. #### 5.1 Материал (кровь, другие биологические жидкости,
экстракты органов, смывы с поверхностей, фильтраты почвы),
подозрительный на зараженность не содержащими споры
бактериями I - II групп патогенности Обработка мертиолятом натрия с прогреванием при температуре 56 °С: к исследуемым образцам добавляют мертиолят натрия, проверенный на бактерицидное действие, до концентрации 1:10000 (0,01%) с последующим прогреванием их при 56 °С в течение 30 мин. Обработка лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при температуре 65 °С: к 100 мкл обработанных мертиолятом натрия образцов (п. 1.1), разлитым в микроцентрифужные пробирки типа "Eppendorf", добавляют 300 мкл лизирующего буфера и инкубируют 15 мин. при температуре 65 °С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным. Далее для выделения ДНК используют метод нуклеосорбции на силикагеле или другом нуклеосорбенте, начиная с этапа добавления сорбента. ПЦР выполняют по общепринятой методике в соответствии с указаниями к ПЦР-наборам изготовителя. Приготовление лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом Гуанидинтиоцианат (конечная концентрация 6 M) - 18 г, дитиотрейтол (0,2 M) - 95 мг и ЭДТА (0,5 M) 1 мг растворяют в 30 мл дистиллированной воды. Готовый раствор, проверенный на бактерицидное действие, хранится в темной посуде в холодильнике до 6 месяцев. #### 5.2 Материал, подозрительный на зараженность не содержащими споры бактериями III - IV групп патогенности Прогревание при 100 °С в течение 30 мин. (кроме ПЦР-анализа крови). Обработка лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при 65 °С в течение 15 мин., как описано в п. 1.2: исследуемые образцы в количестве 100 мкл помещают в микроцентрифужные пробирки типа "Eppendorf", смешивают с 300 мкл лизирующего буфера с гуанидинтиоцианатом и прогревают при 65 °С в течение 15 мин. После лизиса гуанидинтиоцианатом для выделения ДНК используют метод нуклеосорбции на силикагеле, начиная с этапа добавления сорбента. ПЦР выполняют по общепринятой методике в соответствии с указаниями к ПЦР-наборам изготовителя. #### 5.3 Материал, подозрительный на зараженность содержащими споры бактериями II - IV групп патогенности Герминация спор с обработкой пенициллином и прогреванием при 100 °С в течение 10 мин.: исследуемый материал в количестве 0,1 мл засевают в пробирки с 0,9 мл бульона Хоттингера, pH 7,6, и инкубируют с аэрацией при температуре 37 °С в течение 2,5 ч. Добавляют пенициллин (1000 ед/мл) и инкубируют при 37 °С 15 мин. Затем прогревают на водяной бане при температуре 100 °С в течение 10 мин. Обработка лизирующим буфером с гуанидинтиоцианатом и прогреванием при температуре 65 °С: к 100 мкл обработанных, как описано в п. 3.1, образцов, разлитых в микроцентрифужные пробирки типа "Eppendorf", добавляют 300 мкл лизирующего буфера и инкубируют 15 мин. при температуре 65 °С. После выполнения данного этапа материал считается обеззараженным. Далее для выделения ДНК используют метод нуклеосорбции, начиная с этапа добавления сорбента.
ПЦР выполняют в соответстствии с указаниями к ПЦР-наборам изготовителя.
После инактивации проб любым из вышеописанных способов дальнейшие исследования проводятся как с обеззараженным материалом.
---