Ботулизм. Методические указания
(утв. Главным государственным санитарным врачом СССР 22.10.1969 № 824-69)
Внимание
Документ утратил силу на территории Российской Федерации в связи с изданием Приказа Минздрава России от 03.12.2020 № 1283.
Утверждаю Заместитель Министра здравоохранения СССР Главный санитарный врач СССР П.БУРГАСОВ 22 октября 1969 г. № 824-69
Подготовлено Институтом эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи АМН СССР, кафедрой инфекционных болезней МОЛМИ, Всесоюзным научно-исследовательским институтом консервной и овощесушильной промышленности, кафедрой гигиены питания Центрального ордена Ленина института усовершенствования врачей, Институтом питания АМН СССР и Министерством здравоохранения СССР.
ВВЕДЕНИЕ
Выполнение установленных технологических режимов изготовления продуктов питания, а также строгое соблюдение санитарного режима производства на пищевых предприятиях обеспечивают высокие гигиенические показатели качества выпускаемых промышленностью пищевых продуктов, в том числе их безопасность в отношении возможности возникновения случаев заболеваний ботулизмом среди потребителей.
Вместе с этим за последние годы отмечается увеличение числа заболеваний ботулизмом, вызываемых продуктами, заготовленными впрок в домашних условиях, что связано, в первую очередь, с широким использованием населением способа заготовки продуктов, особенно грибов, в герметически закрытых банках.
Ботулизм может возникнуть внезапно и в месте, где ранее никогда не наблюдался, что вызывает необходимость всесторонней подготовки медицинских работников лечебных учреждений и санитарно-эпидемиологической службы по эпидемиологии, профилактике, диагностике, клинике и лечению этого тяжелого заболевания, сопровождающегося высоким процентом летальных исходов, особенно если диагноз ставится поздно, что исключает раннее использование общих и специфических средств лечения.
Каждый врач, а также средний медицинский работник должны знать ботулизм, грамотно решать вопросы диагноза и лечения этого заболевания, квалифицированно разъяснять населению опасность пренебрежения правилами обработки и домашнего консервирования продуктов.
Настоящее указание предназначено для подготовки медицинских работников лечебно-профилактических и санитарно-эпидемиологических учреждений. Оно является вместе с тем руководством, содержащим основные современные положения, касающиеся ботулизма.
1. Распространение возбудителей ботулизма в природе
Возбудители ботулизма широко распространены в природе, они встречаются на пяти континентах земного шара и обнаружены в почве, в навозе, на фруктах и овощах, в рыбе, в фураже, в экскрементах теплокровных животных.
При исследованиях почв чаще обнаруживаются штаммы возбудителей ботулизма типов A, B и E и реже типов C и Д. До 1945 г. палочка ботулизма типа E из почвы никем не выделялась и только с накоплением данных, характеризующих культуральные и биохимические свойства этой палочки, а также с широким использованием типоспецифических сывороток типа E находки возбудителя в почве уже не стали редкостью. Более того, в некоторых странах, таких, как Англия, США, Япония, находки палочки типа E стали более частыми, чем палочки типа A и B. Обычными субстратами, которые обсеменены палочкой типа E, являются прибрежная почва, а также ил заливов и морей.
Малочисленность выделения штаммов типов C и Д, скорее всего, можно объяснить их большой требовательностью к анаэробным условиям и к питательным средам, что не всеми авторами учитывается при массовых исследованиях. Возможно также, что не все исследователи при постановке реакции нейтрализации применяли сыворотки типов C и Д.
В настоящее время мы не располагаем исчерпывающими данными, характеризующими обсемененность почвы территории нашей страны спорами Cl. botulinum. В известной мере это обусловлено тем, что, имея дело в практике с так называемым рыбным ботулизмом, исследовательские лаборатории все внимание уделяли обследованию крупных бассейнов, имеющих рыбохозяйственное значение. Так, нашими исследователями при изучении районов Северного Кавказа, Азовского и Каспийского морей, Приморского края, Дальнего Востока и Ленинграда возбудитель ботулизма был обнаружен в среднем в 9% проб почвы и 4% проб воды. В почвенных пробах обнаружены возбудители типов A, B, C, E, в пробах воды — тип E. Последний составил 73,9% общего числа положительных находок; он встречался в почве берегов водных бассейнов почти всех исследованных районов. На втором месте по распространенности стоит тип B, выделенный в 16,5% проб, на третьем тип A — в 7,8% и на последнем тип C — 1,8%.
Возбудители ботулизма были обнаружены также в почве берегов озера Балхаш и в почве Армянской ССР (в 33,3% проб).
Обсемененность почвы возбудителями ботулизма обусловливает попадание их на овощи, фрукты и различное пищевое сырье, идущее для приготовления консервов и других продуктов. Возможность и интенсивность заражения продуктов палочкой ботулизма находятся в прямой зависимости от санитарных и технологических условий их обработки и хранения.
Рядом зарубежных исследователей сообщалось о находках спор ботулизма на фруктах и овощах. Наибольшее обсеменение спорами обнаружено на бобах (32%), на разлагающихся растениях (20%) и на перебродивших зеленых кормах (20%).
Отечественными исследователями споры ботулизма были обнаружены на овощном сырье, на овощах в процессе их переработки и на аппаратуре овощеконсервного производства.
При нарушении режима термической обработки консервов Cl. botulinum вместе с токсином обнаруживались также и в готовой продукции. Это связано с тем, что некоторые виды консервов являются хорошей питательной средой для прорастания сохранившихся в них спор и токсинообразования. К таким консервам относится прежде всего кабачковая икра, а также рыбные и мясные консервы. В эксперименте отмечено, что выработка ботулинических токсинов в них может происходить не только при температуре 35°, но и при 16 — 18°, если консервы были заражены массивными дозами спор (не менее 10000 спор на одну банку). Присутствие жизнеспособных возбудителей ботулизма и наличие токсина в консервной банке наблюдалось в ряде случаев при отсутствии бомбажа и изменения органолептических свойств продуктов.
Учитывая, что большинство консервов является хорошей питательной средой для размножения и токсинообразования палочки ботулизма, при осуществлении санитарного надзора за работой консервных заводов следует особое внимание уделять соблюдению гигиенических требований к подготовке и обработке полуфабрикатов и режиму термической обработки готовой продукции, имея в виду, что споры этого микроба могут попадать в полуфабрикаты вместе с остатками почвы на плохо отмытых овощах и фруктах и с земляной пылью, а при нарушении режима стерилизации сохраняться и в последующем интенсивно размножаться и образовывать токсин в продуктах, герметически укупоренных в банках.
Большую опасность в отношении ботулизма представляет также зараженная рыба. Обсемененность ее микробами ботулизма значительна, что зависит от содержания водоема (защита его от загрязнения отбросами, экскрементами животных и людей), от санитарных условий обработки рыбы, от способа ее перевозки и хранения. Примерно в пятой части образцов «красной» рыбы <1>, выловленной в Каспийском и Азовском морях, были обнаружены возбудители ботулизма, причем выяснено, что они содержатся в кишечнике рыбы при ее жизни. Токсинообразование в рыбе может происходить как до засола в случае хранения ее без охлаждения или замораживания, так и в первые дни засола, пока концентрация соли в толще мышц еще недостаточная. При низкой температуре и при высокой концентрации соли токсин ботулизма не образуется. Для исключения возможного обсеменения мышц рыбы возбудителями ботулизма, находящимися в кишечнике, его следует удалять как можно раньше, не загрязняя мышц рыбы его содержимым. Следует также иметь в виду, что обсеменение мышц рыбы может произойти вторично за счет антисанитарных условий перевозки и хранения рыбы.
<1> Под «красной рыбой» (дорогой, ценной) понимается рыба осетровых пород.
Таким образом, загрязнение мяса рыбы микробом ботулизма может наступить эндогенным путем (из кишечника) и экзогенным путем (из внешней среды). Токсин, образовавшийся при неправильном хранении обсемененного мяса рыбы, может быть обезврежен варкой нарезанных кусков рыбы (3 — 4 см) в течение часа при 100°. Однако такая температура не разрушает споры возбудителя и оставшаяся на несколько часов при 15 — 17° проваренная рыба вновь может явиться источником отравления.
В последние годы накопились данные, что возбудители ботулизма встречаются и в частиковой рыбе (омуль, камбала, лещ, бычки, сельдь и др.), которая неправильно готовится в домашних условиях и нередко является причиной ботулизма у людей.
Распространению возбудителей ботулизма во внешней среде способствуют многие теплокровные животные и птицы.
Ботулизм среди различных домашних животных и птиц известен очень давно; по мнению некоторых исследователей, у животных он встречается значительно чаще, чем у людей, и нередко носит характер эпизоотии.
Некоторые животные относительно мало чувствительны к ботулиническому токсину: свиньи, собаки, куры, крысы, дикие птицы и другие. Все перечисленные животные, а список их можно расширить, объединены одним общим признаком: они всеядные и более того, часто питаются гниющими отбросами животного происхождения. Надо полагать, что эта естественная резистентность к ботулиническим токсинам сформировалась в процессе развития этих животных как видовой признак. Свиньи по сравнению с лошадьми отличаются очень слабой чувствительностью к ботулиническим токсинам. Отмечено, что силос, который вызывал ботулизм у лошадей, не оказывал никакого влияния при скармливании его свиньям.
Низкая чувствительность свиней к ботулиническим токсинам и частое носительство этими животными возбудителей ботулизма объясняют то положение, что вызванный мясными продуктами ботулизм у людей чаще всего бывает связан с приемом в пищу продуктов из свинины: окорока, ветчины домашнего приготовления.
Из вышеизложенного следует сделать вывод о необходимости установления строгого надзора за кормом домашних животных, мясо которых употребляется в пищу, а также принимать меры к уничтожению крыс и охране складов и мест изготовления пищевых продуктов от этих грызунов.
2. Ботулизм у людей, его географическое распространение
Ботулизм у людей редкое, но очень тяжелое заболевание, как правило, возникающее неожиданно среди полного здоровья; нередко это бывает после семейного праздничного угощения. Внешне вполне доброкачественные продукты могут вызвать тяжелейшее заболевание, приводящее к смерти. Вспышки ботулизма чаще всего возникают после употребления в пищу продуктов, заготовленных впрок в домашних условиях без соблюдения гигиенических требований.
Ботулизм регистрируется во многих зарубежных странах. Наибольшее количество вспышек зарегистрировано в США, Канаде, Франции, Японии и некоторых других странах.
В США за 65 лет (с 1895 по 1964 г.) наблюдалось 617 вспышек ботулизма, которые охватили 1574 человека, из которых погибли 955 (летальность составляла в среднем 60,0%).
До 1940 г. во Франции отмечалось только 24 заболевания ботулизмом, 3 из которых были смертельными. Во время немецкой оккупации (1940 — 1945 гг.) заболеваемость ботулизмом значительно возросла. В связи с недостатком мяса население тайно забивало свиней, солило и коптило окорок в антисанитарных условиях. За этот период во Франции было зарегистрировано около 500 вспышек ботулизма, включавших более 1000 случаев.
В Японии ботулизм был впервые установлен в 1930 г. В результате усовершенствования методов лабораторной диагностики с 1951 по 1963 г. было зарегистрировано 46 вспышек, вызванных типом E, охвативших 297 человек с 78 летальными исходами.
В России с 1818 по 1913 г. было описано 100 вспышек ботулизма, охвативших 609 человек, из которых 283 погибли (летальность 46,4%). В СССР с 1920 по 1939 г. было 62 вспышки ботулизма, охвативших 674 человека, 176 из них погибли (летальность 25,9%). Увеличение количества случаев ботулизма за этот период по сравнению с данными за 1818 — 1913 гг. объясняется более точной регистрацией вспышек ботулизма. В последующие годы регистрировались лишь редкие случаи ботулизма.
Меуеч (1956), проведя анализ вспышек ботулизма у людей во всем мире, считает, что за последние 50 лет заболело ботулизмом 5635 человек, из которых 1714 умерли.
Следует считать, что это далеко не полные данные, ибо диагностика ботулизма (и клиническая и лабораторная) во многих странах поставлена довольно слабо, поэтому не все случаи ботулизма распознаются и регистрируются. Многие случаи ботулизма часто принимаются за другие болезни. Ботулизм нередко путают с дифтерией, полиомиелитом, энцефалитом, бешенством.
По мнению некоторых ученых ботулизм у людей может быть вызван всеми известными (шестью) типами ботулинического токсина.
С таким взглядом трудно согласиться, если иметь в виду, что не все животные в равной мере чувствительны к этим ядам и выраженная резистентность животных к отдельным ядам (как и, по-видимому, человека) сформировалась в процессе эволюции вида.
Второе обстоятельство, не позволяющее согласиться с этим мнением — это несоответствие зарегистрированных вспышек ботулизма среди животного мира (особенно птиц) вспышкам такого типа среди людей. Известные массивные эпизоотии ботулизма типа C среди водоплавающих птиц в районе Великих Озер, вызвавшие гибель миллионов птиц, не затронули здоровье людей, очищавших эти районы от погибших птиц.
И третье замечание касается частоты заболеваний, вызвавших ботулизм различного типа у людей. То, что токсины типа A, B и E являются наиболее частыми причинами вспышек, — сомнений нет. Но за всю историю изучения ботулизма был описан единственный случай группового заболевания, вызванного токсином типа D (озеро Чад). Никто при этом не умер, и диагноз был поставлен на основе выделения возбудителя типа D, причастность которого к этому легкому заболеванию никто не подтвердил. Что касается типа C, то неоднократное выделение его как причины групповых заболеваний доказывает причастность его к ботулизму человека.
Таким образом, неравнозначность того или иного типа возбудителя ботулизма при заболеваниях людей может обусловливаться неодинаковым распространением разных типов возбудителей ботулизма в природе отдельных стран, местными особенностями и обычаями каждой национальности в способах консервирования пищи, а также видом продуктов, которыми питается население страны, и разной чувствительностью людей к разным типам ботулинических токсинов.
В каждой стране превалирует какой-либо один из трех указанных типов (A, B, E) как причина ботулизма у людей. В США чаще встречается тип A, типы B и E обнаруживаются реже. Во Франции и Норвегии ботулизм связан главным образом с типом B, в Японии почти все вспышки ботулизма вызваны типом E. В Канаде большая часть вспышек вызвана типом E, но встречаются также типы A и B.
В СССР в прошлом встречались вспышки, вызванные главным образом типами A и B; тип E был описан в нескольких вспышках. За последние годы в связи с широким применением диагностических сывороток типов A, B, C, E возрос процент вспышек, где были типированы микроб и токсин, вызвавшие отравление; 1/5 всех вспышек в СССР обусловлена возбудителем ботулизма типа E; чаще других выделяется тип B.
Знание типов возбудителей ботулизма, которые чаще встречаются у нас в стране, помогает правильно проводить профилактику и лечение ботулизма.
Особенностью эпидемиологии ботулизма в мире за последние 15 лет является выявление в ряде стран значительного количества вспышек ботулизма, вызванных типом E.
Большой интерес и огромную важность для дальнейших практических выводов по профилактике, диагностике и лечению ботулизма представляет знание продуктов, которые обычно вызывают заболевание.
Следует отметить, что во всех странах ботулизм связан с продуктами, главным образом, домашнего приготовления (консервированные в банках, маринованные, копченые, вяленые и т.д.), когда люди готовят пищу дома, нарушая гигиенические требования. Однако следует отметить, что в США в 1963 г. было зарегистрировано 9 вспышек ботулизма (типа E и A) от коммерческих продуктов, которые охватили 25 человек; 9 из них погибли. Из 9 вспышек 7 отравлений были вызваны рыбой, упакованной под вакуумом в пакеты из полиэтиленовой пленки.
В других странах мира почти во всех вспышках ботулизм типа E был связан с рыбой или морскими млекопитающими. Обычно это плохо проваренная или приготовленная в сыром виде пища.
В Японии ботулизм типа E связан всегда с употреблением национального блюда «изуши», куда входит сырая рыба, на Аляске у эскимосов — с особым блюдом из мяса белого кита, у индейцев, живущих в Северной Америке на побережье Тихого океана, — с икрой лосося.
