МУ 2.3.2.3388-16. 2.3.2. Гигиена. Гигиена питания. Продовольственное сырье и пищевые продукты. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками. Методические указания
Актуально на 08.11.2026.
Как цитировать: "МУ 2.3.2.3388-16. 2.3.2. Гигиена. Гигиена питания. Продовольственное сырье и пищевые продукты. Медико-биологическая оценка безопасности генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения с комбинированными признаками. Методические указания". МУ 2.3.2.3388-16. https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-mu-2-3-2-3388-16
(утв. Роспотребнадзором 26.07.2016)
Утверждаю Руководитель Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главный государственный санитарный врач Российской Федерации А. Ю. Попова 26 июля 2016 года
2.3.2 ГИГИЕНА. ГИГИЕНА ПИТАНИЯ. ПРОДОВОЛЬСТВЕННОЕ СЫРЬЕ
И ПИЩЕВЫЕ ПРОДУКТЫ
МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКАЯ ОЦЕНКА БЕЗОПАСНОСТИ ГЕННО-ИНЖЕНЕРНО-МОДИФИЦИРОВАННЫХ ОРГАНИЗМОВ РАСТИТЕЛЬНОГО ПРОИСХОЖДЕНИЯ С КОМБИНИРОВАННЫМИ ПРИЗНАКАМИ
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ МУ 2.3.2.3388-16
1. Разработаны ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии» (Н.В. Тышко, Э.О. Садыкова, А.К. Голомидова, И.В. Гмошинский, А.А. Кочеткова, В.А. Саркисян, В.А. Тутельян); Федеральной службой по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (А.Ю. Попова, И.В. Брагина); Российской академией наук (Г.Г. Онищенко); Институтом биоинженерии, ФГУ «ФИЦ Биотехнологии» РАН (К.Г. Скрябин, И.В. Яковлева, Б.Б. Кузнецов); МГУ им. М.В. Ломоносова (М.П. Кирпичников).
2. Утверждены руководителем Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации А.Ю. Поповой 3 августа 2016 г.
Появление генно-инженерно-модифицированных организмов растительного происхождения (ГМО) второго поколения, в том числе ГМО с комбинированными признаками, привело к необходимости формирования новых подходов к оценке безопасности и процедуры государственной регистрации таких ГМО в Российской Федерации. Анализ мирового опыта в данной области свидетельствует о необходимости дифференцирования набора исследований в зависимости от метода получения ГМО с комбинированными признаками: 1-й метод — «трансформационный» — новый ген (гены) методом генной инженерии вводят в геном уже существующего и зарегистрированного ранее ГМО; 2-й метод — «молекулярный» — геном растения-донора методом генной инженерии трансформируют с помощью вектора, содержащего два или более генов, отвечающих за новые признаки, или с помощью множественных векторов; 3-й метод — «гибридизационный» — два уже существующих ГМО используют в качестве родительских форм для получения гибрида методами традиционной селекции. Линии, полученные с помощью трансформационного и молекулярного методов, считаются новыми ГМО и подлежат регистрационным испытаниям в полном объеме. Линии, полученные с помощью гибридизации, рассматриваются в разных юрисдикциях по-разному: в США, Канаде, Австралии и Новой Зеландии — как продукт обычной селекции, не требующий регистрации при условии, что исходные ГМ-линии уже зарегистрированы; в странах Европейского Союза требуется регистрация каждого нового ГМО, полученного с использованием уже зарегистрированных родительских ГМ линий, однако, с точки зрения безопасности рассматриваются только возможные эффекты взаимодействия двух белков (генов), обеспечивающих проявление новых признаков. При регистрации ГМО с комбинированными признаками, полученных гибридизацией трех и более родительских линий (ГМО высокого порядка), автоматически считаются зарегистрированными все возможные комбинации, сформировавшиеся в результате генетической сегрегации таких ГМО (расщепления признаков в поколениях F1 и выше, в соответствии с законами Менделя). Например, при регистрации ГМО, полученного гибридизацией шести родительских линий, должны быть зарегистрированы все 63 возможных гибрида поколения F1, содержащие рекомбинантную ДНК. Подобный подход применяется в Европейском Союзе, Аргентине, Бразилии, Филиппинах, Парагвае, Уругвае и Японии.
На основании анализа отечественного и международного опыта были разработаны требования к оценке безопасности ГМО с комбинированными признаками, соответствующие принципам регулирования использования ГМО для пищевых целей.
I. Общие положения и область применения
1.1. Методические указания устанавливают требования к проведению оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками.
1.2. Требования, изложенные в настоящих Методических указаниях, применяются на этапе государственной регистрации ГМО с комбинированными признаками, впервые поступающих на продовольственный рынок Российской Федерации.
1.3. Методические указания разработаны с целью обеспечения единой, научно обоснованной системы оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками и учитывают новые методические подходы, как используемые в России, так и рекомендованные международными организациями.
II. Проведение оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками
2.1. Перечень и объем исследований при оценке безопасности ГМО с комбинированными признаками определяются с учетом следующих факторов:
- метода получения ГМО (трансформационный метод, молекулярный метод, гибридизационный метод);
- наличия государственной регистрации исходных ГМ-линий на территории Таможенного Союза — для ГМО, полученных гибридизационным методом.
