Временные методические указания по определению остаточных количеств титуса в зеленой массе и зерне кукурузы высокоэффективной жидкостной хроматографией

(утв. Минздравом СССР 29.07.1991 № 6193-91)

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ ТИТУСА В ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ И ЗЕРНЕ КУКУРУЗЫ ВЫСОКОЭФФЕКТИВНОЙ ЖИДКОСТНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткое описание препарата

Химическое название: 1-(4,6-диметоксипиримидин-2-ил)-3-[(3-этилсульфонилпиридин-2-ил)сульфонил]мочевина.

                            OCH

      ___N                 N___/   3
    //   \\───SO NH-C-NH──//   \\
    \ ___ /     2   \\    \ ___ /
      ─── \          O    N ─── \
           SO C H                OCH
             2 2 5                  3

Общепринятые названия: титус, ДРХ-Е9636.

Эмпирическая формула: C H № O S . 14 17 5 7 2

Молекулярная масса: 431,4.

Химически чистый титус представляет собой белое кристаллическое вещество с температурой плавления 176 — 178 °C. В виде сухой пленки на стекле и в растворе в ацетонитриле относительно устойчив; в кислой (pH < 3) и щелочной среде (pH > 9) быстро гидролизуется. Период полураспада в водной среде при pH 5 — 4,6 дня; pH 7 — 7,2 дня; pH 9 — 0,3 дня, в почве — от 1,7 до 4,3 дня.

Хорошо растворим в ацетонитриле, метиленхлориде и хлороформе. Растворимость в дистиллированной воде: при 25 °C < 10 мг/л, в буферном растворе при pH 7 — 7,3 г/л.

Титус малотоксичен для человека и теплокровных животных (СД 50

для   крыс  >  5000  мг/кг), не  обладает  побочными  токсическими
эффектами,  может  вызвать  слабое  раздражение слизистой оболочки

глаз.

Титус — новый повсходовый гербицид, эффективный в борьбе со злаковыми однолетними и многолетними сорняками в посевах кукурузы и посадках картофеля. Зарегистрирован в России как средство борьбы со злаковыми сорняками, особенно гумаем ползучим, в посевах кукурузы в виде 75-процентной сухой текучей суспензии с нормой расхода 40 — 50 г/га.

2. Методика определения титуса в зеленой массе и зерне кукурузы методом высокоэффективной жидкостной хроматографии

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Методика основана на определении остатков титуса с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии с использованием фотокондуктивного детектора и колонки с силикагелем. Определение проводят после экстракции гербицида буферной смесью и реэкстракции метиленхлоридом.

Количественное определение проводится методом абсолютной калибровки.

2.1.2 Избирательность метода

В предлагаемых условиях метод специфичен в присутствии пестицидов, применяемых при выращивании кукурузы: 2,4-Д, симазин, атразин, эрадикан.

2.1.3 Метрологическая характеристика метода

Таблица 1

Анализируемый объект	n	Метрологические параметры, P = 0,95
		предел обнаружения, мг/кг	диапазон определяемых концентраций, мг/кг	среднее значение определения, %	стандартное отклонение S, %	доверительный интервал среднего результата, %
Зеленая масса растений Зерно кукурузы	15 15	0,05 0,05	0,05 — 1,0 0,05 — 1,0	89,0 86,5	7,48 6,40	+/- 4,1 +/- 3,5

2.2. Реактивы и материалы

Титус с содержанием действующего вещества 99,5% фирмы Дюпон.

Ацетонитрил, ТУ 6-09-3534-82.

Вода бидистиллят, ГОСТ 7602-72.

Калий фосфорнокислый двузамещенный.

Кислота уксусная ледяная, ГОСТ 61-75.

Кислота ортофосфорная, ГОСТ 6552-80.

Метилен хлористый для хроматографии, ГОСТ 12794-80.

Натрий сернокислый безводный, хч, ГОСТ 4166-76.

Спирт изопропиловый, ГОСТ 9805-84.

Спирт метиловый для хроматографии, ТУ 6-09-1709-77.

Циклогексан для хроматографии, ТУ 6-09-1832-77.