В США основным источником ботулизма является плохо простерилизованные или маринованные овощи и фрукты, содержащие недостаточный процент кислоты. Из 617 случаев, имевших место в США с 1899 по 1964 г., 383 были вызваны овощными консервами, 51 случай — фруктовыми консервами, 45 случаев — мясными продуктами, около 60 случаев — рыбными продуктами.
В Канаде большинство случаев были обусловлены рыбой. Во Франции, Дании, Норвегии, Швеции, Югославии и других странах Европы ботулизм связан, главным образом, с ветчиной и рыбой домашнего приготовления.
В России основной причиной ботулизма у людей была красная рыба (балыки, соленая, копченая, вяленая, свежая в недоваренном виде) и отмечались лишь единичные случаи, вызванные соленым лещом и сельдью. Подавляющее большинство случаев вызваны севрюгой, белугой, осетриной, белорыбицей.
Преобладание заболеваний ботулизмом от красной рыбы по сравнению с заболеваниями от других пород рыб было настолько велико, что привело некоторых исследователей к категорическому утверждению, что «рыбий яд» ни в каких иных породах рыб, кроме красной, не содержится.
С 1920 по 1939 г. из 62 случаев ботулизма 46 были вызваны красной рыбой, 8 — частиковой, остальные 8 — колбасой, ветчиной, мясом тюленя и в одном случае — кабачковой икрой.
Процент случаев ботулизма от частиковой рыбы стал больше и появились случаи ботулизма от мясных и овощных продуктов. Это вполне согласуется с исследованиями ряда советских авторов, которые обнаружили бациллы ботулизма не только в кишечнике красной рыбы, но и частиковой рыбе, а также с высокой обсемененностью почвы, в связи с чем может иметь место не только эндогенный, но и экзогенный путь заражения как красной, так и частиковой рыбы, а также возможно заражение других пищевых продуктов почвой.
Таким образом, установившийся издавна взгляд, что красная рыба является почти исключительно источником заболеваний ботулизмом рыбного происхождения, был поколеблен. Частиковая рыба и другие пищевые продукты все чаще стали встречаться как причина ботулизма у людей в Советском Союзе.
Анализ материалов расследования зарегистрированных за последние 10 лет в СССР случаев ботулизма показывает, что в основном заболевания были вызваны продуктами домашнего изготовления. Это, в первую очередь, рыба соленая, вяленая и др. (29,8%), грибы консервированные в герметически закрытых банках (20,8%), консервы домашнего изготовления — овощные и фруктовые (16,9%), мясные (2,8%).
Случаи ботулизма, вызванные консервированными грибами, начали регистрироваться с 1963 г. и в 1967 г. они составили 37,5% всех зарегистрированных в этом году случаев ботулизма от продуктов домашнего изготовления.
Случаи ботулизма от частиковой рыбы домашнего приготовления возникали в районах, расположенных вокруг или вблизи озера Байкал, и причиной отравления в них чаще всего был байкальский омуль. Слабосоленая рыба в этих случаях употреблялась в пищу в сыром виде.
Другая группа районов, где возникал ботулизм от частиковой рыбы, расположена вблизи Каспийского, Черного и Азовского морей. В этих местах причиной отравления были различные породы частиковой рыбы: окунь, бычки, чехонь, кефаль, сазан.
Большую опасность в отношении ботулизма представляют различные продукты из свинины (сырокопченые окорока, ветчина) домашнего приготовления и копчения. Продукты из свинины по частоте случаев ботулизма, вызванных ими, занимают четвертое место. Случаи ботулизма от этих продуктов возникали в районах, где население разводит свиней и больше употребляет в пищу свинину. Такие вспышки ботулизма отмечались на Украине, в БССР и в Прибалтийских республиках. Единичные случаи встречались и в других союзных республиках.
Из других продуктов, приготовленных в домашних условиях, причиной ботулизма были овощи, консервированные с нарушением технологии (баклажанная икра, перец фаршированный; маринованные баклажаны, огурцы и свекла, консервированная черемша), и фрукты (компоты абрикосовые). Эти консервы за последние годы вместе с консервированными грибами заняли первое место по количеству вызванных ими случаев ботулизма. Чаще случаи эти отмечались в южных районах нашей страны в городах: Грозный, Волгоград, Ставрополь, в Азербайджанской ССР, Грузинской ССР, Казахской ССР. В этих случаях овощи и фрукты плохо отмывались от почвы, где часто встречаются споры палочки ботулизма. Споры, оставшиеся на овощах и фруктах, при длительном хранении консервов в герметически закрытой посуде при повышенной температуре даже после кипячения в течение 30 — 60 минут прорастали и образовывался токсин.
Анализ случаев ботулизма, имевших место в СССР за последние годы, показывает, что меньшее количество случаев бывает в зимне-весенние месяцы — с декабря по апрель. В это время окружающая температура является менее подходящей для размножения и токсинообразования микробов ботулизма в пищевых продуктах.
В мае, когда температура воздуха начинает повышаться, количество случаев ботулизма, связанных с рыбой и свининой домашнего посола, возрастает и наибольшее число их достигает летом (июнь, август).
Случаи ботулизма от грибов наблюдаются, как правило, зимой, так как консервированные грибы люди обычно употребляют в осенне-зимние месяцы года.
Летальность при ботулизме в разных странах варьирует от 1,5 до 76,2%. Это зависит от ряда причин: от проведения профилактических мероприятий, от продуктов, которые являются причиной отравления, от типа ботулинического токсина, который встречается в этих пищевых продуктах, а также от быстроты постановки клинического, лабораторного диагноза и начала специфического лечения.
Очень высокая летальность наблюдается при случаях ботулизма, вызванных овощами, фруктовыми консервами, меньше процент летальности от ботулизма, обусловленного рыбой, и чаще более низкая летальность от свиных продуктов.
В США при случаях ботулизма, причиной которых в 75% были консервированные овощи и фрукты, летальность составляла 81,5%.
В Канаде зарегистрировано 34 случая ботулизма от овощей домашнего консервирования с 18 летальными исходами — 53%, а в 18 случаях, вызванных мясом морских млекопитающих, заболело 52 человека, из которых 28 погибли (летальность 54%).
В то же время в довоенной Германии, где ботулизм от консервированных овощей являлся редкостью, летальность составляла 13,8%. Большинство случаев там было связано с ветчиной, колбасами, реже ботулизм был вызван рыбой.
Во Франции 93% всех случаев были вызваны свиными продуктами, летальность там составляла 1,5%.
В Японии ботулизм вызывает рыба, и летальность составляет 28%.
Таблица показывает зависимость летальности от пищевого продукта в СССР, которую следует связать также с типом токсина, чаще встречающимся в этом продукте.
ЛЕТАЛЬНОСТЬ ПРИ БОТУЛИЗМЕ В СССР В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА, ПОСЛУЖИВШЕГО ПРИЧИНОЙ БОЛЕЗНИ (1958 — 1967 ГГ.)
3. Иммунитет к ботулизму
Перенесенное заболевание не оставляет иммунитета к ботулизму. О повторных заболеваниях ботулизмом имеются сообщения в литературе. Так, в 1946 году у одного мужчины наблюдался ботулизм после употребления домашних консервов. Больной выздоровел. В 1952 г. этот человек повторно заболел также после употребления в пищу домашних консервов. Из консервов был выделен токсин типа B. Лечение сывороткой и анатоксином привело к выздоровлению.
К.М. Аянян (1967) наблюдал ботулизм с типичными симптомами у двух детей в 1963 г. и повторно у них же через год. В 1964 г. обе девочки погибли от ботулизма. Как в первый, так и во второй раз был выделен Cl. botulinum типа A.
Хроническая, длительная интоксикация, вызвана употреблением в пищу продуктов, зараженных токсином ботулизма, может вызвать развитие у животных некоторой устойчивости к токсину и накоплению агглютининов в сыворотке крови. В связи с этим у животных, часто поедающих испорченные продукты, наблюдается значительная резистентность к ботулиническим токсинам. У этих животных наблюдается значительное количество агглютининов в крови.
1. Основные факторы, определяющие характер профилактических мероприятий
Профилактика ботулизма строится, исходя из биологических свойств Cl. botulinum и сведений о его распространении в природе, при этом должны учитываться особенности питания населения.
Ботулизм связан в основном с употреблением в пищу консервированных различным путем и длительно хранящихся продуктов.
Пищевые продукты становятся причиной ботулизма вследствие попадания в них возбудителя ботулизма, слабой термической обработки или плохого высушивания, недостаточного количества соли, кислот и других консервантов, создания анаэробных условий и длительного хранения в тепле. Это — факторы, обеспечивающие условия для развития спор, размножения микробов и токсинообразования.
Возможность роста Cl. botulinum в продукте зависит от штамма, количества попавших микробов, физиологического состояния микроорганизма и состава питательной среды.
Развитие и токсинообразование Cl. botulinum типа A происходит при температурах порядка 10 — 55°, типа B 5 — 55° в тех случаях, когда продукты имеют pH 4,6 — 8,0, содержат не больше 10% NaCl, или до 50% сахара в водной фазе. Благоприятными условиями для Cl. botulinum типа E могут быть температуры порядка 3,3 — 40°, pH 4,8 — 8,0, NaCl 5 — 6% в водной фазе. Требования Cl. botulinum типа F к условиям развития подробно не исследовались, показано только, что он растет и образует токсин при температурах 4 — 10° и выше.
Хотя Cl. botulinum относится к облигатным анаэробам, присутствие воздуха может в некоторых случаях не оказывать тормозящего влияния на его развитие и токсинообразование в продуктах. Это объясняется тем, что окислительно-восстановительный потенциал многих продуктов при хранении в герметичной таре значительно снижается и, кроме того, культура Cl. botulinum, так же как и большинство микроорганизмов из рода клостридий, способны уменьшать окислительно-восстановительный потенциал среды. Благоприятные для развития Cl. botulinum условия в продукте могут создаться также в результате жизнедеятельности в нем других микробов, поглощающих кислород. Термическая обработка продуктов при определенных температурах может уничтожить в них возбудителя ботулизма и разрушить токсин. Результат действия нагревания на культуру будет определяться многими обстоятельствами: типом возбудителя, количеством клеток или спор, видом прогреваемого продукта. Разницей в термоустойчивости спор Cl. botulinum объясняется тот факт, что случаи ботулизма, вызываемые типом E, обычно связаны с продуктами, не подвергавшимися термической обработке, а вспышки, вызываемые типом A или B, чаще всего бывают вызваны консервами домашнего приготовления из овощей, фруктов, мяса, рыбы.
Количество выживших после нагревания спор тем ниже, чем меньше их в продукте до начала нагревания и чем продолжительнее ведется прогревание.
Количество выживших спор возбудителя ботулизма зависит не только от продолжительности нагревания, но и от температуры. Для спор типа A и B установлено, что при повышении температуры на 10° скорость отмирания увеличивается примерно в 10 раз (z = 10°).
Из основных положений по термоустойчивости возбудителя ботулизма вытекают существенные для профилактики ботулизма выводы:
1. Все мероприятия, направленные на уменьшение загрязненности исходного сырья, повышают степень эффективности термической обработки.
2. Термическая обработка продуктов должна быть строго регламентирована по температуре и продолжительности нагревания.
3. Вероятность выживания культуры в результате нагревания при одних и тех же условиях в единице объема продукта (консервной банке, батоне колбасы и т.п.) тем ниже, чем меньше объем единицы продукта. При увеличении объема единицы продукта термическая обработка должна быть усилена не только вследствие ухудшения условий теплопроникновения, но и благодаря увеличению вероятности выживания культуры Cl. botulinum.
Ряд мясных продуктов приготовляют с использованием нитратов и нитритов. Установлено, что ни одна из этих солей в концентрациях, применяемых в промышленности, не может полностью подавить прорастание спор Cl. botulinum. Нитраты и нитриты усиливают ингибирующее действие NaCl. Задерживающее действие нитритов зависит от pH среды, максимум подавляющего эффекта можно наблюдать при pH 5,6; с повышением pH влияние нитритов на подавление развития микроорганизмов уменьшается. Нитраты, присутствующие в среде, уменьшают количество выдержавших нагревание клостридиальных спор.
Кроме добавления нитратов и нитритов, в промышленности для сохранения продуктов прибегают к копчению. Холодное копчение соленых или вареных продуктов (мясо, рыба) приводит к абсорбции продуктами бактерицидных веществ из коптильного дыма. Формальдегид признан как основной возможный ингибитор прорастания спор возбудителя ботулизма в копченой рыбе.
Предельная концентрация консервантов, задерживающих развитие возбудителя ботулизма, зависит от исходного числа имеющихся в продукте спор. Многие продукты промышленного изготовления предохраняют от порчи и от возможности развития в них культуры ботулизма комбинированным действием нагревания и добавления консервирующих агентов (соли, сахара, кислот) или хранением при низкой температуре. При комбинированном применении летального фактора и задерживающих консервантов концентрацию каждого из консервантов устанавливают в зависимости от особенностей рецептуры и технологии изготовления продуктов. Обширными исследованиями показано, что при комбинированной обработке возможно гарантировать продукт от развития культуры ботулизма при более низком количестве консервантов в продуктах, чем при использовании только одного антимикробного агента.
Вид тары, в которую упаковываются готовые продукты, в зависимости от материала, может влиять или не влиять на развитие культуры и продуцирование токсина ботулизма. В литературе отмечено замедленное развитие и токсинообразование возбудителя ботулизма в жестяных банках по сравнению со стеклянными; в лакированных жестяных банках с овощными натуральными консервами возбудитель ботулизма хорошо развивается и продуцирует токсин, а в нелакированных банках токсин в этих продуктах может не обнаруживаться.
Пленочная упаковка мясных и рыбных продуктов получила в последнее десятилетие широкое распространение. В пленки упаковываются не только сырые, но и кулинарно подготовленные продукты, которые предназначаются для непосредственного употребления. В целях предупреждения развития культуры ботулизма продукты, упакованные в пленки, должны храниться при низких температурах и не дольше установленных сроков даже при сохранении хороших органолептических показателей. При этом следует принимать во внимание, что хотя возбудитель ботулизма типа E способен развиваться в подходящей среде при длительном (месячном) хранении при 3,3°, споры этой культуры более, чем культуры типа A или типа B чувствительны к влиянию NaCl, нитритов, концентрации рассола, pH среды и другим ингибирующим агентам. Поэтому экспериментально для каждого продукта имеется возможность подобрать рецептуру и условия хранения, которые гарантируют в течение определенного времени безопасность продуктов, упакованных в пленки, для здоровья человека.
Чаще продукты, в которых образовался токсин, по внешнему виду выглядят испорченными, в них нарушается структура тканей, последние размягчаются, появляется неприятный запах, образуется газ. В герметически укупоренной таре возникает бомбаж — жестяные банки или крышки на стеклянной банке вздуваются. Но зафиксировано немало случаев, когда токсин обнаруживался в продуктах без существенного изменения их внешнего вида.
Не должно быть различия в санитарной подготовке основного пищевого продукта и добавляемых к нему вспомогательных материалов. С небольшим количеством вспомогательного материала, например, с черным перцем, может вноситься в приготовляемый продукт больше микроорганизмов, чем с основным сырьем. При этом споры и клетки возбудителя ботулизма могут попасть в приготовляемый продукт не только с тем компонентом, в котором они могут развиваться, но и с компонентом, на котором культура ботулизма не развивается.
Технологические процессы на предприятиях пищевой промышленности должны быть отработаны так, чтобы при каждой операции исключалась возможность прорастания спор возбудителя ботулизма или выхода вегетативных клеток из покоящегося состояния.
Профилактика ботулизма при изготовлении продуктов питания как в промышленных, так и в домашних условиях должна включать в себя комплекс мероприятий, которые можно разделить на три группы:
1. Защита пищевого продукта от попадания в него возбудителя.
2. Правильная тепловая обработка продукта, обеспечивающая гибель вегетативных форм микроба и инактивацию токсина, гибель спор (стерилизация).
3. Предупреждение возможности развития спор, размножения микроба и образования токсина в готовом продукте.