2.2. В случае если ГМО с комбинированными признаками получен трансформационным или молекулярным методом, оценка его безопасности проводится в соответствии с разделами III - VII данных Методических указаний и включает в себя следующие этапы:
- экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем, содержащих сравнение химического состава ГМО и его традиционного аналога (композиционная эквивалентность), результаты токсикологических, аллергологических и других исследований, результаты пострегистрационного мониторинга в стране-заявителе и других странах;
- экспертную оценку методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО;
- медико-генетическую оценку ГМО;
- оценку функционально-технологических свойств ГМО;
- медико-биологическую оценку безопасности ГМО.
2.3. В случае если ГМО с комбинированными признаками получен гибридизационным методом и исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза, оценка его безопасности проводится в соответствии с разделами III - IV данных Методических указаний и включает в себя следующие этапы:
- экспертный анализ и оценку данных, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих: сравнение химического состава исходных ГМ-линий с химическим составом их традиционных аналогов (композиционная эквивалентность), результаты токсикологических, аллергологических и других исследований, результаты пострегистрационного мониторинга, осуществляемого в странах, где ГМО с комбинированными признаками был зарегистрирован ранее, в случае, если в процессе мониторинга были получены данные о незаданных эффектах генетической модификации;
- экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО;
- подтверждение соответствия показателей качества и безопасности ГМО (содержание токсичных элементов, микотоксинов, радионуклидов, пестицидов и др.) требованиям Технических регламентов Таможенного Союза (ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и/или соответствующих Технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции);
- заключение о результатах оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками, оформленное в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001. При формировании отчета должны быть соблюдены требования к конфиденциальности информации, предоставленной на этапе регистрации исходных ГМ-линий.
2.4. Регистрация ГМО с комбинированными признаками, полученного методом гибридизации трех и более линий, уже зарегистрированных на территории Таможенного союза, означает регистрацию и всех возможных комбинаций этих линий, сформировавшихся в результате генетической сегрегации (расщепления признаков в поколениях F1 и выше, в соответствии с законами Менделя).
2.5. В случае если ГМО с комбинированными признаками получен гибридизационным методом и одна или несколько исходных ГМ-линий не имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза, оценка безопасности такого ГМО проводится в полном объеме, в соответствии с п. 2.2 данных Методических указаний.
2.6. Для проведения исследований, предусмотренных п. 2.2 и 2.3 настоящих Методических указаний, заявитель представляет в аккредитованную лабораторию образцы ГМО и их традиционных аналогов в количестве, достаточном для выполнения полного объема исследований.
III. Экспертный анализ и оценка данных, характеризующих ГМО с комбинированными признаками
3.1. Общая характеристика ГМО с комбинированными признаками включает экспертный анализ данных, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих:
- информацию, позволяющую идентифицировать ГМО (вид, сорт, событие, исходные ГМ-линии, характеристика отличий от немодифицированного организма);
- информацию об исходном организме (таксономическая характеристика, описание способа размножения и распространения, данные о токсических, аллергенных и других неблагоприятных свойствах);
- информацию об организмах-донорах вносимых генов (таксономическая характеристика, история использования);
- информацию о методах генетических модификаций и способах получения ГМО и исходных ГМ-линий (описание методов модификаций, структур векторов, структур вставок);
- информацию о ГМО и исходных ГМ-линиях (описание свойств, приобретенных растениями в результате модификаций, описание структур встроенных генетических конструкций и мест их локализации, характеристику экспрессии встроенных генов (экспрессия в процессе онтогенеза растения, экспрессия в структурных компонентах растения и др.);
- информацию о потенциально возможном взаимодействии встроенных генетических элементов и белков-продуктов генов (при наличии такой информации), а также результатах их взаимодействия.
3.1.1. Для ГМО, полученных молекулярным, трансформационным или гибридизационным (если одна или несколько исходных ГМ-линий не имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза) методами, дополнительно должны быть проанализированы данные о генетической и фенотипической стабильности (должны быть представлены данные, полученные в результате исследований нескольких поколений ГМО).
3.2. Оценка композиционной эквивалентности проводится на основании информации о результатах сравнения химического состава ГМО с химическим составом его традиционного аналога, представленной заявителем. Для ГМО, полученных гибридизационным методом (если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), оценка композиционной эквивалентности производится на основании информации о результатах сравнения химического состава исходных ГМ-линий с химическим составом их традиционных аналогов, представленной на этапе регистрации исходных ГМ-линий.
3.2.1 Оценка композиционной эквивалентности проводится по следующим параметрам:
- содержание белка;
- аминокислотный состав;
- содержание жира;
- жирнокислотный состав;
- содержание углеводов;
- содержание макро- и микроэлементов;
- содержание биологически активных веществ;
- содержание аллергенов, характерных для исходного вида (сорта);
- содержание антропогенных и природных контаминантов (токсичных элементов, микотоксинов, пестицидов, радионуклидов, вредных примесей и др.);
- содержание антинутриентов и других веществ, характерных для растительных организмов исходного вида (сорта).
3.2.2. Перечень показателей варьируется в зависимости от свойств изучаемого растительного организма.
3.2.3. Оценка композиционной эквивалентности ГМО и его традиционного аналога проводится с учетом биологических колебаний значений показателей, характерных для растений данного вида, и справочных данных о химическом составе исходного вида (сорта) растения.
3.2.4. В случае если целью генетической модификации является изменение нутриентного состава растения или его частей (листьев, плодов и др.), этот фактор необходимо учитывать при оценке композиционной эквивалентности.