Приготовление растворов:

    а)   1  -  молярный  раствор  K HPO :  174  г  фосфорнокислого
                                   2   4
двузамещенного  калия  помещают  в  мерную  колбу объемом 1000 мл,
добавляют  дистиллированной  воды  до  полного  растворения соли и

доводят объем водой до метки;

    б)  фосфатный  буфер  (pH  7,0): смешивают 150 мл 1 М K HPO  с
                                                           2   4
1350  мл  дистиллированной воды. Доводят pH смеси до 7,0, добавляя

по каплям концентрированную ортофосфорную кислоту и контролируя pH среды с помощью универсального иономера;

в) экстрагирующая смесь: готовят смесь метанола с фосфатным буфером в соотношении 75:25 по объему;

г) подвижная фаза для ВЭЖХ: циклогексан — 750 мл, изопропанол — 125 мл, метанол — 125 мл, смесь уксусной кислоты с водой (9:1) — 1 мл;

д) состав для кондиционирования колонки: изопропанол — 400 мл, уксусная кислота ледяная — 100 мл, вода бидистиллят — 10 мл.

Приборы, аппаратура, посуда

Жидкостный хроматограф «Уотерс», модель 510, с фотокондуктивным детектором «Тракор», модель 965, или другой аналогичного типа.

Колонка стальная длиной 30 см с сорбентом на основе силикагеля с удельной поверхностью 300 кв. м/г и размером частиц 10 мкм марки мю-Порасил фирмы Уотерс или Силасорб-300 фирмы Хемапол.

Мельница лабораторная.

Гомогенизатор лабораторный со стаканом емкостью 100 — 150 мл.

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М, ТУ 25-11-917-74, или аналогичного типа.

Водоструйный насос, ГОСТ 25336-82.

Иономер универсальный ЭВ-74.

Воронки конические, стеклянные, ГОСТ 25336-82.

Воронки делительные на 500 мл, ГОСТ 25336-82.

Концентраторы грушевидные КТУ-100-14/19 НШ-19, ГОСТ 25336-82.

Воронки Бюхнера фарфоровые диаметром 70 мм, ГОСТ 9147-80.

Колбы Бунзена объемом 800 мл, ГОСТ 25336-82.

Пипетки мерные на 2,0; 1,0; 5,0; 10,0; 25 мл, ГОСТ 20292-74.

Колбы мерные на 25, 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Вата стеклянная для хроматографии.

Фильтры диаметром 20 мм с отверстиями 20 мкм фирмы Милипор.

2.3. Отбор проб

Отбор проб проводится в соответствии с «Унифицированными правилами отбора проб сельскохозяйственной продукции, пищевых продуктов и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов» (N 2051-79 от 21.08.79). Отобранные пробы зерна подсушивают до стандартной влажности и хранят в сухом, хорошо вентилируемом помещении. Перед анализом пробы размалывают на лабораторной мельнице до размеров частиц менее 1 мм.

Пробы зеленой массы замораживают и хранят в холодильнике при температуре ниже -15 °C.

2.4. Подготовка к определению

2.4.1 Кондиционирование хроматографической колонки

Перед началом работы хроматографа раствор для кондиционирования колонки и подвижную фазу дегазируют в течение 2-х часов, пропуская через растворы гелий. Операцию повторяют ежедневно в течение 1 часа перед началом анализа, не выключал прибора. При добавлении новой порции растворителей дегазирование проводят в течение 2-х часов.

Готовую колонку устанавливают в термостат хроматографа и стабилизируют при 35 °C, пропуская через нее в течение 4-х часов раствор для кондиционирования колонки со скоростью 0,5 мл и затем еще 4 часа подвижную фазу для ВЭЖХ с той же скоростью. Эту операцию проводят ежедневно перед началом ввода проб в ночное время с использованием таймеров (реле времени). Нарушение данного режима приводит к резкой потере чувствительности.

2.4.2 Приготовление стандартных растворов

Стандартный раствор № 1 с концентрацией титуса 1 мг/мл готовят следующим образом: взвешивают 50 мг титуса с точностью +/- 0,0002 г, переносят навеску в мерную колбу на 50 мл ацетонитрилом и доводят объем раствора до метки этим же растворителем. Методом последовательного разбавления в ацетонитриле готовят стандартный раствор № 2 с концентрацией 100 мкг/мл. Растворы № 1 и 2 можно хранить в холодильнике не более 1 месяца.