Широкое распространение палочки ботулизма в природе (почва, содержимое кишечника животных, особенно свиней, водоплавающей птицы, рыбы и т.д.) ставит на первое место среди мероприятий по профилактике ботулизма необходимость максимального ограждения возможности попадания в продукты питания спор ботулизма. Это строгое соблюдение чистоты при обработке сырья, тщательная очистка и промывка проточной водой сырья (грибы, овощи, фрукты и др.), загрязненного землей, пылью, быстрое и аккуратное удаление кишечника при послеубойной разделке туши, эвентрация рыбы, особенно красной, немедленно после вылова и так далее.
Соблюдение правильного температурного воздействия на сырье в процессе обработки продукта имеет также первостепенное значение в профилактике ботулизма. При строгом соблюдении этого требования может не представить опасности даже продукт, в который только что (1 — 2 часа назад) попали споры микроба ботулизма. Основным и универсальным профилактическим мероприятием является быстрое охлаждение продукта после очистки, промывки, подготовки, если он не подлежит тут же горячей обработке. Немедленное охлаждение следует считать очень важным мероприятием, потому что в дальнейшем такие методы консервирования, как посол, копчение, маринование или использование для этого сахара, не дадут нужного эффекта, если микроб уже успел при хранении в тепле размножиться в изобилии и продуцировать токсин. Последний не инактивируется под влиянием упомянутых консервирующих веществ. Правда, достаточно высокие концентрации этих консервирующих факторов способны задержать прорастание спор, размножение микроба и образование токсина. Однако эти консерванты лишь постепенно проникают внутрь пищевого продукта и до достижения там достаточно высокой концентрации микрофлора в неохлажденном продукте может успеть проявить свою опасную для человека жизнедеятельность.
Правильная горячая кулинарная обработка также имеет большое профилактическое значение. Однако применительно к ботулизму правильная тепловая обработка продукта обеспечивает безопасность его потребления в течение ближайших после тепловой обработки нескольких часов. Имеется в виду, что обработка инактивирует токсин и вегетативную форму микроба ботулизма, но споры могут сохраниться и при дальнейшем хранении пищевого продукта без его достаточного охлаждения, могут прорасти и вновь может образоваться токсин. В таком случае профилактическим мероприятием может явиться повторная тщательная тепловая обработка продукта перед его употреблением.
Стерилизация продуктов в автоклавах в условиях повышенного давления, температуры 120° и длительной экспозиции убивает не только вегетативные формы, но и споры ботулизма. Поэтому правильно изготовленные стерилизованные консервы промышленного производства не представляют опасности в отношении возможности возникновения ботулизма даже после длительного их хранения при комнатной температуре. Это положение ни в коей мере не может быть распространено на консервирование продуктов питания в домашних условиях в герметически закрытых банках. Тепловую обработку этих консервов нельзя считать «стерилизацией», так как температура воздействия на продукт в лучшем случае достигает 100°, не может превысить этого предела в домашних условиях и не убивает могущих попасть в продукт спор палочки ботулизма.
Третья группа мероприятий направлена на создание условий, мешающих развитию спор, размножению микроба ботулизма и образованию токсина в продукте после того, как все меры, предусмотренные в 1-й и 2-й группе, уже приняты.
Эта группа мероприятий имеет большое профилактическое значение для продукции промышленного изготовления, но особенно острое значение приобретает при весьма несовершенном консервировании продуктов питания в домашних условиях в герметически закрытых банках, в связи с чем необходимо особо отметить следующее:
1. Нельзя консервировать в домашних условиях (без наличия автоклава) в герметически закрытых банках мясо и рыбу, являющихся особо благоприятной средой для развития возбудителя ботулизма, а также стелющиеся по земле растения: портулак и другие.
2. Грибы, с которых трудно с полной гарантией удалить все мельчайшие остатки почвы и спор, следует заготавливать в домашних условиях впрок только путем маринования, соления с добавлением в достаточном количестве кислоты, соли по рецептурам и не закрывать их крышками герметически. Несоблюдение этих условий (слабокислая, анаэробная среда) неоднократно приводили к тяжелым последствиям для употреблявших в пищу такую продукцию.
3. Овощи, которые также трудно безупречно отмыть от остатков почвы и не содержащие в своем составе естественной кислоты (огурцы, зеленый горошек и др.) консервировать можно только с добавлением по рецептурам кислоты, которая помешает развитию случайно попавших спор.
4. Все продукты домашнего консервирования следует хранить в холодильнике, холодном месте.
2. Требования к изготовлению различных продуктов в промышленных и домашних условиях
Требования к производству мясопродуктов
Список мясных продуктов, служивших причиной ботулизма, включает свинину, говядину, баранину, курятину, колбасы различных сортов, ветчину, изделия из печени и других субпродуктов. Обсемененность доброкачественного сырого мяса спорами анаэробов сравнительно невысокая.
Свежее мясо при развитии в нем культуры ботулизма становится по своим органолептическим показателям непригодным для переработки. Однако и доброкачественное по органолептическим показателям мясо может содержать микробы возбудителя ботулизма.
Доброкачественность мяса по бактериологическим показателям связана на предприятиях мясной промышленности с условиями его хранения и переработки. При повышенной влажности воздуха (близкой к 100%) и плюсовых температурах в мясе быстро размножаются микроорганизмы, поверхность мяса делается ослизлой, липкой, появляется посторонний запах. При поступлении на заводы подозрительного по органолептическим показателям мяса необходимо провести не только сухой, но и мокрый туалет мяса. Мокрый туалет мяса проводят теплой водой 35 — 40° фонтанирующими щетками, сделанными из капрона или морской травы. Мыть туши тряпками не разрешается. Обработка мяса, обвалка и жиловка обычно проводятся вручную на деревянных досках. Доски пропитываются мясным соком, покрываются слоем жира и служат рассадником бактериальной инфекции. Доски необходимо не только хорошо промывать от остатков мяса, но и прошпаривать их в котле или в автоклаве. В обвалочно-жиловочном помещении должна поддерживаться температура около 12° и относительная влажность воздуха 75 — 80%.
Технология и рецептура изготовления мясопродуктов, получаемых путем посола в сочетании с варкой, копчением или консервированием, в различных странах варьирует, но неизменным считается одно условие — посол мяса проводят при 2 — 4°. Такая низкая температура в сочетании с консервирующим действием посолочных ингредиентов служит гарантией против развития в мясе во время посола микроба ботулизма.
В нашей стране для длительного 3 — 6-месячного хранения обычно вырабатывают копченые мясопродукты, низкая влажность в которых в сочетании с консервирующим действием коптильных агентов задерживает развитие в них микроба ботулизма.
За рубежом большое распространение получило приготовление из посоленного мяса консервов и полуконсервов в герметически укупоренной таре. Установлено, что для инактивации спор возбудителя ботулизма консервы, предназначенные для длительного хранения, должны иметь не менее 6% NaCl (в водной фазе) и получить термическую обработку, эквивалентную 0,6 минуты при 121,1°, т.е. F0 = 0,6. Аналогичные мясопродукты, прогретые до 80° в центре банки, относятся к категории полуконсервов и должны храниться при температурах от 0 до 3°.
Из мясных продуктов домашнего приготовления наибольшую опасность в отношении ботулизма представляют сырокопченые окорока. Сырокопченые окорока промышленного производства у нас почти не вызывали случаев ботулизма. В условиях домашнего приготовления несравненно чаще могут допускаться всякого рода санитарные и технологические нарушения, приводящие к заражению окороков возбудителем ботулизма, к его размножению и токсинообразованию.
Связь ботулизма именно с сырокопчеными окороками объясняется тем, что имеются любители потреблять сырокопченые окорока без проварки, в сыром виде. В случае проварки копченого окорока кусками перед едой (или целиком) токсин и вегетативные формы микроба были бы уничтожены.
Возможность санитарно-технологических нарушений легко себе представить на различных этапах приготовления сырокопченых окороков в домашних условиях:
- убой свиньи на земле или в свинарнике, где при разделке туша может быть загрязнена частицами земли и навоза и инфицирована микробом ботулизма (спорами);
- теплый посол окороков в летнее время (при отсутствии льда, ледника, холодильника), в результате чего легко может иметь место прорастание спор, размножение микроба и образование токсина внутри окорока, куда соль еще не успела проникнуть;
- холодное копчение окорока при температуре окружающего окорок дыма, обычно не превышающей 35 — 40°.
После окончания копчения окорока последний может выдерживать хранение в течение нескольких месяцев без признаков порчи, так как элементы коптильного дыма препятствуют дальнейшему размножению микробов. Более того, микрофлора постепенно отмирает. Вместе с тем токсин микроба ботулизма, образовавшийся ранее, сохраняется.
Требования к изготовлению рыбных продуктов
«Рыбный ботулизм» был одной из самых острых проблем ботулизма в дореволюционной России и в первые годы Советской власти. Рыбное хозяйство в те времена не было механизировано и велось полукустарным способом. В настоящее время в связи с оснащением рыбной промышленности судами-рефрижераторами и применением в промышленности технологии, разработанной с учетом профилактики ботулизма, вспышки ботулизма от рыбопродуктов промышленного производства почти не наблюдаются.
Мясо рыбы разнообразных пород может инфицироваться культурой ботулизма из кишечника, главным образом, если кишечник не удален вскоре после того как рыба заснула или через искусственные ворота инфекции — раны, наносимые рыбе во время улова, транспортировки или складирования, а также из соли. При разгрузке рыбы на плоту необходимо соблюдать меры, предохраняющие рыбу от загрязнения или механических повреждений. Для разгрузки рыбы должны быть устроены специальные разборные помосты или решетки, которые по окончании работы тщательно очищают, промывают горячей водой и дезинфицируют. При массовых поступлениях рыбы допускается разгрузка рыбы на очищенный, промытый и продезинфицированный пол плота.
Если рыба перевозится со льдом, то допускается использование только чистого, не загрязненного опилками или почвой пищевого льда. Рыба, поступающая в производство, до обработки должна быть промыта в проточной воде из шланга или в моечных машинах. При отсутствии проточной воды допускается промывка, в чанах или в специальных ваннах с регулярно сменяемой водой. Разделка рыбы и удаление внутренностей должны быть произведены в строгом соответствии с требованиями, предусмотренными соответствующими технологическими инструкциями и стандартами. В связи с вероятностью наличия инфицированной рыбы и длительностью ее переработки все технологические операции должны протекать в условиях, исключающих возможность развития в рыбе культуры ботулизма. Наиболее распространенным и простым способом продления сроков хранения и консервирования рыбы является посол. Посол необходим не только для приготовления соленых продуктов, но также и при обработке рыбы копчением, вялением и другими способами консервирования. Посол рыбы может проводиться тремя путями: сухим, мокрым и смешанным способом. При сухом посоле тузлук образуется не сразу, проникновение соли в мышечную ткань задерживается, просаливание рыбы протекает неравномерно по высоте чана или другой посолочной емкости. При мокром посоле рыбу помещают в заранее приготовленный раствор соли. При погружении рыбы в тузлук концентрация соли в нем начинает падать, причем восстановить ее добавлением соли бывает трудно и для этого требуется довольно длительное время, так как скорость растворения добавляемой соли меньше скорости выделения воды из рыбы. В этот период рыба часто начинает портиться, и наряду с сапрофитной микрофлорой в ней может активно размножаться микроб ботулизма. Последующее увеличение концентрации соли в тканях рыбы приостанавливает развитие микроорганизмов, но не разрушает образовавшийся в них токсин ботулизма. Для предотвращения возможности порчи рыбы во время посола и образования в ней токсина ботулизма следует применять смешанный посол. При смешанном посоле рыбу, обваленную в соли, загружают в чан или в бочку, на дно которых предварительно налит искусственный тузлук; в этом случае проникновение соли в ткани рыбы начинается немедленно. В зависимости от температурных условий посола, различают теплый, охлажденный и холодный посол.
В настоящее время в промышленности в нашей стране наиболее распространен при переработке рыбы охлажденный посол, который предусматривает охлаждение рыбы в чане с мелкодробленным льдом до температуры 5 — 0° или посол рыбы в охлаждаемых помещениях при температуре 0 — 7°. Крупную жирную рыбу обрабатывают холодным посолом, т.е. рыбу перед посолом замораживают льдосолевой смесью, что предотвращает возможность развития возбудителя ботулизма в глубоких слоях мяса, которые у крупной и тем более жирной рыбы просаливаются очень медленно.
Ткани соленой рыбы обычно содержат 16% NaCl, что достаточно для предотвращения развития возбудителя ботулизма.
Рыба горячего копчения имеет небольшую соленость (1,5 — 2,5% NaCl), но ее коптят в течение 1 — 4 часов дымом при температурах 80 — 170°, что обеспечивает гибель вегетативных клеток и инактивацию токсина ботулизма. Рыба горячего копчения должна быть реализована не позже 3 суток с момента изготовления. Чтобы увеличить срок хранения рыбы горячего копчения, в некоторых случаях ее замораживают. Рыба холодного копчения содержит 5 — 10% NaCl и 48 — 58% воды. Высокое содержание соли в сочетании с антимикробным действием коптильных агентов и низким содержанием воды делает этот тип рыбопродуктов неблагоприятным для развития культуры ботулизма.
Таким образом, основная задача профилактики ботулизма при производстве рыбопродуктов сводится к переработке свежей, не загрязненной рыбы при соблюдении установленных соответствующими инструкциями санитарных и технологических режимов производства.
Балыки из рыбы осетровых пород могут готовиться только из социально подготовленной живой, здоровой, выпотрошенной немедленно после улова рыбы.
Все еще наблюдаются заболевания ботулизмом от соленой, вяленой и копченой рыбы домашней заготовки, в связи с чем необходимо вести пропаганду знаний о рыбном ботулизме среди населения.
Как указано выше, некоторые экземпляры вылавливаемой рыбы могут содержать в кишечнике микроб ботулизма. В живой здоровой рыбе они не способны размножаться и образовывать токсин. После того как такая выловленная рыба погибает, микроб проявляет способность к размножению и образованию токсина. Для того чтобы этого не произошло, чрезвычайно важно свежевыловленную рыбу немедленно подвергнуть охлаждению или замораживанию. В холодное время года этому способствует природный холод, но в теплое время должен быть запас льда для быстрого охлаждения рыбы сейчас же после улова.
Такая свежеохлажденная рыба может подвергаться посолу, но обязательно холодному посолу. После просаливания рыбы, на что требуется в зависимости от размеров рыбы от 2 до 6 — 7 дней, сдерживающим для микроба ботулизма фактором будет достаточно высокая концентрация соли, проникшей в ткань (не ниже 6 — 8%).
Еще лучше перед посолом рыбу выпотрошить. Это, с одной стороны, удалит с кишечником и находящуюся в ней микрофлору, а с другой стороны, даст возможность, опять-таки при холодном посоле, быстрее проникнуть соли в ткани рыбы.
Для приготовления солено-вяленой и копченой рыбы остаются в полной силе требования немедленного охлаждения свежевыловленной рыбы и ее холодного посола.
Домашний посол рыбы осетровых пород не разрешается.
Требования к производству молочных продуктов
Молоко и молочные продукты лишь в нескольких случаях отмечены в зарубежной литературе как причина вспышек ботулизма (брынза, сыр и сгущенное молоко).
Молоко и молочные продукты могут заражаться спорами микроба ботулизма, их обнаруживали в сыре вполне жизнеспособными, но без сопутствующего им токсина. Взаимоотношение факторов, задерживающих или способствующих развитию возбудителей ботулизма в молоке и сыре, пока еще мало изучено. Молоко относится к так называемым «саморедуцирующим» системам. В процессе хранения окислительно-восстановительный потенциал его обычно понижается и в нем создаются анаэробные условия, благоприятные для развития возбудителя ботулизма. Снижению окислительно-восстановительного потенциала молока способствует его пастеризация или стерилизация.
Длительно хранящееся стерилизованное или сгущенное консервированное без сахара молоко может быть подходящей средой для развития культуры ботулизма.
Основой профилактики ботулизма при выработке этих продуктов является борьба за бактериологическую чистоту молока. Гибель спор должна быть, кроме того, гарантирована термической обработкой готового продукта, предназначенного для длительного хранения.