3.3. Анализ результатов токсикологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих:
- результаты оценки безопасности белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО (молекулярная и биохимическая характеристика белков; наличие или отсутствие гомологии с токсинами белковой природы, а также с белками, обладающими фармакологической или иной биологической активностью (при использовании баз данных PIR, EMBL, SwissProt, GenBank и др.); изучение стабильности белков при обработке, хранении, технологической переработке; влияние температуры и pH, возможные модификации и/или образование стабильных белковых фрагментов в результате различных воздействий; устойчивость белков к обработке протеолитическими ферментами в эксперименте in vitro; исследования острой пероральной токсичности белков в эксперименте на грызунах и др.);
- результаты оценки безопасности нативного продукта (данные 90-дневных исследований на грызунах, данные исследований на молодых быстро растущих животных (цыплятах-бройлерах, ягнятах и др.) в случае, если такие исследования проводились;
- результаты других токсикологических исследований.
3.4. Анализ результатов аллергологических исследований проводится на основании сведений, представленных заявителем или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий (для ГМО, полученных гибридизационным методом, в случае, если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза), включающих:
- результаты оценки аллергенных свойств белков, определяющих проявление заданных признаков ГМО (сравнение с известными аллергенами с использованием баз данных, содержащих информацию о трехмерной структуре и функции известных аллергенов и родственных им белков); определение потенциальной аллергенности белков в иммунохимических исследованиях in vitro с использованием IgE, выделенных из сыворотки крови пациентов, страдающих аллергией; определение устойчивости к воздействию протеолитических ферментов (пепсина и др.); скрининговые исследования с использованием сывороток крови пациентов, страдающих аллергией; дополнительные исследования (в том числе in vivo);
- результаты аллергологических исследований нативного продукта (сравнение набора аллергенов исследуемого ГМО с набором аллергенов его традиционного аналога и др.) в случае, если такие исследования проводились;
- результаты других аллергологических исследований.
3.5. Анализ результатов других исследований (в случае, если такие исследования были выполнены) проводится на основании сведений, представленных заявителем, или представленных на этапе регистрации исходных ГМ-линий, включая результаты применения новейших аналитических методов, таких как профильные технологии и др.
3.6. Анализ результатов пострегистрационного мониторинга, осуществляемого в странах, где ГМО был зарегистрирован ранее, проводится в случае, если в процессе мониторинга были получены данные о незаданных эффектах генетической модификации.
3.7. Анализ научных данных о ГМО с комбинированными признаками, представленных в научной литературе за весь период его использования; анализ научных данных об исходных ГМ-линиях за период, прошедший после их первичной регистрации.
IV. Методы обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО с комбинированными признаками в пищевых продуктах
4.1. Основным методом, используемым для обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО, является полимеразная цепная реакция (ПЦР) и ее модификации. Также для обнаружения ГМО в пищевых продуктах и продовольственном сырье, не подвергавшихся технологической переработке, могут быть использованы иммунологические методы детекции специфичных для ГМО белков.
4.2. Экспертная оценка методов идентификации ГМО с комбинированными признаками направлена на подтверждение их адекватности инструментальной и методической базе, используемой в учреждениях Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека для контроля за обращением ГМО и маркировкой пищевых продуктов, содержащих ГМО.
4.3. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО с комбинированными признаками в пищевых продуктах проводится на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- метод идентификации одного или нескольких трансформационных событий (событие-специфичные тест-системы);
- метод количественного определения одного или нескольких трансформационных событий (событие-специфичные тест-системы);
- протоколы проведения анализов;
- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;
- стандартные образцы состава и свойств.
4.4. Экспертная оценка методов обнаружения, идентификации и количественного определения ГМО, полученных гибридизационным методом (если все исходные ГМ-линии имеют свидетельства о государственной регистрации на территории Таможенного Союза) производится только в случае, если методы обнаружения, идентификации и количественного определения зарегистрированных исходных ГМ-линий с момента их регистрации были модифицированы, усовершенствованы или разработаны вновь.
4.4.1. Идентификация ГМО с комбинированными признаками, полученных гибридизационным методом, сложна по сравнению с идентификацией ГМО, полученных молекулярным и трансформационным методами, поскольку вставки рекомбинантной ДНК и их локализация в геноме гибридизационного события идентичны исходным ГМ-линиям. Результаты ПЦР-анализа таких ГМО укажут на присутствие в образце родительских линий ГМО, как если бы образец содержал их смесь, что делает возможной идентификацию ГМО, полученных гибридизационным методом, только на основании экспертизы документации.
V. Медико-генетическая оценка ГМО с комбинированными признаками
5.1. Медико-генетическая оценка ГМО с комбинированными признаками включает проверку присутствия всех заявленных генетических конструкций методом ПЦР.
5.2 Медико-генетические исследования проводятся на основании сведений, представленных заявителем, включающих:
- описание молекулярной структуры всех заявленных генетических конструкций (нуклеотидная последовательность);
- метод идентификации и количественного определения одного или нескольких трансформационных событий;
- протокол проведения анализа;
- описание праймеров, ДНК-зондов и других необходимых реактивов;
- стандартные образцы состава и свойств.
5.3. Заключение о результатах медико-генетической оценки ГМО с комбинированными признаками оформляется в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001.
VI. Оценка функционально-технологических свойств ГМО с комбинированными признаками
6.1. Перечень и объем исследований по разделу VI определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов, индивидуально для каждого вида исследуемых продуктов.