Для калибровки хроматографа ежедневно готовят рабочие стандартные растворы с концентрацией титуса 0,1; 0,2; 0,4; 0,6 мкг/мл, внося пипеткой соответствующее количество раствора № 2 в мерные колбы, упаривая ацетонитрил досуха током азота и доводя объем раствора до метки подвижной фазой без уксусной кислоты.

Хроматографируют по 20 мкл каждого рабочего раствора, измеряют высоту пика (или площадь) и строят график зависимости высоты (площади) пика от концентрации титуса.

2.5. Описание определения

2.5.1 Экстракция и очистка экстракта

Навеску измельченного зерна или зеленой массы — 10 г помещают в пластиковую банку с крышкой, приливают 100 мл экстрагирующей смеси и гомогенизируют в течение 1 мин. при скорости 1500 об./мин. Банки с гомогенатом устанавливают на встряхиватель, закрывают плотно крышками и встряхивают 10 мин. По истечении срока банки переносят в центрифугу с охлаждением и центрифугируют 10 мин. при скорости 3500 — 4500 об./мин. Экстракт осторожно переносят в воронку Бюхнера с бумажным фильтром и фильтруют под вакуумом в колбу Бунзена. Экстракцию повторяют, добавляя в банку 50 мл ацетонитрила, встряхивая 10 мин., центрифугируя и отфильтровывая. Объединенный экстракт переносят из колбы Бунзена в чистую пластиковую банку объемом 250 мл, обмывая колбу экстрагирующей смесью. К экстракту приливают 50 мл метиленхлорида, банку плотно закрывают крышкой и интенсивно встряхивают смесь в течение 10 мин. Затем экстракт центрифугируют 10 мин. при 3500 — 4500 об./мин. Содержимое банки осторожно (по стеклянной палочке) переносят в делительную воронку и нижний слой (метиленхлорид) сливают в концентратор через безводный сульфат натрия. Повторяют экстракцию еще 2 раза порциями метиленхлорида по 50 мл с последующим центрифугированием. Объединенные экстракты упаривают досуха на ротационном испарителе при t = 40 °C.

Сухой остаток растворяют в 5 мл подвижной фазы, не содержащей уксусной кислоты, и вводят в хроматограф 20 мкл раствора.

2.5.2 Условия хроматографирования

Жидкостный хроматограф «Уотерс», модель 510, с программатором температуры и фотокондуктивным детектором «Трактор», модель 365.

Показания аттенуатора — 1 x 50.

Скорость движения ленты самописца — 120 мм/час.

Колонка стальная длиной 30 см, внутренний диаметр 3 мм. Неподвижная фаза — мю-Порасил, Уотерс.

Температура колонки — 35 °C.

Скорость потока подвижной фазы — 0,3 мл/мин.

Объем пробы, вводимой в колонку, — 20 мкл.

Абсолютное время удерживания титуса — 27 мин. 29 сек.

Линейность детектирования сохраняется в пределах 2 — 20 нг.

Каждую анализируемую пробу вводят 2 раза и вычисляют среднюю высоту (площадь) пика. Образцы, дающие пики большие, чем стандартный раствор 1,0 мкг/мл, разбавляют.

2.5.3 Обработка результатов анализов

Содержание титуса рассчитывают методом соотношения со стандартом по формуле:

                         П   x A x V
                          пр

X = -----------, П x p с

где:

X — содержание гербицидов в пробе, мг/кг;

П — высота (площадь) пика стандарта, мм; с

П — высота (площадь) пика образца, мл; пр

A — концентрация стандартного раствора, мкг/мл;

V — объем экстракта, подготовленного для хроматографирования, мл;

p — масса анализируемого образца, г.

3. Требования техники безопасности

Необходимо соблюдать общепринятые правила безопасности при работе с органическими растворителями, токсичными веществами, электронагревательными приборами и сжатыми газами.

Среда	Добавлено титуса, мг/кг	Обнаружено, мг/кг	Полнота определения, %
Зеленая масса Зерно кукурузы	0,5 0,1 0,05 0,5 0,1 0,05	0,469 0,00833 0,045 0,418 0,0859 0,045	93,8 83,3 90,0 83,5 85,9 90,0

---