В основе профилактики ботулизма в сыроделии, так же как и при консервировании молока, должна лежать борьба за бактериальную чистоту молока. Пастеризация молока, применение чистых культур и сычужного фермента, свободного от бактерий, предотвращает развитие в сыре посторонней микрофлоры. Своевременное нарастание кислотности в процессе выработки сыров, применение крепкой посолки и выдержка сыра в первые часы после изготовления при пониженной температуре — необходимые условия, повышающие гарантию безопасности сыров против развития в них возбудителей ботулизма.
Требования к обработке овощного, фруктового сырья и зелени
При переработке овощного и фруктового сырья большую опасность представляет загрязнение его почвой. При обследовании овощного сырья возбудители ботулизма были выделены с моркови, пастернака, петрушки. Токсичные культуры присутствовали на исходном сырье, овощах в процессе переработки, на аппаратуре перерабатывающих предприятий. В свеженатертой моркови и свекле и в отжатом соке возбудители ботулизма интенсивно развиваются и продуцируют токсин.
В условиях промышленности способы мытья овощей и фруктов предусмотрены технологическими инструкциями. Для мытья могут быть использованы различные типы машин. Важно, чтобы мытье проходило в проточной или часто сменяемой воде. Для очистки моркови, белых кореньев целесообразно использовать щелочной метод, т.е. обработку корнеплодов в течение 3 — 5 минут в 3% NaOH при 80°. Из аппаратуры, связанной с переработкой овощей, особую опасность представляют резальные машины, волчки, которые во время эксплуатации покрываются слоем сока; в овощах после резки были обнаружены споры возбудителя ботулизма.
Мойка огурцов должна проводиться на специальных машинах, оборудованных капроновыми щетками и ванной для отделения почвы и песка (ММ-1) или на машинах с вращательным движением моющегося сырья (КУВ-1). Режим мойки отрабатывают таким образом, чтобы в 1 мл смыва (при соотношении продукта и воды 1:5) количество микроорганизмов не превышало 10000. Если при консервировании замочка или бланшировка огурцов проводится не в проточной воде, то вода должна меняться не реже чем через каждые 2 часа.
В домашних условиях огурцы следует тщательно мыть с щеткой в проточной воде или меняя несколько раз воду, а консервировать только при условии добавления достаточного количества кислоты.
Зелень может быть не только источником инфицирования продуктов культурой ботулизма, но и непосредственным носителем токсина ботулизма в тех случаях, когда она приготовляется для хранения с добавлением воды.
Соленые и маринованные в домашних условиях бохи, консервированные портулак, черемша были неоднократно причиной вспышек ботулизма.
Большую опасность представляет переработка зелени, поступающей на завод в несвежем виде или хранящейся на сырьевой площадке навалом. Зелень перед мойкой для дальнейшего использования необходимо тщательно инспектировать, отбрасывать гниющую или сухую, желтую. Укроп, листья петрушки, сельдерея и другую ароматизирующую зелень следует мыть, перебирая руками на металлических сетках порциями по 3 — 4 кг, под душем в течение 5 — 6 минут при высоте слоя 15 — 20 см с напором воды 2 — 3 · 105 н/м3. Бактериальная загрязненность зелени после мойки не должна превышать 15000 клеток в 1 мл смывной воды (при соотношении зелени и воды в отобранной пробе 1:5).
В домашних условиях не следует консервировать в герметически закрытых банках зелень, стелящуюся по земле (портулак и др.), не поддающуюся хорошей промывке. Мариновать и солить такую зелень можно только с добавлением достаточного количества кислоты и соли и не закрывать ее герметически.
Требования к переработке грибов
Благодаря богатству белковых соединений и углеводов, грибы являются хорошей питательной средой для развития микроорганизмов. Опыты показали, что развитие и токсинообразование Cl. botulinum В возможно в консервированных в домашних условиях грибах, рассол которых имеет 0,6% NaCl и pH 4,6. При расследовании вспышек ботулизма, вызванных грибами, из последних выделяли культуры типа A, B и E. Инфицирование вероятно явилось следствием плохой мойки грибов, а развитие культуры стало возможным благодаря слабой тепловой обработке и малого количества добавленных соли и уксуса. Развитию культуры способствовало также длительное хранение соленых и маринованных грибов при комнатной температуре.
Количество случаев ботулизма от грибов домашней заготовки в СССР увеличилось, с тех пор как они стали заготовляться в консервных, герметически закатываемых банках.
Нет никакого сомнения, что и при прежнем способе хранения соленых и маринованных грибов (в кадках, бочонках и т.п.) допускались иногда при заготовке и обработке недостаточная их очистка от посторонних примесей, плохая отмывка от земли и песка, однако заболевания не возникали. Объяснение этому следует искать в том, что:
-
изменилась рецептура, при консервировании в банках к грибам стали добавлять меньше соли и уксуса, чем при прежних способах заготовки грибов;
-
микроб ботулизма, являясь облигатным, строгим анаэробом, находит для себя более благоприятные условия для размножения в герметически закупоренных банках. Как бы тщательно ни закрывались деревянные кадки и бочонки, дерево все же пропускает немного воздуха, чего не наблюдается в тщательно закатанных металлических и стеклянных консервных банках.
К этому надо добавить еще одно важное обстоятельство. Грибы, благодаря их пластинчатому или трубчатому (губчатому) строению нижней части шляпки, легко задерживают мелкие частицы почвы. Поэтому грибы относятся к числу тех продуктов, которые с трудом поддаются безупречному отмыванию.
В связи с этим при домашней заготовке грибов следует весьма внимательно и строго соблюдать вышеуказанные требования. Грибы не следует в домашних условиях заготавливать и хранить в герметичных консервных банках.
Обязательным профилактическим мероприятием является хранение соленых и маринованных грибов на холоде, при температуре 0 — 3°. Если содержание уксусной кислоты (по расчету на 100%-ную) в подготовленном для грибов маринаде будет не ниже 6%, при варке в таком маринаде грибов и их дальнейшей выдержке концентрация кислоты понизится за счет воды, содержащейся в грибах, но будет не ниже 0,6%. Маринад готовых выдержанных маринованных грибов должен иметь pH ниже 4,0. Такие грибы можно хранить при температуре не выше 8 — 10°.
Требования к подготовке пряностей, специй и других вспомогательных сухих материалов
Пряности, специи и вспомогательные материалы типа крахмала, молочного порошка, желатина, муки, соли, круп играют существенную роль при приготовлении многих продуктов, предназначенных для длительного хранения. Хотя обширные работы и показали, что эфирные масла многих специй, ингибируют микроорганизмы, специи используются в готовых пищевых продуктах в концентрациях ниже их антимикробного уровня. Установлено также, что специи и другие сухие, вспомогательные материалы могут быть массивно обсеменены микроорганизмами, значительная часть которых представлена анаэробными видами. Натуральные специи в пищевой промышленности целесообразно заменять эфирными маслами, экстрактами или другими приготовленными из них препаратами. Такие препараты свободны от бактерий.
В том случае, когда применяются натуральные сухие специи, их необходимо перед добавлением в продукте подвергнуть тщательной санитарной обработке. При мойке каждый вид пряностей (перец черный и душистый, лавровый лист, гвоздику, мускатный орех и др.) заливают отдельно в чистой посуде 5 — 6-кратным количеством холодной воды и оставляют при комнатной температуре на 30 — 40 минут, затем воду сливают и замачивают пряности повторно на 10 — 15 минут. При употреблении пряностей без измельчения их используют не подсушивая; когда требуется измельчение, их предварительно подсушивают. Черный перец, как наиболее обсемененный вид пряностей, целесообразно стерилизовать в герметически укупоренной таре в течение 50 минут при 120°.
Требования к производству консервов на промышленных предприятиях и гигиеническая оценка баночных консервов домашнего приготовления
В настоящее время в нашей стране консервная промышленность не использует каких-либо способов консервирования, представляющих при выполнении всех установленных требований опасность пищевого отравления, вызванного Cl. botulinum.
Промышленное производство консервов основано на технологических приемах, обеспечивающих гибель или подавление жизнедеятельности Cl. botulinum в готовом продукте.
По отношению к возможности развития в продукте возбудителя ботулизма все консервы делятся на две основные группы:
а) бескислотные и слабокислотные продукты с pH 4,5 и больше, в которых культура ботулизма хорошо развивается и продуцирует токсин;
б) кислотные консервы с pH меньше 4,5, в которых споры Cl. botulinum не развиваются.
Все слабокислотные и бескислотные консервы стерилизуют три температуре 112 — 125°, кислотные консервы пастеризуют при температуре 80 — 100°. Стерилизацию консервов проводят по режимам, гарантирующим гибель спор возбудителя ботулизма. В качестве мирового стандарта, удовлетворяющего этому условию, принято, что термическая обработка стерилизуемых консервов, не содержащих дополнительных консервантов, должна быть не меньше времени, эквивалентному прогреву продукта при 121,1° в течение 3 минут, т.е. иметь F0 = 3 (что соответствует 12Д). Среди ассортимента консервов, вырабатываемых в СССР, особое положение занимают кабачковая и баклажанная икра, фаршированный перец, помидоры и другие овощные закусочные консервы, имеющие pH 4,5 — 5,2. По сложившейся в промышленности практике эти консервы стерилизуют при 115 — 120°, но при стерилизации подвергают термической обработке, эквивалентной 0,2 — 0,6 минутам прогрева при 121,1°, т.е. F0 = 0,2 — 0,6. Исследованиями с искусственным заражением консервов установлено, что в продуктах такого типа споры ботулизма могут развиваться, причем образование токсина происходит в них нерегулярно и, как правило, после продолжительного хранения инфицированных консервов. Токсин ботулизма обнаруживался в опытах тем менее постоянно, чем меньше спор микроба ботулизма было добавлено к продуктам и чем выше была кислотность консервов. Присутствие токсина выявлено в искусственно инфицированных фаршированных помидорах с pH 4,6. Образование токсина в такой кислой среде, по-видимому, объясняется тем, что компоненты, входящие в состав консервов «Помидоры фаршированные», имели различную кислотность. Возможно, что споры палочки ботулизма, попавшие в овощи, обладающие низкой кислотностью, продуцировали токсин. При pH 4,9 — 5,2 споры возбудителей ботулизма развивались в этих продуктах и продуцировали токсин более постоянно. Бомбаж и внешние признаки порчи содержимого отсутствовали во всех токсичных образцах закусочных консервов.
Все перечисленные обстоятельства, касающиеся выработки овощных закусочных консервов и образования в них токсина ботулизма, показывают, что гарантировать безопасность этих продуктов для потребителей производство может лишь при условии высокой санитарной культуры и строгом соблюдении кислотности продуктов, предусмотренной техническими условиями. Особое внимание должно быть обращено на мойку зелени и пряностей, входящую в рецептуру всех закусочных консервов, и санитарную обработку волчка, продуктопроводов и наполнителя.
Фруктовые консервы и маринады благодаря высокому содержанию сахара (варенье, джем, повидло, конфитюр) или высокой кислотноси (маринады, соки, соуса, компоты) являются неблагоприятной средой для развития возбудителей ботулизма. Однако среди консервированных продуктов, являющихся причиной вспышек ботулизма, отмечены: яблочный соус, абрикосовый компот, компот из груш, изделия из инжира, манго, персиков, хурмы и других продуктов. При бактериологическом анализе консервированных томатов, вызвавших вспышку ботулизма, из продукта наряду с Cl. botulinum были выделены другие микроорганизмы — бациллы и даже кокки. Это показывает, что развитие посторонней микрофлоры может способствовать продуцированию токсина ботулизма и в тех продуктах, которые благодаря высокой кислотности являются неподходящей средой для прорастания спор.
Были поставлены специальные опыты по заражению фруктовых соков спорами возбудителей ботулизма одновременно с плесенью. В результате развития плесени в соке через определенный период времени кислотность сока понизилась и образовался ботулинический токсин. Обнаружен токсин ботулизма также в грушевом компоте после инфицирования его массивным количеством спор возбудителей ботулизма, причем внешний вид и запах компота оставались нормальными. Причиной образования токсина ботулизма в грушевом компоте может быть низкая кислотность плодов или замедленная диффузия кислоты из недостаточно сваренных плодов.
При производстве маринадов, консервированных огурцов, фруктовых компотов, соков и соусов прежде всего должно быть обращено внимание на кислотность готового продукта. В случае низкой кислотности плодов (груш, инжира, персиков, абрикос) в консервируемый продукт следует добавлять лимонную кислоту.
Некоторые фрукты, в частности абрикосы, вследствие тонкого волосяного покрова трудно отмыть от загрязнения почвой и пылью. При переработке такого сырья должен быть установлен специальный контроль за качеством мытья.
Перед отправкой фруктовых консервов потребителю необходимо тщательно отбраковывать и не допускать в продажу банок, в которых развилась плесень.
Мясные консервы (говядина тушеная, баранина тушеная, свинина тушеная), рыбные консервы (натуральные, в масле, в томате), овощные натуральные консервы, мясо-овощные, мясо-растительные консервы, консервы диетические или для питания детей являются хорошей средой для продуцирования токсина ботулизма; в них возбудители ботулизма развиваются, даже если в продукт попали единичные клетки Cl. botulinum, но возбудители ботулизма гибнут при стерилизации.
Установлено, что консервы могут инфицироваться возбудителями ботулизма не только во время подготовки и переработки продуктов, но и после окончания процесса подготовки, переработки продуктов, после окончания процесса собственно стерилизации, во время охлаждения банок, в случае их негерметичиости.
В литературе описана вспышка ботулизма, причиной которой была негерметичная банка рыбных консервов из тунца. Заражение консервов произошло в автоклаве, возбудитель ботулизма попал в продукт из недоброкачественной воды через негерметичные швы во время охлаждения.
Тщательный контроль герметичности пустых и закатанных банок и отбраковка на окладе дефектных банок с продуктом является одним из условий гарантии безопасности консервов для здоровья потребителей.
Вода, применяемая на пищевых предприятиях, в том числе и для автоклавных отделений, должна соответствовать по бактериологическим показателям требованиям ГОСТа на питьевую воду. Но удовлетворительные показатели общей обсемененности и коли-титра не всегда гарантируют отсутствие в воде спор анаэробов. Поэтому для воды, используемой мясоперерабатывающей, рыбоперерабатывающей к консервной промышленностью, целесообразно проводить специальный бактериологический анализ на выявление в воде анаэробных бактерий. Хлорирование воды в пределах 5 — 10 мг активного хлора на 1 л обеспечивает гибель анаэробных микроорганизмов в воде, загрязненной не более 100 опорами на 1 мл. Таким образом, профилактика ботулизма при промышленном производстве баночных консервов сводится к следующему:
1. Поддержанию в хорошем санитарном состоянии аппаратуры и оборудования.
2. Использованию питьевой воды, не содержащей анаэробных микроорганизмов.
3. Тщательной мойке сырья и обработке вспомогательных материалов.
4. Проведению переработки продуктов в условиях, исключающих развитие в них возбудителей ботулизма.
5. Установлению кислотности готовых продуктов не ниже определенного уровня.
6. Упаковке продуктов в проверенную на герметичность тару и контролю работы закаточных машин.
7. Применение режимов стерилизации, адекватных по термическому воздействию гибели спор возбудителя ботулизма.
Указанные выше санитарно-технологические факторы дают ответ на вопрос — почему баночные консервы домашнего приготовления нельзя приравнивать к консервам промышленного производства.
Наши консервные предприятия возглавляются специалистами инженерами-технологами; как правило, имеют свою производственную лабораторию, проводящую микробиологический контроль поступающего сырья, подготовленных полуфабрикатов и, если необходимо, готовой продукции, санитарно-микробиологический контроль производственных линий (аппаратуры, оборудования и пр.). Особенно важно наличие на предприятиях автоклавов, обеспечивающих необходимый режим стерилизации при температуре выше 100°.
В условиях домашней заготовки впрок баночных консервов упомянутые выше важнейшие санитарные и технологические элементы их производства не могут в должной мере быть обеспечены, даже если в семье есть квалифицированный в данной области специалист. В домашних условиях исключается возможность должным образом подвергнуть банки заключительной тепловой обработке, т.е. стерилизации, за отсутствием автоклава, температура в котором может быть доведена при необходимости до 110 — 115 — 120°. В домашних условиях тепловая обработка может производиться в кипящей воде, температура которой лишь около 100°.