6.2. Проводится сравнение функционально-технологических свойств ГМО со свойствами его традиционного аналога. Для ГМО, полученного гибридизационным методом, проводится сравнение его функционально-технологических свойств со свойствами традиционных аналогов исходных ГМ-линий.
6.3. Изучаемые функционально-технологические свойства (в соответствии со стандартами на конкретный вид исследуемых продуктов):
- сравнительная органолептическая оценка;
- сравнительная характеристика реологических свойств исследуемого продукта и/или его отдельных фракций;
- сравнительная оценка физико-химических свойств исследуемого продукта и/или его отдельных фракций.
6.4. Заключение о результатах оценки функционально-технологических свойств ГМО с комбинированными признаками оформляется в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001.
VII. Медико-биологическая оценка безопасности ГМО с комбинированными признаками
7.1. Перечень и объем исследований по разделу VII определяются экспертными (учеными) советами соответствующих аккредитованных испытательных центров Российской Федерации на основании анализа представленных материалов.
7.2. Гигиенические исследования ГМО с комбинированными признаками включают определение показателей качества и безопасности:
7.2.1. Перечень показателей безопасности формируется на основании требований Технических регламентов Таможенного Союза (ТР ТС 021/2011 «О безопасности пищевой продукции» и/или соответствующих Технических регламентов, устанавливающих обязательные требования к отдельным видам пищевой продукции).
- содержание токсичных элементов;
- содержание микотоксинов;
- содержание пестицидов;
- содержание радионуклидов;
- содержание вредных примесей;
- микробиологические показатели;
- другие показатели (в случае необходимости).
7.2.2. Перечень показателей качества формируется на основании свойств соответствующего растительного организма, а также анализа представленных заявителем материалов. В случае если заявителем представлены исчерпывающие данные по оценке композиционной эквивалентности ГМО (содержание белка, аминокислотный состав, содержание жира, жирнокислотный состав, углеводный состав, содержание витаминов, макро- и микроэлементов, специфических компонентов, биологически активных веществ, антинутриентов и других веществ, характерных для растений данного вида), исследования могут быть ограничены определением влажности, золы, содержания белка, жира, углеводов, пищевых волокон.
7.2.3. В случае если генетическая модификация направлена на изменение химического состава ГМО с комбинированными признаками, должны быть проведены исследования, подтверждающие заявленные изменения.
7.3. Изучение репродуктивной токсичности и токсичности ГМО с комбинированными признаками проводится в эксперименте на крысах линии Вистар. Токсикологические исследования включают изучение репродуктивной функции крыс поколения F0, пре- и постнатальное развитие потомства поколения F1, а также оценку физиолого-биохимических показателей крыс поколения F0 (на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения).
7.3.1 Схема проведения эксперимента.
, 25 
, 50 
7.3.2. На протяжении эксперимента животные получают полусинтетический казеиновый рацион (ПКР). Исследуемый ГМО и его традиционный аналог включают в состав корма в максимально возможном количестве, не нарушающем баланс основных пищевых веществ. Замена ингредиентов рациона должна быть проведена с учетом содержания белков, жиров и углеводов во вводимом продукте при соблюдении принципа изокалорийности.
Продуктовый набор и химический состав базового ПКР представлены в табл. 1 - 2.
Состав базового полусинтетического казеинового рациона
| Ингредиенты | Кол-во, г | Белок, г | Жиры, г | Углеводы, г | Калорийность | |
| ккал | % | |||||
| Казеин | 23,949 | 20,21 | 0,36 | - | 84,08 | 23,46 |
| Крахмал маисовый | 59,0 | 0,59 | - | 51,07 | 206,64 | 57,65 |
| Масло подсолнечное нерафинированное | 5,0 | - | 4,99 | - | 44,91 | 12,53 |
| Лярд | 2,0 | - | 1,99 | _ | 17,91 | 5,00 |
| Солевая смесь <1> | 3,5 | - | - | - | - | - |
| Смесь в/р витаминов <2> | 1,0 | - | - | 1,0 | 4,00 | 1,11 |
| Смесь ж/р витаминов <3> | 0,1 | - | 0,1 | - | 0,9 | 0,25 |
| L-цистеин | 0,2 | - | - | - | - | - |
| Холин | 0,25 | - | - | - | _ | - |
| Трет-бутилгидрохинон | 0,001 | - | - | - | - | - |
| Микрокристаллическая целлюлоза | 5,0 | _ | _ | - | - | - |
| ИТОГО | 100,0 | 20,80 | 7,44 | 52,07 | 358,44 | 100 |
| <1> состав солевой смеси представлен в табл. 2. <2> 1 г содержит: тиамина (B1) — 0,6 мг, рибофлавина (B2) — 0,6 мг, пиридоксина (B6) — 0,7 мг, никотиновой кислоты — 3,0 мг, пантотената кальция — 1,6 мг, фолиевой кислоты — 0,2 мг, биотина — 0,02 мг, цианокобаламина (B12) — 0,0025 мг, викасола — 0,075 мг, L-метионина — 50 мг, глюкозы — до 1 г. <3> 0,1 мл содержит: ретинола ацетата — 400 МЕ, эргокальциферола — 100 МЕ, \alpha - \text{токоферола} ацетата — 7,5 мг, подсолнечного масла — до 0,1 мл | ||||||
7.3.2.1. В случае исследования ГМО, полученного гибридизационным методом, в рационе лабораторных животных в качестве традиционного аналога используется смесь традиционных аналогов исходных ГМ-линий.