Помимо этого, современные автоклавы, во избежание срыва крышек при высокой температуре и высоком давлении внутри банок, работают с противодавлением. В домашних же условиях, несмотря на более низкую температуру кипящей воды, крышки со стеклянных банок часто срываются, что нарушает возможность соблюдения герметичности при тепловой обработке.
На основании сказанного баночные консервы домашней заготовки следует считать ненадежными в отношении гарантии невозможности возникновения ботулизма после приема их в пищу.
Поэтому с учетом того, что случаи ботулизма, связанные с домашними баночными консервами, регистрируются за последние годы во все нарастающем количестве, необходимо проведение работниками медицинской лечебной сети, учреждениями санитарно-эпидемиологической службы, домами санитарного просвещения целенаправленной, в зависимости от сезона года и местных условий, широкой пропаганды среди населения знаний о гигиенических требованиях к домашнему консервированию продуктов питания с использованием всех доступных каналов: радио, телевидение, периодическая печать, лекции, беседы и пр. При этом должно предусматриваться освещение следующих, уже частично изложенных выше, основных положений для домашнего консервирования продуктов питания.
1. Не должны изготовляться баночные консервы из мяса, рыбы, грибов, зелени (портулак, бохи и др.).
2. Не должна допускаться торговля домашними баночными консервами на рынках.
3. Консервировать овощи (огурцы, зеленый горошек и др.), не содержащие естественной кислоты, можно только с добавлением кислоты по рецептурам.
4. Необходимость строгого соблюдения чистоты при обработке сырья, недопустимость консервирования лежалых, подвергающихся порче овощей, фруктов.
5. Строгое соблюдение рекомендуемых правил обработки банок, крышек и режимов тепловой обработки продуктов в домашних условиях.
6. Обязательное хранение домашних консервов на холоде (0 — 3°) с отбраковкой и уничтожением бомбажных банок.
7. Рекомендация тщательного прогревания, кипячения домашних консервов перед употреблением, если по виду продукта это возможно.
БИОЛОГИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА ВОЗБУДИТЕЛЕЙ БОТУЛИЗМА
Все шесть типов палочки ботулизма (A, B, C, D, E, F) очень близки по своим морфологическим, культуральным свойствам. Действие некоторых токсинов на чувствительных к ним животных (в эксперименте) или действие токсинов A, B, E, наблюдаемое в клинике (при возникших отравлениях), обусловливает одинаковую клиническую картину.
Однако указанные типы возбудителя отличаются по свойствам вырабатываемых ими токсинов, т.е. они обладают разными антигенными свойствами. Это значит, что токсин каждого типа нейтрализуется только сывороткой такого же типа.
В связи с этим ботулизм, вызванный микробом типа A, можно лечить только противоботулинической сывороткой типа A, а ботулизм, где причиной болезни были возбудители ботулизма другого типа, можно лечить только иммунной сывороткой соответствующего типа.
По морфологии возбудители ботулизма представляют собой небольшие палочки длиной от 4 до 9\mu и шириной от 0,6 до 0,9\mu с закругленными концами. Палочки образуют споры и приобретают при этом вид теннисной ракетки. Эти микробы легко окрашиваются различными анилиновыми красками. Молодые клетки окрашиваются по Граму положительно. При старении культуры (через 4 — 5 суток роста) палочки не окрашиваются по Граму. Микробы подвижны, имеют от 4 до 35 жгутиков, которые расположены по всей поверхности тела микроба (перитрих). При доступе воздуха подвижность микробов быстро ослабевает. Капсулы они не имеют.
Возбудители ботулизма — строгие анаэробы. Они растут без доступа воздуха, поэтому обычно размножаются и образуют токсин внутри больших кусков рыбы, ветчины, колбасы либо в герметически закрытых банках консервов, а также в условиях биологического анаэробиоза. Очень благоприятные условия для образования токсина создаются в продуктах (рыба), упакованных под вакуумом герметически в мешочки из газонепроницаемой полиэтиленовой пленки.
На специальных жидких, питательных средах рост бактерий происходит с помутнением среды и газообразованием, имеется запах прогорклого масла, но эти признаки непостоянны. Нередко банки консервов, в которые вместе с продуктом попадал и возбудитель ботулизма, оказываются бомбажными за счет образования микробом газа, однако иногда при наличии микробов ботулизма и ботулинических токсинов пищевые продукты выглядят внешне доброкачественными, и консервные банки не дают «бомбажа». Необходимо также отметить, что размножение возбудителя ботулизма и образование токсина может иметь в консервах и других продуктах очаговый характер. Токсин может содержаться только в том месте, куда попали споры возбудителя, причем остальная часть продукта остается свободной от токсина.
Оптимальной для роста бактерий типов A, B, C, Д является температура 35°, для типов E и F — 28 + 30°. Установлено, что выработка ботулинических токсинов в консервах может происходить и при 16 — 18°, если консервы были заражены массивными дозами спор (не менее 10000 спор на банку).
Зарубежными исследователями (Schmidt и другие, 1961, Walls, 1967) показано, что споры палочек ботулизма типа E и F могут прорастать, размножаться и образовывать токсин при температуре 3,3°, правда при сравнительно длительной инкубации (31 — 45 дней) и в меньших количествах, чем при 28 — 30°.
Микробы типов A и B обладают сильными протеолитическими свойствами; они расплавляют кусочки печени или мясного фарша в питательных средах; менее выражены протеолитические свойства у типа F, у типов C, D, E способность к протеолизу выражена слабо. В связи с вышесказанным нередко твердые пищевые продукты, в которых развиваются микробы ботулизма, могут выглядеть размягченными ввиду расплавления белковых веществ. Однако и этот признак не является постоянным, так как существуют штаммы возбудителей ботулизма, которые не обладают способностью расплавлять вещества белковой природы.
Самым характерным признаком всех типов возбудителей ботулизма является их способность вырабатывать в анаэробных условиях токсины — яды большой силы. Эти токсины вырабатываются микробами ботулизма в различных консервированных пищевых продуктах: грибах, овощах, рыбе, ветчине, фураже, на искусственных питательных средах. Сила токсинов на искусственных питательных средах может быть от 1000 до 3 млн. смертельных доз для белой мыши в 1 мл.
Ботулинические токсины устойчивы к воздействиям внешней среды (температура, свет, pH, встряхивание, концентрация различных солей). Действие прямого солнечного света и воздуха не разрушает их полностью в течение значительного времени. В кислой среде устойчивость токсинов больше, чем в щелочной среде. Щелочи ослабляют и даже разрушают ядовитые свойства токсинов. Ботулинические токсины обладают значительной теплоустойчивостью. Об этом важно помнить при прогревании различных подозрительных продуктов. Токсин иногда разрушается только при кипячении в течение 10 — 15 минут. Ботулинические токсины устойчивы к высокой концентрации поваренной соли. Если токсин в рыбе или ветчине образовался до засола рыбы, то добавление соли (10%) не разрушает его. Характерной особенностью этих токсинов является их свойство не разрушаться в желудочно-кишечном тракте под влиянием пищеварительных ферментов. Эти яды по силе своего действия превосходят все другие бактериальные токсины и химические яды.
Человек очень чувствителен к ботулиническим токсинам некоторых типов, однако данные о смертельной дозе ботулинического токсина для человека довольно разноречивы. Одни ученые предполагают, что для человека смертельной дозой типа A является 3500 Dlm (смертельных мышиных доз), другие — 250000 Dlm.
В почве, на искусственных средах, в пищевых продуктах, в корме для животных возбудители ботулизма образуют споры. В высушенном состоянии они могут сохранять жизнеспособность десятилетиями. Лишь при благоприятных условиях споры прорастают, бактерии размножаются и вырабатывают токсин. Споры возбудителей ботулизма очень устойчивы к различным химическим и бактерицидным веществам, причем большую роль в их устойчивости к физическим и химическим факторам играет принадлежность спор к тому или иному типу Cl. botulinum. Споры (возбудителей типов A и B хорошо переносят кипячение в течение 5 часов, типа E — менее устойчивы к кипячению, чем типов A и B. Споры типов C и Д занимают промежуточное положение между типами A, B и E. Вновь выделенный тип F обладает высоко термоустойчивыми спорами.
Эксперименты, проводившиеся с целью изучения устойчивости спор палочки ботулизма к воздействию различных физических и химических факторов в пищевых продуктах, показали, что автоклавирование консервов остается пока основным способом уничтожения спор. В тех случаях, когда в консервах остаются неубитые споры, прорастание их и образование токсина может происходить очень быстро.
Установлено, что кипячение не убивает споры в продуктах. Так, красную рыбу заражали токсической культурой палочки ботулизма, содержащей споры, а затем подвергали ее кипячению (от 30 минут до 1 часа). После этого рыба теряла свою ядовитость, так как введенный в нее с культурой токсин разрушался. Однако через 1 1/2 суток хранения при температуре 15 — 17° рыба становилась снова ядовитой. Эти опыты объясняют, почему в отдельных случаях проваренные продукты через некоторое время вызывают смертельные отравления.
Из вышеизложенного следует, что так называемая «стерилизация» продуктов питания в банках в домашних условиях не может обеспечить гибель попавших в банки спор палочки ботулизма.
Важно знать, какое действие оказывает замораживание на споры и токсин палочки ботулизма. Установлено, что споры после длительного содержания в замороженном состоянии сохраняют способность прорастать и образовывать токсин. При хранении продуктов, инфицированных микробами ботулизма, в течение 4 месяцев в замороженном состоянии продуцированный ими токсин не разрушался.
Споры могут переносить воздействие очень низких температур, они не погибают при -190°. Температуру -16° они переносят хорошо в течение года, но при этом часть спор подвергается разрушению, вследствие чего, согласно мнению некоторых авторов, освобождается содержащийся в них токсин. Последнее может привести к тому, что продукты, содержащие большое количество спор, после оттаивания могут быть ядовитыми.
Установлено, что споры возбудителей ботулизма типов A и B обладают более высотой радиорезистентностью, чем споры нетоксигенных клостридий, обычно вызывающих гнилостные процессы в пищевых продуктах. Споры некоторых штаммов ботулинических микроорганизмов могут выдерживать облучение порядка 2,5 — 3 Mrad в зависимости от состава и количества спор на 1 г среды. Споры Cl. botulinum типа E менее устойчивы к облучению, чем типы A и B.
Споры очень устойчивы к химическим дезинфицирующим веществам. формалин при концентрации 20% убивает споры только через 24 часа, 10% раствор соляной кислоты убивает их через 2 часа выдерживания при комнатной температуре; в этиловом спирте могут сохранять жизнеспособность в течение 2 месяцев. Споры не погибают при довольно высоких концентрациях поваренной соли. Введенные в балык, содержащий 14% поваренной соли, они оказались жизнеспособными через 2 месяца. Споры, посеянные в желудочный, кишечный и панкреатический соки, а также в желчь, прорастали и иногда даже вырабатывали токсин.
ПАТОГЕНЕЗ БОТУЛИЗМА И ПАТОЛОГИЧЕСКАЯ АНАТОМИЯ
Основным патогенетическим фактором при ботулизме является ботулинический токсин. Он вызывает гибель организма. Организм человека поражается токсином, имеющимся в пищевом продукте. Имеются, однако, мнения отдельных ученых, что патогенез ботулизма носит токсикоинфекционный характер.
К ботулиническим токсинам чувствительны многие животные и птицы, однако степень чувствительности их к токсинам разных типов различна. Так, морская свинка очень чувствительна к токсину B, норка — к токсину C, лошадь — к токсину типов A, B, C; в то же время кошки, собаки, рогатый скот и свиньи обладают значительной устойчивостью к токсинам типа A и B. Однако, если в корме находится большое количество этих токсинов, и эти животные могут заболеть ботулизмом и погибнуть.
Люди очень чувствительны к токсинам типов A, B, E и F.
При этом следует отметить важную особенность, касающуюся генеза интоксикации токсином типа E. Как известно, на питательных субстратах возбудитель ботулизма типа E образует меньшей силы токсин, чем возбудители типов A, B и F. Однако тяжесть интоксикации и высокая летальность при ботулизме типа E превосходит, как правило, таковые при ботулизме A, B и F. Причиной таких различий является существование токсина E в двух формах: в форме протоксина — незрелого токсина, образовывающегося при росте возбудителя типа E на питательных субстратах при отсутствии ферментов микробного или животного происхождения. Такой малоактивный протоксин, попадая с пищевыми продуктами в желудок, во много крат активизируется ферментами и уже в активном состоянии всасывается в кишечнике. Поэтому освобождение желудка от содержимого как важное лечебное мероприятие при ботулинической интоксикации, обусловленной токсином типа E, приобретает исключительное значение.
Изложение вопросов генеза ботулинической интоксикации, как и генеза любого заболевания, ставит целью объяснить многообразие клинических проявлений ботулизма, их этажность проявления и развития и, основываясь на объективных данных, устанавливающих «точку приложения токсина», воздействовать на этот интимный механизм взаимореакции чувствительных элементов организма с ядом с целью восстановления нормальных функций жизнедеятельности. Важным вопросом генеза ботулизма является причина смерти при этом заболевании, поскольку в зависимости от ответа определяется и тактика медицинского вмешательства.
Многолетний период изучения ботулизма отечественными и зарубежными авторами не продвинул нас вперед в плане предложений по эффективному методу лечения. Устоявшаяся истина о том, что антитоксическая сыворотка является единственным средством лечения и чем раньше она применяется, тем эффективнее, не подвергается ревизии даже тогда, когда в одинаковых условиях лечения один больной умирает, другой выздоравливает. Множество гипотез и недостаточность экспериментальных исследований и детальных клинических наблюдений не являются основой, на которой могла бы строиться рациональная схема терапии ботулизма.
Некоторые авторы утверждают, что в крови токсин проникает в органы, где поражает клетки различных тканей, в первую очередь нервной системы, наиболее чувствительной к ботулиническим токсинам. Резкое поражение сосудов обнаруживается при вскрытии трупов и экспериментально установлено на изолированных органах людей и животных. Вследствие повреждения эндотелия капилляров и прекапилляров центральной нервной системы токсин проникает в ткань головного мозга, вызывая клинические симптомы бульбарного происхождения. При этом в ликворе людей и животных, больных ботулизмом, токсины не обнаруживаются.
Итак, при ботулизме имеет место поражение бульбарных отделов головного мозга без попадания токсина в ликвор.
Признание особой чувствительности нервной системы по отношению к ботулиническому яду, по-видимому, может быть распространено только на двигательную сферу, поскольку область психическая даже в тяжелых случаях отравления, как правило, у больных не вовлекается в процесс.
Выраженные явления миастении и общей адинамии при ботулизме свидетельствуют о поражении двигательной и опорной мускулатуры. В связи с этим резко ослабевает тонус мускулатуры, которая становится тестообразной; происходит замедление пульса, ослабление кишечной перистальтики, изменение секреторной деятельности желез, расширение сосудов кожи и внутренностей. Наиболее демонстративно эти нарушения проявляются тогда, когда в процесс вовлекаются межреберные мышцы и диафрагма.
Механизм такого поражения недостаточно изучен, но в эксперименте показана его обратимость. Нарастающие симптомы мышечной слабости межреберных мышц и диафрагмы в конечном итоге приводят к остановке дыхания и смерти больного. Если бы в основе летального исхода лежали механизмы центрального происхождения (бульбарные поражения), то восстановление жизни было бы крайне трудным. Однако случаи реанимации при ботулизме с использованием искусственных легких заставляют пересмотреть всю тактику медицинского вмешательства и использовать все доступные средства и методы для возвращения к жизни пострадавшего. В эксперименте при ботулинической интоксикации установлены две важные закономерности: первая заключается в том, что введение животному одномоментно различных типов токсина приводит в итоге к суммации токсического действия; вторая связана с феноменом парадоксальной чувствительности, когда многократное и частое введение токсина вызывает летальный исход, хотя общая доза его не превышала половины смертельной дозы. Установлено, что ботулинический токсин типа A избирательно действует на периферические холинергические нервные окончания, в то время как адренергические ткани не чувствительны к нему.