7.3.3 Исследуемые показатели.
7.3.3.1 Интегральные показатели.
7.3.3.2. Репродуктивную функцию оценивают по генеративной и эндокринной функции гонад родительских животных поколения F0, пренатальному и постнатальному развитию потомства поколения F1.
Показатели, характеризующие генеративную функцию.
| Изучаемые показатели [1, 2] | Сроки сбора данных |
| 1 | 2 |
| Эффективность спаривания самцов и самок. Оценивают по способности к оплодотворению самок и самцов, выраженную в процентном соотношении забеременевших самок/оплодотворивших самцов к общему количеству ссаженных самок/самцов. Для получения потомства F1 самок F0 ссаживают с самцами F0 в соотношении 2:1 не менее чем на 7 дней | В период ссаживания половозрелых крыс поколения F0 (возраст не менее 100 дней) с целью получения потомства F1 для оценки постнатального развития. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 30 на группу |
| Эндокринная функция яичников и семенников. Оценивают по содержанию эстрадиола, прогестерона и тестостерона в сыворотке крови | У беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу. У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу |
| Дополнительные исследования | |
| Спермограмма. Оценивают макроскопические параметры эякулята — pH. объем спермы, цвет, время разжижения и вязкость эякулята, а также характеристики клеточных элементов спермы — количество, подвижность, жизнеспособность, морфологию сперматозоидов, количество и типы лейкоцитов, количество и типы незрелых клеток сперматогенеза и пр. | У половозрелых самцов поколения F0 или F1 (возраст не менее 100 дней). Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу |
| Морфологические исследования семенников (определяют индекс сперматогенеза, среднее количество нормальных сперматогоний в каждом канальце, относительное количество канальцев с 12-й стадией мейоза) | У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
| Морфологические исследования яичников (примордиальные фолликулы, фолликулы с двумя и более слоями фолликулярных клеток, третичные фолликулы, атретические тела, желтые тела, общее количество генеративных форм) | У беременных самок поколения F0 — на 20-й день беременности. Количество самок, взятых на исследование, должно составлять не менее 15 на группу |
Показатели, характеризующие пренатальное развитие потомства.
Показатели, характеризующие постнатальное развитие потомства.
7.3.3.2.1. Раздел отчета по результатам оценки репродуктивной функции крыс должен включать цифровые данные в форме таблиц, содержащих основные сведения, необходимые для суждения о наличии или отсутствии у исследуемого ГМО неблагоприятного действия на репродуктивную функцию и развитие потомства.
7.3.3.3. Физиолого-биохимические показатели состояния здоровья крыс поколения F0 оценивают на основании данных о динамике массы тела, об абсолютной и относительной массе внутренних органов; данных гематологических, морфологических и биохимических исследований, состояния антиоксидантного статуса и функционального состояния систем, осуществляющих защиту организма от воздействия токсичных соединений экзо- и эндогенного происхождения.
7.3.3.3.1 Общий клинический анализ крови.
7.3.3.3.2 Общий биохимический анализ сыворотки крови
7.3.3.3.3 Общий и биохимический анализ мочи.
7.3.3.3.4 Системные биомаркеры.
Система антиоксидантной защиты.
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
| Активность ферментов антиоксидантной защиты. Материал для исследований: эритроциты [3 - 8] - Глутатионредуктаза; - Глутатионпероксидаза; - Супероксиддисмутаза; - Каталаза | У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
| Содержание продуктов перекисного окисления липидов. Материал для исследований: кровь, печень [9 - 11] - Малоновый диальдегид |
Система ферментов метаболизма ксенобиотиков.
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
|---|---|
| Активность ферментов 1-й и 2-й фазы метаболизма ксенобиотиков [12 - 16] Материал для исследований: печень - Общее содержание цитохрома Р-450; - Этоксирезоруфиндеалкилаза; - Пентоксирезоруфиндеалкилаза; - УДФ-глюкуронозилтрансфераза; - ХДНБ-глутатионтрансфераза |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 10 на группу |
| Изучаемые показатели | Сроки отбора материала |
|---|---|
| Общая и неседиментируемая активность ферментов лизосом [17] Материал для исследований: печень - \beta - \text{Галактозидаза} ; - \beta - \text{Глюкуронидаза} ; - Арилсульфатазы A и B |
У самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу |
Интенсивность процессов апоптоза.
7.3.3.3.5 Морфологические исследования
| Исследуемые органы | Методы исследований [18 - 28] |
| Головной мозг; Гипофиз; Сердце; Тимус; Легкие; Печень; Селезенка; Почки; Надпочечники; ЖКТ: желудок, тонкая и толстая кишки; Яичники; Семенники; Простата | Отбор материала у самцов поколения F0 не ранее чем на 100-й день эксперимента. Количество самцов, взятых на исследование, должно составлять не менее 20 на группу. 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования: а) обзорные гистологические исследования 3. Морфометрический анализ |
| Вскрытие погибших в течение эксперимента животных (внеплановый отбор) 1. Макроскопические исследования 2. Микроскопические исследования (перечень исследуемых органов может быть сокращен до минимально необходимого для установления причины смерти): а) обзорные гистологические исследования. | |
| Дополнительные исследования 1. Микроскопические исследования: а) гистохимические исследования; б) иммуногистохимические исследования клеточных популяций и их производных. 2. Электронно-микроскопические исследования |
7.3.3.3.6 Другие исследования.
7.4. Иммунологические исследования ГМО проводятся в эксперименте на мышах линий CBA и C57B1/6 и включают изучение его иммуномодулирующих и сенсибилизирующих свойств по четырем тестам:
- действие на гуморальное звено иммунитета — в тесте определения уровня гемагглютининов к эритроцитам барана;
- действие на клеточное звено иммунитета — в реакции гиперчувствительности замедленного типа (ГЗТ) к эритроцитам барана;
- действие как сенсибилизирующего агента — в тесте чувствительности к гистамину;
- действие на естественную резистентность мышей к Salmonella typhimurium (сальмонеллы мышиного тифа).
В табл. 3 представлены сравнительные характеристики мышей линий CBA и C57B1/6.
Характеристики мышей линий CBA и C57B1/6
| Действующий фактор | Линия мышей | |
| CBA | C57B1/6 | |
| Эритроциты барана | высокочувствительны | низкочувствительны |
| Гистамин | не чувствительны | чувствительны |
| Salmonella typhimurium | не чувствительны | чувствительны |
7.4.1 Схема проведения эксперимента.
| Вид животных | Мыши линий CBA и C57B1/6 |
| Пол | самцы |
| Возраст | половозрелые |
| Исходная масса тела | 18 — 20 г |
| Количество животных в группе в начале эксперимента | Не менее 120 мышей линий CBA в каждой группе Не менее 120 мышей линий C57B1/6 в каждой группе |
| Распределение по группам | Животных каждой линии делят на 2 группы: Группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; Группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО |
| Рацион <*> | Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных |
| Карантин | не менее 7 дней |
| Условия содержания | Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. |
| <*> состав базового рациона приведен в п. 7.3.2 | |
Исследования начинают через 21 день с момента перевода мышей на экспериментальные рационы. В течение эксперимента проводят наблюдения за поедаемостью корма и общим состоянием животных.
7.4.2 Исследуемые показатели.
7.4.2.1. Влияние ГМО на гуморальный иммунный ответ оценивают на основании титров антител после иммунизации эритроцитами барана мышей высокоотвечающей (CBA) и низкоотвечающей (C57BL/6) линий. Для иммунизации животных следует использовать минимальные дозы (5 x 106) антигена.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят 0,5 мл эритроцитов барана (10 млн клеток/мл). Отбор крови для исследований проводят на 7-й, 10-й и 14-й день после введения эритроцитов барана. Сыворотку крови титруют общепринятым методом в реакции гемагглютинации [17]. Реакция основана на способности антител, содержащихся в сыворотке крови иммунизированных животных, склеивать (агглютинировать) эритроциты барана. В 96-луночных плоскодонных планшетах готовят двукратные разведения исследуемой сыворотки в объеме 0,5 мл, начиная с разведения 1:10. В контрольную лунку вносят 0,5 мл физиологического раствора. Ко всем лункам добавляют 0,5 мл 1% эритроцитов барана. Учет реакции ведется после инкубации планшетов в термостате в течение 2 ч при 37 °C. При положительном результате эритроциты оседают на дне лунки планшета в виде зонтика, при отрицательном — в виде пуговки. За титр принимают то последнее разведение исследуемой сыворотки, при которой еще наблюдается положительный результат. Контрольная лунка должна быть отрицательной. Полученные данные обрабатывают методами вариационной статистики с использованием t-критерия Стьюдента. Результаты приводятся в виде M +/- m, где M — выборочное среднее измеряемых величин, m — стандартная ошибка.
7.4.2.2. Влияние ГМО на клеточный иммунный ответ оценивают на основании реакции гиперчувствительности замедленного типа. При выполнении теста антиген вводят двукратно: для сенсибилизации и для разрешения.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий подкожно в межлопаточную область вводят 0,5 мл эритроцитов барана (20 млн клеток/мл). Через пять дней всем мышам в подушечку одной задней лапы вводят разрешающую дозу эритроцитов барана — 0,02 мл (100 млн клеток/мышь); в контрлатеральную лапу — 0,02 мл 0,95%-го раствора хлорида натрия. Местную воспалительную реакцию оценивают через 18 — 20 часов путем определения массы опытной и контрольной лапок. Интенсивность местной реакции определяют по индексу реакции (ИР) [17].
7.4.2.3. Действие ГМО как сенсибилизирующего агента оценивают в тесте чувствительности к гистамину.
Через 21 день эксперимента мышам контрольной (не менее 15 животных) и опытной (не менее 15 животных) групп обеих линий внутрибрюшинно вводят гистамин гидрохлорид (2,5 мг/мышь в 0,5 мл физиологического раствора). Реакцию учитывают через 24 часа по проценту гибели мышей [34].
7.4.2.4. Влияние ГМО на естественную резистентность мышей к S. typhimurium оценивают на модели внутрибрюшинного заражения мышей десятикратно отличающимися дозами S. typhimurium штамм 415. Через 21 день эксперимента мышей контрольной (не менее 45 животных) и опытной (не менее 45 животных) групп обеих линий заражают тремя дозами культуры: 1 000, 100, 10 микробных клеток/мышь. После заражения за животными наблюдают в течение 21 дня. Вычисляют ЛД50, а также процент гибели животных по каждой дозе, затем проводят сравнительный анализ результатов [18].