Кроме пищеварительного тракта, токсин может проникнуть и через дыхательные пути, как это имело место в ФРГ (1962 г.), когда три сотрудника, работавшие с морскими свинками, находившимися в камере с распыленным токсином, заболели ботулизмам в результате вдыхания пыли, содержащей ботулинический токсин.
Описаны также случаи раненого ботулизма, когда возбудитель этой болезни попадал в рану с почвой, там размножался и вызывал отравление. Наблюдался раневой ботулизм у мужчины после ранения пилой, у девочки после ранения ног и груди, у мальчика после огнестрельного ранения.
Ботулинические токсины выделяются из организма с мочой, желчью и фекалиями. Эти выделения можно использовать для лабораторной диагностики ботулизма.
При вскрытии трупов людей и животных, погибших от ботулизма, обнаруживается резкая гиперемия всех внутренних органов, сопровождающаяся множественными мелкими и крупными кровоизлияниями. Оболочки головного мозга сильно гиперемированы, встречаются геморрагии. В ткани мозга обнаруживаются тромбозы, дегенеративно-некрологические, деструктивного характера поражения эпителия сосудов. Стенки сосудов ткани мозга разрыхлены. Наиболее поражены ганглиозные клетки нервной системы. Наблюдается вакуолизация протоплазмы, распад ядра. Форма клеток изменяется, отростки отпадают, изменения также происходят в нейроглии.
В сердце волокна соединительной ткани набухают, наблюдается явление некробиоза. Происходит фрагментация миокарда; поперечная полосатость исчезает. Сосуды сердца резко переполняются кровью, обнаруживается набухание эндотелия в капиллярах и мелких сосудах. Местами некробиоз.
Легкие наполнены кровью, отечны. Картина резкой геморрагической пневмонии; в некоторых случаях имеется опеченение отдельных участков легкого, а иногда и целых долей. Капилляры легкого резко расширены, переполнены эритроцитами в альвеолах скопление эритроцитов. Печень полна кровью, увеличена, буроватого цвета, дряблой консистенции. При микроскопии отмечается зернистое перерождение клеток печоночной ткани, жировая альтерация, набухание коллагеновых волокон соединительной ткани, диссоциация печеночной паренхимы.
В почках сильно изменен эпителий извитых канальцев, в прямых канальцах дегенеративные изменения.
Слизистая пищеварительного тракта резко гиперемирована. В слизистой желудка точечные и более крупные кровоизлияния; она набухшая, желтоватого цвета, разрыхлена, очень легко разрывается. Сосуды кишечника резко инъецированы и придают серозной оболочке «мраморный» рисунок, слизистая кишечника набухшая, при микроскопии обнаруживается расширение сосудов, повреждение стенки и выход эритроцитов.
Из скелетных мышц сильнее всего поражаются мускулатура грудной клетки, брюшной стенки и конечностей.
Мышцы имеют «вареный», с сероватым оттенком вид; при микроскопии обнаруживается расширение сосудов, стаз в капиллярах, исчезает поперечнополосатая исчерченность, волокна набухают, имеют вид, как при ценкеровском перерождении.
КЛИНИКА, ДИАГНОСТИКА И ЛЕЧЕНИЕ БОТУЛИЗМА
Клиническое течение. Инкубационный период при ботулизме продолжается от 6 до 30 часов, удлиняясь в редких случаях до нескольких дней. Чаще инкубационный период составляет 8 — 12 часов. Тяжелым формам болезни, связанным с массивным поступлением в организм токсина возбудителя, свойствен и более короткий инкубационный период.
Болезнь начинается остро в первые 2 — 3 часа от начала ее возникает недомогание, общая разбитость, выраженная миастения (мышечная слабость), незначительная головная боль, ухудшается сон и аппетит. Вскоре появляется значительная сухость во рту, ощущение жажды; у некоторых больных имеются умеренно выраженные боли в животе, продолжающиеся первые 2 — 3 дня заболевания. Ранним и довольно часто встречающимся симптомом ботулизма является рвота, которая может повторяться в течение первых двух дней болезни. Сначала рвотные массы содержат остатки пищи, затем в них присутствуют слизь и примесь желчи.
Характерным симптомом служит запор, который может наблюдаться на протяжении всего периода клинических проявлений болезни. Нередко запор сочетается с метеоризмом. Как редкая особенность клинического течения ботулизма должно быть отмечено наблюдаемое в первые 2 дня болезни учащение стула, который может быть кашицеобразным или жидким, но не содержит в себе патологических примесей; вскоре, однако, выделение жидких каловых масс сменяется стойким запором. Следует указать, что запор и метеоризм наблюдаются у 75 — 85% больных.
Температура у многих больных может оставаться нормальной или же повышаться на 1 — 2 дня, оставаясь при этом в пределах 37,7 — 38°; какой-либо закономерной температурной кривой отметить обычно не удается. Однако надо иметь в виду, что помимо субфебрилитета у отдельных больных может отмечаться и более значительное повышение температуры — до 39 — 39,5°. Общая продолжительность лихорадочного периода в сравнительно редких случаях может составлять 3 — 5 дней. При распознавании ботулизма врач должен учитывать эти, довольно редко встречающиеся особенности, но также иметь в виду, что в подавляющем большинстве случаев ботулизм протекает при нормальной температуре.
В самые первые часы от начала заболевания может появляться легкое головокружение. Рано проявляется расстройство светоощущения, больной видит все предметы как бы в тумане; некоторые больные, указывая на ухудшение зрения, говорят о том, что какая-то пелена, «сетка» отделяет их от окружающих предметов.
Клиника ботулизма богата неврологическими симптомами, особенно часто в отношении иннервации мышц глазного яблока. Генез этих неврологических симптомов недостаточно изучен, поэтому трактовка их как следствие поражения ядер черепно-мозговых нервов может быть принята лишь в качестве гипотезы. Более вероятно, что в основе неврологических симптомов, как и в явлениях выраженной общей миастении, а также слабости отдельных мышечных групп, лежит поражение или нарушение интимного механизма передачи раздражения с нервного окончания на мышечное волокно. Этими неврологическими симптомами, а также парезом аккомодации объясняется отмечаемое у многих больных ухудшение зрения.
К исходу первых суток от начала заболевания могут наблюдаться различные другие неврологические симптомы, которые встречаются не только изолированно, но могут сочетаться между собой. Наиболее постоянными неврологическими симптомами служат: ухудшение зрения (пелена или «сетка» перед глазами), двоение в глазах (диплопия), расширение зрачков (мидриаз) при неравномерности их величины (анизокория). Различие в ширине зрачков правого и левого глаза может быть резко выраженным. Вследствие диплопии, развивающейся при парезе содружественного движения глаз (расстройства конвергенции), больной не в состоянии читать печатный текст, так как строчки и буквы кажутся ему «разбегающимися». При осмотре больного обращает на себя внимание небольшая инъекция склер, мидриаз и анизокория. У многих больных резко нарушается аккомодация зрения.
Парез глазодвигательных нервов приводит к выраженному косоглазию (страбизму). У отдельных больных может наблюдаться парез взора; при этом у больного отмечается полная неподвижность обоих глазных яблок (симптомом «остановившихся глаз»). В качестве изолированного признака поражения черепно-мозговых нервов, а также в сочетании с другими неврологическими симптомами у ряда больных наблюдается неравномерность ширины глазной щели, развивающаяся вследствие опущения (птоза) верхнего века на одной стороне лица. К числу неврологических симптомов, наблюдаемых с меньшим постоянством, относятся: ограничение подвижности глазных яблок (кнаружи или кнутри), горизонтальный нистагм. У некоторых больных возможен парез лицевого нерва, чаще двухсторонний. При легких формах ботулизма этот парез выявляется с трудом.
Нередки проявления неврологических расстройств, выражающиеся нарушениями глотания, расстройства речи (гнусавый голос или скандированное произношение). У отдельных больных расстройства глотания являются одним из наиболее ранних симптомов болезни, доминирующим во всей ее клинической картине. Эти расстройства обусловлены спазмом констрикторов глотки или мускулатуры шейного отдела пищевода, что препятствует прохождению пищи. Нередко эти расстройства сочетаются с отсутствием глотательного рефлекса, свисанием одной или обеих небных занавесок, отклонением язычка в ту или другую сторону, опусканием одной из небных дужек. Ларингоскопия устанавливает уровень стойкого спазма гладкой мускулатуры, препятствующего прохождению, пищи; чаще он соответствует расположению черпаловидных хрящей. Прохождение по пищеводу не только твердой, но и жидкой пищи становится невозможным.
Затрудненность глотания в части случаев вызывается парезом или параличом констрикторов глотки. В таких случаях дисфагия может сопровождаться также парезом мягкого неба, попаданием пищи в дыхательные пути с развитием аспирационной пневмонии. В конце первого дня от начала заболевания симптомы болезни нарастают. Усиливается сухость во рту, голос больного становится слабым, речь невнятной, запор приобретает стойкий характер. Усиливается расстройство зрения, больной жалуется на мелькание «мушек» и ощущение «сетки» перед глазами; если до этого момента уже имелись страбизм и диплопия, то эти нарушения со второго дня прогрессируют. В первые 2 — 3 дня от начала заболевания кожа становится сухой и бледной вследствие спазма поверхностных кровеносных сосудов. Пульс, как правило, отстает от уровня температуры, может наблюдаться резкая брадикардия. Кровяное давление остается на уровне, свойственном данному больному до момента его заболевания ботулизмом. Начиная со 2 — 3-го дня болезни границы сердца несколько расширяются, тоны на верхушке значительно приглушены, иногда прослушивается легкий систолический шум. Ломкость кровеносных капилляров повышается.
Язык при высовывании отклоняется в ту или другую сторону; спинка его покрыта грязно-белым налетом, ко 2 — 3-му дню болезни он становится сухим. Живот несколько вздут, мягкий и безболезненный при пальпации. Печень и селезенка не увеличены.
Глазные симптомы достигают своего максимального развития к 3 — 5-му дню от начала болезни, некоторые из них могут появляться не с самого ее начала. К нарушениям речи и глотания могут присоединяться мышечные судороги. В первые 2 — 3 дня болезни сухость слизистых оболочек полости рта, жажда являются постоянными симптомами. У ряда больных наблюдается одышка, они жалуются на «замирания» сердца.
Как исключение из общего правила может наблюдаться повышенная саливация, а также воспаление сосочка зрительного нерва с ретинитом, ограничением поля зрения, амблиопией.
Тяжело протекающие случаи ботулизма обычно сопровождаются выраженным расстройством дыхания, в основе которого лежит поражение межреберных мышц и мышц диафрагмы.
Нередко наблюдается парез мускулатуры мочевого пузыря, что приводит к незначительному отделению мочи, несмотря на то, что почки функционируют нормально.
При благоприятном исходе симптомы болезни проявляются на протяжении 4 — 15 дней; однако неврологические симптомы могут носить стойкий характер, продолжая сохраняться до 25 — 30 дней. В случаях, сопровождающихся параличом межреберных и диафрагмальных мышц, когда применялось искусственное дыхание, патологические симптомы могут сохраняться до полутора месяцев.
Диагноз. Болезнь распознается на основании клинической картины с учетом анамнеза и эпидемиологических данных. Необходимо учитывать употребление в пищу инфицированного продукта, содержащего токсин ботулизма; при вспышке заболеваний ботулизмом необходимо принять во внимание наличие других больных, употреблявших тот же пищевой продукт; последний подвергается исследованию на присутствие в нем бактерий ботулизма и их токсина. Диагноз подкрепляется данными лабораторных исследований, в частности, проведением биологической пробы на белых мышах с целью обнаружения токсина бактерий ботулизма в сыворотке крови больных (см. Главу VI. Лабораторная диагностика ботулизма).
При постановке диагноза ботулизма необходимо принять во внимание острое начало болезни, наличие сухости во рту, раннее появление неврологических симптомов, особенно в отношении глаз, дизартрический и дисфагический синдромы, возможность парезов и параличей лицевого нерва.
Дифференциальный диагноз должен проводиться как с инфекционными заболеваниями, сопровождающимися бульбарными расстройствами, так и с различными интоксикациями, вызванными химическими и пищевыми продуктами. Говоря о последних, нужно иметь в виду отравления ядовитыми грибами, в первую очередь бледной поганкой. Однако в отличие от ботулизма при отравлениях бледной поганкой наблюдаются симптомы гастроэнтерита, очень обильное слюноотделение, возможна рвота, вегетативные расстройства. Нередко возникают симптомы токсического гепатита.
В отдельных случаях возникает необходимость дифференциального диагноза с отравлениями метиловым спиртом; необходимо учитывать, что эти отравления сопровождаются ранним и прогрессирующим поражением остроты зрения, что не свойственно больным ботулизмом, у которых расстройства аккомодации, появление «пелены», «мушек» или «сетки» перед глазами не связано с поражением зрительного нерва.
При отравлении атропином, белладонной наряду с параличами глазных мышц наблюдается общее возбуждение, в части случаев потеря сознания, тахикардия.
При наличии подозрения на ботулизм у больного с выраженным неврологическим симптомокомплексом необходимо иметь в виду бульбарные формы полиомиелита и бешенства. Помимо анамнеза, эпидемиологических данных и результатов лабораторных исследований, в диагностике этих случаев заболевания необходимо иметь в виду ряд клинических сходств и различий между ними. Так, в частности, для полиомиелита характерно раннее появление потливости кожи головы, отсутствие сухости во рту, снижение тонуса отдельных мышц или мышечных групп, на что указывают и данные миографии, развитие у 30 — 35% больных парезов или параличей лицевого нерва и, что особенно важно, сохранение вкусовой чувствительности. Вместе с тем при полиомиелите наблюдаются симптомы, не свойственные ботулизму, в том числе: повышение температуры в течение 4 — 5 дней с повторной волной, боли в нервных стволах и в позвоночнике, смешанный лимфоцитарно-нейтрофильный плеоцитоз в спинномозговой жидкости со сменой белково-клеточной на клеточно-белковую диссоциацию. В отдельных случаях требуется дифференциальный диагноз с вирусным полирадикулоневритом.
Для бульбарной формы бешенства типично раннее появление галлюцинаций, возбуждение, нередко мышечные судороги, обильная саливация, гидрофобия. Важную роль играет анамнез — укус или ослюнение животными, вызывающими подозрение на бешенство.
Как правило, тщательный анализ клинических симптомокомплексов, анамнез, эпидемиологические данные и проведение дифференциального диагноза позволяют правильно обосновать диагноз ботулизма. Однако по возможности следует использовать методы лабораторной диагностики, особенно в случаях с маловыраженным неврологическим симптомокомплексом.
Лечение. Все больные ботулизмом, независимо от клинической формы болезни, подлежат госпитализации с тщательным врачебным наблюдением и заботливым уходом.
Приступая к лечению больного, врач должен прежде всего освободить желудок и кишечник от содержимого, что имеет первостепенное значение, особенно в случаях, когда заболевание вызвано токсином типа Е. Не дожидаясь окончательного лабораторного заключения о природе интоксикации и основываясь на клинических и анамнестических данных, врач должен в возможно короткий срок приступить к сывороточному лечению, используя поливалентную сыворотку (ABE). В дальнейшем, после установления типа токсина, вызвавшего заболевание, следует использовать для лечения типоспецифическую моновалентную сыворотку против данного типа.
Разработаны рациональные дозировки сыворотки каждого из этих типов, рассчитанные для взрослого. При первом введении подкожно или лучше внутримышечно взрослому больному при ботулизме, протекающем в средне-тяжелой форме, вводится: 10000 — 15000 международных единиц (МЕ) антитоксической сыворотки типа A, 5000 МЕ сыворотки типа B и 15000 МЕ сыворотки типа E <1>.
<1> Дозы приведены в международных единицах (МЕ), которые не следует смешивать с антитоксическими единицами (АЕ), указываемыми в литературе прошлых лет.
При первом введении применяется по общим правилам дробная десенсибилизация организма, либо выполняется метод десенсибилизации по Безредка.