7.5. Аллергологические исследования ГМО с комбинированными признаками проводятся в эксперименте на лабораторных животных: потенциальную аллергенность оценивают, определяя тяжесть протекания системной анафилаксии и уровень циркулирующих сенсибилизирующих антител (субклассов IgG1 + IgG4) у крыс, получающих в составе рациона исследуемый ГМО (группа «опыт») и его традиционный аналог (группа «контроль»). В случае исследования ГМО, полученных гибридизационным методом, в рационе лабораторных животных в качестве традиционного аналога используется смесь традиционных аналогов исходных ГМ-линий. Метод основан на количественной сравнительной оценке тяжести реакции системной анафилаксии, возникающей при внутрибрюшинной (в/б) сенсибилизации взрослых крыс пищевым антигеном — овальбумином куриного яйца (OBA) с последующим внутривенным (в/в) введением сенсибилизированным животным разрешающей дозы того же белка [35].
7.5.1 Схема проведения эксперимента
| Вид животных | Крысы линии Вистар |
|---|---|
| Пол | Самцы |
| Возраст | Половозрелые |
| Исходная масса тела | 150 — 180 г |
| Количество животных в группе в начале эксперимента | Не менее 25 особей в каждой группе |
| Распределение по группам | Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО |
| Рацион (состав базового рациона представлен в табл. 4) | Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных. Рацион не содержит яичного белка |
| Карантин | Не менее 7-ми дней |
| Условия содержания | Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении |
| Продолжительность эксперимента | 29 дней |
| Отбор материала для исследований | На 29-й день эксперимента |
7.5.2 Исследуемые показатели.
На 1-й, 3-й, 5-й день опыта крыс в/б сенсибилизируют OBA, а на 21-й день эксперимента вводят дополнительную («бустерную») дозу антигена, уменьшенную в 10 раз в сравнении с первоначальной. Кормление рационами продолжают до утра 29-го дня эксперимента и затем вводят раствор OBA в/в, после чего оценивают на протяжении 24 ч тяжесть развивающейся реакции анафилаксии по показателям числа летальных реакций, общего числа судорожных реакций и величины анафилактического индекса [36]. Непосредственно перед введением разрешающей дозы у крыс отбирают 0,1 — 0,2 мл крови из хвостовой вены для определения уровня специфических антител.
Иммуноферментное определение уровней циркулирующих специфических антител к OBA проводят согласно [19]. Статистическую обработку результатов проводят согласно U-критерию Фишера для долевых показателей, непараметрическим критериям хи-квадрат и Манна-Уитни.
7.6. Генотоксикологические исследования ГМО с комбинированными признаками проводятся в эксперименте на лабораторных животных. Оценка потенциальной генотоксичности ГМО включает выявление повреждений ДНК и выявление мутагенной активности в эксперименте in vivo. Метод выявления мутагенной активности основан на учете хромосомных аберраций в метафазных клетках пролиферирующих тканей [20]. Регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет) [21].
7.6.1 Схема проведения эксперимента.
| Вид животных | Мыши линии C57B1/6 |
| Пол | Самцы |
| Возраст | Половозрелые |
| Исходная масса тела | 18 — 20 г |
| Количество животных в группе в начале эксперимента | Не менее 15 особей в каждой группе |
| Распределение по группам | Животных делят на 2 группы: группа «контроль» получает рацион с включением традиционного аналога исследуемого ГМО; группа «опыт» получает рацион с включением исследуемого ГМО |
| Рацион <*> | Пищевая и биологическая ценность рациона полностью удовлетворяет физиологические потребности животных |
| Карантин | Не менее 7-ми дней |
| Условия содержания | Животные получают свободный доступ к корму и воде; содержатся в отапливаемом, вентилируемом помещении. |
| Продолжительность эксперимента | 30 дней |
| Забор материала для исследований | На 30-й день эксперимента |
| <*> состав базового рациона приведен в п. 7.3.2 | |
7.6.2 Исследуемые показатели:
- в основе метода выявления мутагенной активности лежит регистрация видимых структурных нарушений хромосом в клетках костного мозга на стадии метафазы. Анализируют 100 метафаз от каждого животного. Учитывают число одиночных и парных фрагментов, хроматидных и хромосомных обменов, ахроматических пробелов (гепов) и разрывов по центромере, число клеток с множественными повреждениями и клеток с полной деструкцией хромосом. Оценку результатов цитогенетического анализа проводят путем сопоставления долей клеток с хромосомными аберрациями в контрольной и опытной группах;
- регистрация повреждений ДНК предусматривает оценку целостности структуры ДНК методом щелочного гель-электрофореза изолированных клеток (метод ДНК-комет). Метод основан на регистрации различной подвижности ДНК и возможных фрагментов ДНК лизированных клеток, заключенных в агарозный гель, в постоянном электрическом поле. При этом ДНК мигрирует к аноду, формируя электрофоретический след, напоминающий «хвост кометы», параметры которого зависят от степени поврежденности исследуемой ДНК. Общая схема метода включает получение гель-слайдов (подложки), получение микропрепаратов, лизис, щелочную денатурацию, электрофорез, нейтрализацию/фиксацию, окрашивание и микроскопический анализ.
Микроскопический анализ проводят на эпифлуоресцентном микроскопе с соответствующими для конкретного красителя фильтрами при увеличении 200х — 400х. На каждый микропрепарат анализируют не менее 100 «ДНК-комет». Анализ «ДНК-комет» может проводиться визуально или с помощью программно-аппаратного комплекса.
7.7. Заключение о результатах медико-биологической оценки безопасности ГМО с комбинированными признаками оформляется в виде отчета в соответствии с требованиями Межгосударственного стандарта ГОСТ 7.32-2001.
Список литературы
1. Меньшиков В.В. (Ред.) Лабораторные методы исследования в клинике. М.: Медицина, 1987. 368 с.
2. Мальцев Г.Ю., Васильев А.В. // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 56 — 58.
3. Мальцев Г.Ю., Орлова Л.А. // Вопр. мед. химии. 1994. № 2. С. 59 — 61.
4. Костюк В.А., Потапович А.И. // Вопр. мед. химии. 1987. № 3. С. 115 — 118.
5. Дингл Дж. Лизосомы. Методы исследования. М.: Мир, 1980. 344 с.
6. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. Руководство. М.: Медицина, 1990. 384 с.
7. Западнюк И.П. и др. Лабораторные животные. Разведение, содержание, использование в эксперименте. 3-е изд. Киев: Вища школа, 1983. 383 с.
8. Киселева А.Ф. и др. Морфофункциональные методы исследования в норме и при патологии. К.: Здоров'я, 1983. 163 с.
9. Лакин Г.Ф. Биометрия: Учеб. пособие для биол. спец. вузов. 4-е изд., перераб. и доп. М.: Высш. шк., 1990. 352 с.
10. Лойда З., Госсрау Р., Шиблер Т. Гистохимия ферментов. Лабораторные методы. М.: Мир, 1982. 272 с.
11. Луппа Х. Основы гистохимии. М.: Мир, 1980. 343 с.
12. Микроскопическая техника: Руководство / Под ред. Д.С Саркисова, Ю.Л. Перова М.: Медицина, 1996. 544 с.
13. Ноздрачев А.Д., Поляков Е.Л. Анатомия крысы. С.-Пб.: Лань, 2001. 464 с.
14. Пальцев М.А., Аничков Н.М. Патологическая анатомия. В 2-х т. М.: Медицина, 2000. 1944 с.
15. Полак Д., Норден С.В. Введение в иммуноцитохимию: современные методы и проблемы. М.: Мир, 1987. 74 с.
16. Струков А.И., Серов В.В. Патологическая анатомия. М.: Медицина, 1993. 688 с.
17. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств / Под ред. Миронова А.Н. Ч. 1. М.: Гриф и К, 2012. 944 с.
18. Ведомости фармакологического комитета. 1999. № 1. С. 31 — 36.
19. Гмошинский И.В., Кржечковская В.В., Пятницкий Н.Н. // Вопросы питания. 1994. № 1, 2. С. 30 — 33.
20. Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ / Под ред. Хабриева Р.У. 2-е изд., перераб. и доп. М.: ОАО «Издательство „Медицина“, 2005. 832 с.»
21. Применение метода щелочного гель-электрофореза изолированных клеток для оценки генотоксических свойств природных и синтетических соединений: Методические рекомендации. М., 2006. 27 с.
22. Weingard K., Brown G., Hall R. et al. // Fundamental and applied toxicology. 1996. Vol. 29. P. 198 — 201.
23. Mills G.C. // J. Biol. Chem. 1959. Vol. 234. № 3. P. 502 — 506.
24. Niashikimi M., Rao N., Jagi K. // Biochem. Biophys. Res. Commun. 1972. Vol. 46. P. 849 — 854.
25. Oshino N., Chance B. // Arch. Biochem. Biophys. 1973. Vol. 154. № 1. P. 117 — 131.
26. Tillotson J.A., Sauberlich H.E. // J. Nutrition. 1971. Vol. 101. P. 1459 — 1466.
27. Ernster L., Nordenbrandt K. // In Methods in Enzymology. Oxidation and phosphorilation. Estabrook R.W., Pullman M.E., eds., Ac. Press N.Y. 1967. Vol. 10. P. 574 — 580.
28. Michara, M., Uchiyama, M., Fukuzawa, K. 1980. // Biochem. Med. Vol. 23, Issue 3, P. 302 — 311.
29. Burchell B., Weatherill P. // Methods Enzymol. 1981. Vol. 77. P. 169 — 176.
30. Burke M.D., Mayer R.T. // Chem.-Biol. Interact. 1983. Vol. 45. P. 243 — 258.
31. Habig W.H., Pabst M.J., Jacoby W.B. // J. Biol. Chem. 1974. Vol. 294. P. 7130 — 7139.
32. Omura T., Sato R. // Biol. Chem. 1964. Vol. 239. P. 2370 — 2378.
33. Umegaki K., Saito K., Kubota Y. et al. // Jpn. J. Pharmacol. 2002. Vol. 90. P. 345 — 351.
34. FAO/WHO Protein quality evaluation. Report of a Joint FAO/WHO Expert Consultation Held in Bethesda, Md, USA, 4 — 8 December, 1989, FAO Rome. 2 p.
35. Stokes C.R., Miller B.G., Bourne F.J. Animal models of food sensitivity. Food allergy and intolerance. London. 1987. P. 286 — 300.
36. Weigle W., Cochrane C., Dixon F. // J. Immunology. 1960. Vol. 85. P. 469 — 477.