На протяжении первых суток от начала лечения сыворотка в указанных дозах вводится еще один или (при особо тяжелом течении болезни и поздно начатом лечении) два раза с интервалами 6 — 8 часов между введениями. Во второй, третий и четвертый день лечения соответственно тяжести болезни дозы вводимой сыворотки остаются прежними или могут быть уменьшены до 10000 МЕ для сыворотки типа A, 10000 МЕ сыворотки типа E. Что касается антитоксической сыворотки типа B, то ее следует продолжать вводить в тех же дозах, т.е. по 5000 МЕ. Больным тяжелой формой ботулизма сыворотка вводится в дозах, превышающих вышеуказанные в полтора раза. Если рано установлен тип токсина, вызвавшего ботулизм, можно применять моновалентную сыворотку.
Продолжительность курса сывороточного лечения определяется степенью тяжести течения болезни и получаемым эффектом, который характеризуется исчезновением симптомов со стороны нервной и сердечно-сосудистой системы. В случаях легкого течения болезни сыворотку можно применять в течение двух дней, при среднетяжелых формах болезни требуется вводить сыворотку на протяжении 6 — 7 дней.
Общая продолжительность курса лечения антитоксической сывороткой должна составлять в среднем от 5 до 6 дней; продолжать лечение свыше 7 — 8 дней нецелесообразно в связи с тем, что к этому моменту сыворотка уже успевает связать свободно циркулирующий в крови токсин, а кроме того, начиная с 7 — 8-го дня по отношению к ней организм начинает продуцировать преципитины, парализующие терапевтический эффект сыворотки.
Положительное влияние сыворотки характеризуется уменьшением симптомов интоксикации организма, в первую очередь — ослаблением офтальмоплегического, дизартрического и дисфагического синдромов.
В связи с дезинтоксикационным влиянием и возможным подавлением возбудителя ботулизма, проникшего в кишечник, следует считать целесообразным назначение больным ботулизмом внутрь левомицетина в дозах по 0,5 г 4 раза в сутки на протяжении 4 — 5 дней. Левомицетин должен назначаться только в качестве дополнительного средства лечения ботулизма, поскольку основным методом его терапии является применение антитоксической противоботулинической сыворотки.
При выраженных расстройствах дыхания, обусловленных поражением межреберных мышц и мышц диафрагмы, к применению всей вышеуказанной комплексной терапии необходимо присоединить искусственное дыхание, которое осуществляется после трахеотомии путем подключения больного к аппарату искусственного дыхания. Это возможно лишь после доставки больного в респираторный центр или при наличии на месте безотказно работающей аппаратуры, хорошо инструктированного и обученного медицинского персонала, с постоянным контролем в лаборатории газового состава и биохимических компонентов сыворотки крови, а также обеспечением питания больного через зонд или с помощью питательной клизмы.
Диета больных должна быть разнообразной по составу пищевых веществ и предусматривать введение в организм достаточного количества белков, жиров, углеводов и витаминов. Общий калораж пищевого рациона в сутки должен достигать 2500 — 3000 больших калорий за сутки. Пища должна быть легко усвояемой, полужидкой; рекомендуется 4 приема пищи в сутки. Следует позаботиться о введении в организм повышенных по сравнению с физиологической потребностью количеств витаминов B1, B2 и B6, а также аскорбиновой кислоты. Последнюю назначают в дозах 0,5 г в сутки на протяжении 7 — 8 дней.
При выраженной дисфагии и невозможности глотания прибегают, в зависимости от характера нарушений, к питанию через зонд или применяют питательные клизмы.
Обслуживание больного, у которого внешнее дыхание обеспечивается искусственно, требует круглосуточных дежурств медицинского персонала, контроля за внешним дыханием и обменом веществ в организме заболевшего в течение длительного периода времени. Аппаратное искусственное дыхание может потребоваться на протяжении длительного времени — вплоть до того момента, когда будет достаточно восстановлено активное и самостоятельное внешнее дыхание у самого больного. Благодаря этому удается спасти жизнь тем больным, которые являлись бы обреченными, если бы им не было обеспечено эффективного искусственного дыхания, проводимого наряду с антитоксической терапией.
Во всех случаях среднего и тяжелого течения ботулизма требуется применение неспецифической дезинтоксикации организма, для чего используют капельные внутривенные или подкожные вливания 5% раствора глюкозы пополам с физиологическим раствором. Деятельность сердечно-сосудистой системы по соответствующим показаниям поддерживают применением мягкодействующих препаратов — кордиамина, камфоры и т.п. В случаях коллапса применяют струйные внутривенные вливания инфузионных жидкостей типа поливинилпирролидона; применяют средние терапевтические дозы мезотона, эфедрина или норадреналина. При любых методах лечения больной должен достаточно длительный срок находиться на постельном режиме. Это объясняется, в частности, тем, что токсин ботулизма тяжело поражает нервные ганглии и мышцу сердца; поэтому преждевременное вставание с постели и физическое переутомление выздоравливающих после ботулизма могут иметь для них тяжелые последствия с развитием острой сердечно-сосудистой недостаточности. Вышесказанным определяется необходимость щадящего режима для реконвалесцентов после перенесенного заболевания ботулизмом. Выписка реконвалесцента из стационара производится через 7 — 10 дней после исчезновения всех клинических симптомов болезни.
Основными критериями выздоровления служит исчезновение патологических симптомов со стороны нервной и сердечно-сосудистой системы — ликвидация дисфагического, дизартрического и офтальгического синдромов, а также расстройств внешнего дыхания.
Своевременно оказанная терапевтическая помощь больному ботулизмом позволяет рассчитывать на благоприятный исход, особенно в тех случаях, когда она была основана на комплексе мероприятий. Вместе с тем необходимо учитывать, что, несмотря на серьезный прогноз при ботулизме, энергичное лечение даже в сравнительно поздние сроки от развития клинической картины болезни и при тяжелом ее течении позволяет добиться благоприятных результатов.
ЛАБОРАТОРНАЯ ДИАГНОСТИКА БОТУЛИЗМА
Лабораторная диагностика преследует цель обнаружить ботулинический токсин или возбудителя ботулизма в материалах, взятых от больного (кровь, рвотные массы, промывные воды желудка, кал и др.) или в органах из трупа (печень, желудок и кишечник с содержимым), а также в пищевых продуктах, которые вызвали отравление. При этом важно установить не только присутствие токсина или микроба, но и определить их тип, чтобы подтвердить клинический диагноз, назначить правильное лечение.
Быстрая и точная лабораторная диагностика ботулизма важна для начала раннего специфического лечения, для профилактики ботулизма у лиц, употреблявших продукты, которые вызвали отравление, а также для изучения эпидемиологии ботулизма. Чем быстрее при лабораторных исследованиях крови, выделений больных и пищевых продуктов, послуживших причиной отравления, будет обнаружен ботулинический токсин и определен его тип, тем раньше больному будет введена типоспецифическая противоботулиническая сыворотка.
Материал для исследования, отбор проб
Во всех случаях заболевания с симптомами, характерными для ботулизма, исследуют промывные воды желудка, рвотные массы, кал и кровь.
Кровь от больного необходимо брать до введения ему лечебной сыворотки в количестве 6 — 8 мл из вены в стерильную пробирку. Для лучшего формирования сгустка кровь нужно обвести по стенкам пробирки капилляром пастеровской пипетки, после чего выдержать в термостате 20 минут. Кровь можно брать также с 4% раствором лимоннокислого натрия в соотношении 3:1.
Промывные воды желудка берутся в объеме 50 — 100 мл, а кал — в количестве 50 — 60 г в стеклянные банки, закрывающиеся резиновыми или корковыми пробками; консервирующие вещества добавлять нельзя. На банки с пробками наклеиваются этикетки: какой материал посылается, от кого взят и дата взятия материала. Банки при транспортировке должны быть тщательно упакованы. В сопроводительном документе необходимо указать фамилию, имя, отчество и возраст пострадавшего, дату заболевания, предполагаемый диагноз, кратко клинические симптомы, дату взятия пробы и подпись лица, направляющего материал.
Материал, подлежащий исследованию, должен храниться на холоде, так как ботулинический токсин частично разрушается при комнатной температуре.
Из трупов на исследование необходимо брать кусочек печени весом 50 — 60 г, обрезки тонкого кишечника и желудка с содержимым, кровь (8 — 10 мл). Пробы из органов берут в стерильных условиях: поверхность органа прижигается раскаленным шпателем и затем стерильными ножницами из глубины вырезается кусочек органа. Пробы из каждого органа берутся в отдельные банки, закрытые пробками или крышками.
Сырье и готовую продукцию на предприятиях консервной промышленности проверяют на наличие возбудителей ботулизма согласно действующей «Инструкции о порядке санитарно-технического контроля производства консервов», утвержденной Министерством здравоохранения СССР от 28 ноября 1963 г. № 456-63.
Лабораторно проверяются на содержание возбудителя и токсина ботулизма также продукты, остатки продукта после употребления при всех случаях пищевых отравлений с симптомами, напоминающими ботулизм, даже при легких формах клинического течения, а также при всех случаях тяжелых пищевых отравлений наряду с исследованиями на сальмонеллы, стафилококки и группу Cl. perfringens.
Следует иметь в виду, что пищевые продукты, вызвавшие отравление и зараженные возбудителем ботулизма, часто бывают не изменены по виду, запаху и вкусу. Иногда отмечается специфический запах прогорклого масла. Банки с консервами могут быть вздуты («бомбаж»).
Материал для исследования берется с соблюдением условий стерильности в стеклянную посуду и закрывается плотно пригнанными стеклянными, резиновыми, корковыми или завинчивающимися пробками. Твердые объекты могут пересылаться завернутыми в несколько слоев вощаной или пергаментной бумаги.
При отсутствии стерильной посуды образцы отбирают в любые банки после предварительного 15-минутного кипячения их. Материал для исследования берут в количестве не менее 100 г. По возможности следует брать несколько проб из различных мест.
При невозможности отбора образцов в рекомендованных количествах выемка проб может производиться и в меньших количествах. К взятым пробам нельзя добавлять консервирующие вещества.
На пробы наклеивают этикетки, пробы нумеруют, опечатывают и тщательно упаковывают. Пересылка проб должна производиться в кратчайший срок и материал до исследования должен сохраняться на холоде.
Бактериологическое исследование
Пробы, поступившие в лабораторию, исследуются одновременно по двум направлениям: производится обнаружение ботулинических токсинов и выделение ботулинических микробов. Одновременно эти же пробы должны исследоваться на группу Cl. perfringens.
Обнаружение ботулинических токсинов
Промывные воды желудка при наличии в них комочков пищи растираются в стерильной ступке. Две трети этой растертой пробы предназначаются для обнаружения ботулинических токсинов, одна треть — для выделения ботулинических микробов.
Первую часть растертой пробы выдерживают при комнатной температуре 1 — 1 1/2 часа для экстрагирования. Затем экстрат фильтруют через ватно-марлевый фильтр или центрифугируют при 3000 оборотах в минуту (об./мин.) в течение 15 — 20 минут. Полученный фильтрат или центрифугат используется для постановки реакции нейтрализации.
Цитратная кровь или сыворотка крови больного без предварительного разведения исследуется на наличие ботулинических токсинов с помощью реакции нейтрализации, причем цитратную кровь можно вводить мышам только внутрибрюшинно.
Для обнаружения токсинов в испражнениях больного кал берется в количестве 10 — 15 г, растирается в стерильной ступке с двойным объемом физиологического раствора и выдерживается при комнатной температуре в течение 1 — 1 1/2 часов для экстрагирования токсинов. Затем жидкость фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется и используется для постановки реакции нейтрализации. Экстраты из органов трупа приготовляются аналогично.
Реакция нейтрализации
Для обнаружения токсина следует взять 4 мышей весом 16 — 18 г. В связи с тем, что в исследуемом материале может быть один из известных типов ботулинических токсинов, то предварительную реакцию необходимо ставить со смесью противоботулинических диагностических сывороток типов A, B, C, E, F.
Двум мышам вводится исследуемый фильтрат или центрифугат в количестве 0,5 — 0,8 мл внутрибрюшинно или внутривенно в хвостовую вену (внутривенно вводится только центрифугат). Другой паре вводится смесь, состоящая из 0,5 — 0,8 мл испытуемого материала и 0,2 мл смеси диагностических моновалентных противоботулинических сывороток типов A, B, C, E, F (по 0,04 мл сыворотки каждого типа). С этой целью выпускаются сухие типоспецифические диагностические сыворотки, титр которых должен быть в пределах:
| для | типа | A | - | 200 — 400 МЕ |
|---|---|---|---|---|
| «» | «» | B | - | 100 — 200 МЕ |
| «» | «» | C | - | 200 — 300 МЕ |
| «» | «» | E | - | 200 — 400 МЕ |
| «» | «» | F <1> | - | 50 — 100 МЕ |
<1> Диагностическая сыворотка типа F в ближайшее время будет выпущена наравне с сыворотками типов A, B, C, E.
Доза сыворотки, которая рекомендуется для реакции нейтрализации, как правило, обеспечивает нейтрализацию гомологического токсина в исследуемой пробе, ибо в организме и выделениях больных, а также экстрактах из пищевых продуктов очень сильные токсины почти не встречаются.
Нельзя пользоваться для целей диагностики лечебными противоботулиническими сыворотками.
Перед введением смесь испытуемого материала и сывороток выдерживается при комнатной температуре в течение 30 минут. Количество исследуемого материала, вводимого животным с сывороткой и без сыворотки, должно быть одинаковым. Наблюдение за животными ведется в течение 4 дней, однако, если мыши болеют или погибают раньше этого срока, то тут же ставится реакция нейтрализации с моновалентными сыворотками.
Следует помнить, что ботулинический токсин не дает молниеносной гибели (в течение нескольких минут или секунд).
При наличии ботулинического токсина погибают две мыши, которым вводился не смешанный с сыворотками фильтрат, остальные остаются живы.
Обычно картина болезни и гибели мышей очень характерна: появляется учащенное дыхание, состояние полного расслабления мышц, западание мышц брюшной стенки («осиная талия»), параличи и судороги перед смертью.
В случае гибели всех 4 мышей, т.е. тех, которым был введен фильтрат без сыворотки и с сывороткой, следует повторить реакцию нейтрализации с экстрактами, разведенными в 5, 10, 20 и даже 100 раз. При разведении экстрактов посторонняя микрофлора теряет способность убивать мышей, а ботулинические токсины, обладая обычно большей биологической активностью, будут вызывать гибель мышей даже при разведении фильтров (экстрактов).
Вместо мышей для реакции нейтрализации могут быть использованы морские свинки весом 250 — 300 г. Одной из них вводят подкожно или внутрибрюшинно 0,5 мл смеси сывороток A, B, C, E, F и 3 мл испытуемого фильтрата (или центрифугата), контрольной свинке вводят 3 мл испытуемого материала.
В случае обнаружения в пробе ботулинического токсина сразу же ставится развернутая реакция нейтрализации для определении типа токсина с типоспецифическими диагностическими сыворотками. В 6 пробирок разливают по 2,4 мл исследуемого фильтрата, затем в каждую пробирку добавляют по 0,6 мл сыворотки: в первую пробирку сыворотку типа A, во вторую — типа B, в третью — типа C, в четвертую — типа E, в пятую — типа F и в шестую приливают 0,6 мл физиологического раствора. Смесь после 30 минут выдерживания при комнатной температуре вводят внутривенно или внутрибрюшинно по 1 мл двум мышам из каждой пробирки (см. типовой протокол).
Для каждой сыворотки берется отдельный шприц. Учет результатов проводится через 4 — 6 часов, 24 часа и далее на протяжении 4 дней. При наличии ботулинического токсина выживают мыши, получившие смесь токсина и гомологической сыворотки, при гибели всех остальных мышей. Тип сыворотки, нейтрализующей токсин, указывает на типовую принадлежность токсина.
ТИПОВОЙ ПРОТОКОЛ ПОСТАНОВКИ РАЗВЕРНУТОЙ РЕАКЦИИ НЕЙТРАЛИЗАЦИИ
Например, если гибнут все мыши, кроме тех, которым введено содержимое пробирки № 1, то в исследуемом материале будет установлен токсин типа А.
Особое внимание нужно обратить на постановку реакции нейтрализации с сывороткой больного, так как обычно ее бывает мало. Следует тщательно отделить сыворотку от сгустка крови (сгусток крови необходимо посеять, так как при ботулизме можно обнаружить в крови палочку ботулизма) и с сывороткой поставить реакцию нейтрализации. В этом случае можно сразу поставить развернутую реакцию нейтрализации с моновалентными ботулиническими сыворотками типов A, B, E (остальные типы ботулизма встречаются очень редко). Для этого в три пробирки поровну разливают всю сыворотку больного, а затем в первую пробирку добавляют диагностическую сыворотку типа A — 0,4 мл, во вторую — типа B, в третью — типа E. Все содержимое каждой пробирки вводят поровну двум мышам. Например, если в каждую пробирку налили по 1,8 мл сыворотки больного, а затем по 0,4 мл диагностической сыворотки, всего в пробирке будет 2,2 мл смеси. Эту смесь (вводят внутривенно или внутрибрюшинно мышам по 1 мл (0,2 мл останется на стенках пробирки). Выжившие мыши укажут на тип токсина в крови больного; контролем будут павшие мыши, которым была введена сыворотка больного в смеси с диагностической ботулинической сывороткой других типов.
При получении положительной реакции нейтрализации с диагностическими ботулиническими сыворотками дается заключение о наличии в исследуемом материале ботулинического токсина и указывается его тип.
В настоящее время установлено, что противоботулиническая сыворотка типа E в известной мере нейтрализует и ботулинический токсин типа F. При получении положительной реакции с противоботулинической сывороткой типа E следует дополнительно провести дифференциальную диагностику: необходимо определить, относится ли обнаруженный токсин к типу E или к типу F. Для этого следует поставить реакцию нейтрализации на мышах параллельно с двумя противоботулиническими диагностическими сыворотками типа E и типа F. Для этого в три пробирки наливают по 2,4 мл испытуемого экстракта, а затем в первую пробирку наливают 0,6 мл диагностической сыворотки типа E, во вторую — 0,6 мл типа F, в третью, контрольную — 0,6 мл физиологического раствора. Если мыши погибают только в контроле и с сывороткой типа E, то в экстракте имеется токсин типа F, если же погибают наряду с контролем и мыши, которым введена смесь с сывороткой типа F, а выживают только мыши с сывороткой E, то в экстракте токсин типа E.
Обнаружение возбудителей ботулизма
Для обнаружения возбудителей ботулизма производится посев на жидкие питательные среды. Для первичных посевов лучше использовать казеиново-грибную среду, бульон Хоттингера или пепсин-пептонный бульон с 0,5% глюкозы (см. среды для анаэробов) <1>. Необходимо, чтобы pH был в пределах 7,2 — 7,4. Обязательным является также наличие в мясных средах мясного или печеночного фарша, а в казеиново-грибной среде — отварного пшена и ваты.
<1> Руководство по микробиологической диагностике инфекционных болезней под ред. К.И. Матвеева и М.И. Соколова, Медицина, 1964.
Для выделения возбудителей ботулизма наиболее подходящей средой является мясная среда типа Тароцци. На казеиново-грибной среде все типы возбудителей ботулизма также дают хороший рост и продуцируют токсины значительной силы.
Посевы должны производиться в среды в больших пробирках или во флаконах емкостью по 100 — 200 мл, залитые слоем вазелинового масла толщиной 0,5 см. Следует особенно помнить о том, что засевать исходный посевной материал следует в большой объем среды (70,0 — 150 мл), чтобы культуральной жидкости первичного посева хватало на все исследования (постановка реакции с поливалентной сывороткой и развернутой реакции нейтрализации, нередко с двух- или трехкратным повторением). Последующие пересевы исследуемых проб из первичного посева в те же жидкие питательные среды могут не дать токсинообразования в среде, по-видимому, из-за бурного роста посторонней микрофлоры. Посев следует производить в четыре флакона, один из которых прогревают после посева при 60° 15 минут (в этих условиях прогревания обычно погибают аэробы и вегетативные формы анаэробов, но сохраняются споры Cl. botulinum типа E, которые погибают при 80°), другой прогревают при 80° 20 минут. Два флакона после посева не прогревают. После этого все флаконы помещают в термостат: один непрогретый флакон и флакон, прогретый при 60°, инкубируют при 28°, другой непрогретый флакон и флакон, прогретый при 80°, инкубируют при 35 — 37°. Последние два флакона исследуют на Cl. botulinum типов A, B, C.
Если в исследуемом материале возбудители ботулизма находятся преимущественно в вегетативной форме, то рост в посевах будет, главным образом, в непрогретых флаконах. В том же случае, если в материале имеются споровые формы, рост будет в прогретых флаконах и в отдельных случаях может сразу привести к выделению чистой культуры из такого посева. После посева все исходные образцы проб следует сохранять на леднике до окончания исследования. Через 48 часов после появления роста посевы исследуются на наличие возбудителей ботулизма.
В настоящее время есть сообщение зарубежных ученых о там, что для выявления Cl. botulinum типа E в среду следует добавлять трипсин до конечной концентрации 0,1%. В опытах этих исследователей процент выявления возбудителя ботулизма типа Е из почвы увеличился на среде с трипсином до 74% исследуемых проб, в то время как исследование этих проб на среде без трипсина дало положительный результат лишь в 17% проб.
Так как для таких исследований требуется трипсин в довольно больших количествах, его можно заменить эквивалентным количеством панкреатина. Кроме того, такие среды можно брать в пробирках с объемом среды 15 — 20 мл. Трипсин следует готовить в виде 1% раствора, стерилизовать путем фильтрации через стерилизующие пластины фильтра Зейтца и добавлять во флаконы, которые будут инкубироваться при 28°, из расчета 1 мл 1% раствора трипсина на 10 мл среды после прогрева при 60° 15 минут.
Рост возбудителя ботулизма характеризуется нередко сильным газообразованием и иногда протеолизом кусочков печени или фарша. Стерильно взятые из таких флаконов пробы (10 — 15 мл) подвергаются исследованию. Прежде всего готовят мазки, красят их по Граму или краской для анаэробов и микроскопируют.
С культуральной жидкостью ставится реакция нейтрализации с поливалентной противоботулинической сывороткой типов A, B, C, E и F. При получении положительных результатов реакцию нейтрализации ставят с каждой сывороткой раздельно. Если через двое суток во флаконах не обнаружен рост, то необходимо продолжать инкубацию в термостате, а исследование повторить на 4 — 6 - 10-е сутки. При обнаружении в исследуемом посеве палочек, типичных по морфологии для Cl. botulinum, а также ботулинического токсина дается заключение о зараженности исследуемого материала возбудителем ботулизма. Выделение чистой культуры в таком случае не является обязательным.
Если же в посевах обнаруживаются микробы, по морфологии сходные с Cl. botulinum, а токсин отсутствует, следует провести активацию культуральной жидкости панкреатином или трипсином по описанной ниже методике для обнаружения ботулинического токсина, а также провести выделение и изучение чистой культуры. Активацию культуральной жидкости перед постановкой реакции нейтрализации с противоботулинической сывороткой проводят только в том случае, если в среду перед высевом не был добавлен трипсин или панкреатин, как это рекомендовано выше.
ИССЛЕДОВАНИЕ ПИЩЕВОГО ПРОДУКТА
Исследуемый продукт в количестве 25 — 30 г тщательно растирается в стерильной ступке с физиологическим раствором или с дистиллированной водой в том случае, если продукт соленый (материал легче растирается в присутствии стерильного кварцевого песка). В зависимости от характера (плотности) продукта берется равное или двойное количество физиологического раствора или дистиллированной воды по отношению к весу пробы.
Из растертой пробы 2/3 объема используется для обнаружения ботулинических токсинов и 1/3 — для выделения возбудителей ботулизма.
Та часть пробы, которая исследуется на наличие токсинов, выдерживается в течение 1 — 1 1/2 часов при комнатной температуре для экстрагирования токсинов, фильтруется через ватно-марлевый фильтр или центрифугируется при 2500 — 3000 об./мин. в течение 15 — 20 минут. Фильтрование через тальковый фильтр недопустимо, так как тальк адсорбирует на себе ботулинические токсины.
Для обнаружения ботулинических токсинов с полученными фильтратами или центрифугатами ставится реакция нейтрализации токсина антитоксической сывороткой по вышеописанной методике с предварительной активизацией фильтров.
Обнаружение ботулинических микробов в пищевых продуктах проводится по методике, изложенной в разделе по исследованию материалов от больных. Во флаконы с питательной средой засевают 5 — 10 мл растертого с физиологическим раствором или дистиллированной водой испытуемого материала.
Выделение чистой культуры
Посев на высокий столбик агара. Для посева применяется прозрачный одно- или полуторапроцентный агар с глюкозой, приготовленный на мартеновском бульоне, бульоне Хоттингера или пепсин-пептоне, разлитый в пробирки диаметром 0,8 см и длиной 15 — 18 см. Перед посевом агар расплавляют и охлаждают до 45 — 50°. Посев на высокий столбик производят следующим образом: не отламывая конца пастеровской пипетки, погружают ее в исследуемый материал и переносят последовательно из пробирки в пробирку, после чего агар тщательно перемешивается путем перекатывания пробирок между ладонями. Охлажденные пробирки с посевом помещаются в термостат при температуре 35 — 37°. На каждый посев следует брать 5 — 8 пробирок столбика агара. Если в первичной культуре рост не очень обильный, при пересеве на высокий столбик пастеровскую пипетку следует обломать и набрать немного культуры в капилляр, а затем проводить посев, как указано выше.
Если в первичном посеве имеется массивный рост посторонней микрофлоры и мало типичных ботулинических палочек со спорами, необходимо взять 5 — 10 мл культуры в пробирку и подвергнуть ее прогреванию на водяной бане при 80° 20 минут. После этого культуру надо снова посеять на высокий столбик агара.
Через 1 — 2 суток в последних пробирках проявляются отдельные колонии в виде комочков ваты, пушинок с уплотненным центром или же правильных дисков, чечевичек. Подозрительные колонии перевиваются на жидкую или полужидкую питательную среду в пробирках с 0,5% глюкозы под слоем вазелинового масла. Одновременно оставшаяся часть колонии микроскопируется.
Пересев колоний из пробирок можно производить двумя способами:
1. Столбик агара прокалывается сверху отломанным капилляром пастеровской пипетки и извлекается нужная колония.
2. Дно пробирки с высоким столбиком агара слегка подогревается на пламени горелки; под действием паров закипевшей жидкости агар выталкивается в стерильную чашку Петри. Подозрительная колония извлекается отломанным капилляром пастеровской пипетки.
Культуру, выросшую из колонии в жидкой среде, микроскопируют и проверяют на наличие токсина с помощью реакции нейтрализации на мышах.
Посев на чашки. Каплю исследуемой жидкости наносят на поверхность сахарно-кровяного печеночного агара, разлитого тонким слоем в чашки Петри. Затем каплю шпателем слегка втирают в агар и последовательно переносят шпатель еще на 2 — 3 чашки. Чашки помещаются в микроанаэростат (различных марок) крышкой кверху и выращивают при температуре 35 — 37°.
Ввиду того, что при большом загрязнении исследуемых проб посторонней микрофлорой возникают трудности в выделении Cl. botulinum типа E из-за того, что чувствительность спор этого микроба к нагреванию не отличается от чувствительности вегетативных форм некоторых микробов, рекомендуется простой метод выделения чистой культуры микроба, основанный на слабой чувствительности спор палочки ботулизма типа E к 50% спирту.
К 2 мл культуральной жидкости 2 — 3-дневной инкубации при 28°, содержащей ботулинический токсин типа E, добавляют равный объем этилового спирта-ректификата. Смесь выдерживают 1 час при комнатной температуре, периодически перемешивая, а затем из нее делают высев на 2 — 3 чашки с печеночным агаром, содержащим желток куриного яйца (желток одного яйца добавляют в 500 мл расплавленного и охлажденного до 50° агара). Через 48 часов инкубации при 35° в анаэростате среди колоний посторонней микрофлоры Cl. botulinum дают небольших размеров колонии, окруженные «жемчужным поясом». Правда, некоторые спорогенные анаэробы (Cl. sporogenes и др.) дают вокруг колоний также «жемчужный пояс». Эти колонии высевают на пробирки со средой типа Тароцци, исследуют после инкубации в термостате в реакции нейтрализации. Особенно этот метод рекомендуется для выделения чистой культуры Cl. botulinum типа E. С целью поддержания достаточного вакуума на дно анаэростата ставится открытая чашка Петри со щелочным раствором пирогаллола. Через сутки колонии ботулинического микроба выглядят в виде прозрачных росинок дымчатого цвета, диаметром 0,1 — 0,2 см, окруженных зоной гемолиза.
При отсутствии в лаборатории анаэростатов для выращивания анаэробов можно использовать простой чашечный метод, где воздух просто исключается из питательного агара. Метод заключается в следующем: засеянный и слегка охлажденный агар наливается в крышку стерильной чашки Петри, после чего на агар, почти застывший, помещается вторая половина чашки Петри так, чтобы дно ее плотно соприкасалось с поверхностью залитого агара. Края чашки можно залить парафином. При этом методе поверхность стекла плотно соприкасается с агаром по всей его площади, и в слое агара, находящемся между пластинками стекла, создаются условия, благоприятные для роста самых строгих анаэробов.
Выросшие колонии нужно рассматривать в лупу или в стереоскопический микроскоп МБС-1. Часть колоний используют для приготовления мазков, которые микроскопируют.
С поверхности чашки колонии снимаются петлей или пастеровской пипеткой и засеваются на пробирки с бульоном с 0,5% глюкозы. Выросшие посевы проверяются на чистоту путем микроскопирования и на наличие токсина путем титрования и постановки реакции нейтрализации на мышах.
В дальнейшем изучаются протеолитические и биохимические свойства путем посева на желатину и углеводы.
Метод активации протоксина Cl. botulinum
Культуры Cl. botulinum типа E и некоторые штаммы типов B и F вырабатывают протоксин, который сам по себе является нетоксичным для животных при внутривенном и подкожном введении.
Поэтому для обнаружения протоксина применяют метод активации с помощью протеолитических ферментов — трипсина или панкреатина, если исследуемый материал был засеян в среду без трипсина или панкреатина.
Способ приготовления протеолитических ферментов. Чистый сухой трипсин растворяется перед употреблением в физиологическом растворе в концентрации 1:100 (1% раствор); этот раствор принимается за исходный. Для активации берется данный раствор из расчета, чтобы в активируемой культуральной жидкости его концентрация была равна 0,1%.
Трипсин может быть заменен сухим медицинским высокоактивным (активность не должна быть менее 50 единиц) панкреатином, раствор которого готовится следующим образом: 4 г панкреатина растворяется в 100 мл физиологического раствора и оставляется в холодильнике при 4° в течение ночи.
Перед употреблением полученная жидкость фильтруется через плотный бумажный фильтр, а затем через стерилизующую пластину фильтра Зейтца до получения прозрачной опалесцирующей жидкости.
Готовый раствор в объеме 0,5 мл не должен убивать белую мышь весом 17 — 18 г при внутривенном введении. При внутрикожном введении морским свинкам 0,2 мл раствора обычно появляется некроз участка кожи (0,5 x 0,5 см).
Активность приготовленного раствора панкреатина следует предварительно проверить по отношению к известному музейному штамму Cl. botulinum типа E. Готовый раствор пакреатина может сохраняться при 4° в течение 2 недель.
Активация прототоксина Cl. botulinum
Исследуемая 4 — 5-суточная культура Cl. botulinum полученная на жидкой мясной или казеиновой среде, подвергается центрифугированию или фильтрованию с целью отделения микробных тел от культуральной жидкости.
Готовый раствор трипсина добавляется из расчета получения в культуральной жидкости концентрации 0,1% (на 1 мл культуральной жидкости берут 0,1 мл исходного 1% раствора трипсина).
Если вместо трипсина применяют панкреатин, то культуральная жидкость смешивается в равных пропорциях с готовым раствором панкреатина.
Полученные смеси помещают в термостат при 37° на один час. По истечении указанного срока активированную жидкость титруют на белых мышах путем внутривенного введения с постановкой реакции нейтрализации.
Аналогичным образом проводится активизация фильтров (центрифугатов) из пищевых продуктов и органов трупов.