--- title: "\"Методические указания по определению метаболитов фосфамида в биологических средах методом тонкослойной хроматографии\"" number: "6133-91" issuer: "Министерство здравоохранения СССР" status: действует canonical: "https://bukva.ai/docs/ukazanie-ukazaniya-6133-91" --- ## "Методические указания по определению метаболитов фосфамида в биологических средах методом тонкослойной хроматографии" # "Методические указания по определению метаболитов фосфамида в биологических средах методом тонкослойной хроматографии" (утв. Минздравом СССР 29.07.1991 N 6133-91)
Утверждены
Министерством здравоохранения СССР
29 июля 1991 г. N 6133-91
**МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ** **ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ** **СРЕДАХ МЕТОДОМ ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИИ** > *(Дополнение к Методическим указаниям [N 4323-87](https://bukva.ai/docs/4323-87) от 08.06.87)* Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде. Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками. ## 1. Краткая характеристика Фосфамид (рогор, БИ-58) в организме теплокровных животных и человека образует продукты превращения: 0,0-диметил-S-карбонилметилдитиофосфат (диметоат-карбоновая кислота, температура плавления 42 °C); 0,0-диметил-S-карбметоксиметилдитиофосфат, температура кипения 20 98 - 99 °C при 6,7 Па, n = 1,5200; альфа 0,0-диметилдитиофосфорная кислота, температура кипения 52 - 55 20 °C при 10,66 Па, n = 1,5340; альфа 20 0,0-диметилтиофосфорная кислота, n = 1,4800; альфа 0,0-диметилфосфорная кислота, температура кипения 79 - 80 °C 20 при 0,13 Па, n = 1,4082. альфа Указанные метаболиты могут образовываться при метаболизме других пестицидов, сходных по химическому строению с фосфамидом. Метаболиты хорошо растворимы в органических растворителях, в том числе в ацетоне, этаноле, хлороформе, этилацетате и др. ## 2. Методика определения метаболитов фосфамида в биологических средах (ткани внутренних органов, кровь, моча) ### 2.1. Основные положения ##### 2.1.1 Принцип метода Метод основан на экстракции метаболитов фосфамида из биологических сред органическим растворителем (хлороформ или этилацетат), очистке полученных экстрактов и последующем определении методом тонкослойной хроматографии. Хроматографирование исследуемых соединений проводят в подвижных фазах на основе ацетона, включающих малополярные и полярные растворители. Проявление на хроматограммах с помощью проявляющих реагентов: 2,6-дибром-N-хлорхинонимина, а также 4-(п-нитробензил)пиридина с последующей обработкой тетраэтиленпентамином. ##### 2.1.2 Метрологическая характеристика метода приведена в таблице 1. Таблица 1
**МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА ОПРЕДЕЛЕНИЯ**
**МЕТАБОЛИТОВ ФОСФАМИДА В БИОЛОГИЧЕСКИХ СРЕДАХ** | Метаболиты фосфамида | Минимально детектируемое количество | Нижний предел обнаружения, мкг/мл | Аналитическая открываемость | Примечание | | --- | --- | --- | --- | --- | | Метаболит N 1 (0,0-диметил-Sкарбонилметилдитиофосфат) | 1 мкг | 0,5 0,04 1,0 | 80,5 +/- 8,5% 82,0 +/- 10,8% 80,5 +/- 10,0% | ткани внутренних органов моча кровь | | Метаболит N 2 (0,0-диметилфосфорная кислота) | 5 мкг | 5,0 0,2 2,5 | 78,5 +/- 12,5% 80,5 +/- 11,8% 78,9 +/- 10,3% | кровь моча ткани | | Метаболит N 3 (0,0-диметилтиофосфорная кислота) | 2 мкг | 1,0 2,0 0,08 | 81,5 +/- 12,5% 79,5 +/- 10,5% 82,8 +/- 8,5% | ткани кровь моча | | Метаболит N 4 (0,0-диметилдитиофосфорная кислота) | 1 мкг | 0,5 1,0 0,04 | 82,4 +/- 12,5% 80,5 +/- 10,5% 85,5 +/- 10,0% | ткани кровь моча | | Метаболит N 5 (0,0-диметилкарбметоксиметилдитиофосфат) | 1 мкг | 0,5 1,0 0,04 | 82,9 +/- 8,5% 79,6 +/- 9,5% 85,4 +/- 10,6% | ткани кровь моча | Примечание: в модельные опыты вносили по 10, 20, 50, 100 мкг исследуемых веществ. Количество опытов 60 (P = 0,05). ##### 2.1.3 Избирательность метода В условиях двумерной хроматографии после I хроматографирования из указанной выше смеси метаболитов + фосфамид раздельно определяются фосфамид, "диметоат-карбоновая кислота" и 0,0-диметилкарбметилдитиофосфат, а после II хроматографирования раздельно определяются 0,0-диметилфосфорная кислота и (или) 0,0-диметилтиофосфорная кислота (или 0,0-диметилдитиофосфорная кислота). Последние две кислоты, если не присутствуют одновременно в пробе, отличаются окраской зоны локализации при взаимодействии с 2,6-дибром-N-хлорхинонимином. Определению не мешают пестициды, которые могут присутствовать в пробе (с учетом технологии возделывания с/х культур), - диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан. ### 2.2. Реактивы и растворы 0,0-Диметил-S-карбонилметилдитиофосфат ("диметоат-карбоновая кислота", метаболит N 1). 0,0-Фосфорная кислота хч (метаболит N 2). 0,0-Диметилтиофосфорная кислота хч (метаболит N 3). 0,0-Диметилдитиофосфорная кислота хч (метаболит N 4). 0,0-Диметилкарбометоксиметилдитиофосфат (метаболит N 5). Фосфамид хч или товарная форма пестицида (40-процентный или 38-процентный концентрат эмульсии). Ацетон хч, ГОСТ 2603-79. Бензол хч, [ГОСТ 5955-75](https://bukva.ai/docs/gost-5955-75). н-Гексан ч, ТУ 6-09-3375-78. Хлороформ хч, ТУ 6-09-4263-76. Уксусная кислота хч, ГОСТ 61-75. Дистиллированная вода. Натрий сернокислый безводный чда, [ГОСТ 4166-76](https://bukva.ai/docs/gost-4166-76). 2,6-Дибром-N-хлорхинонимин, ТУ 6-09-05-63-73, хч, 0,5-процентный раствор в гексане. 4-(п-Нитробензил)пиридин, ТУ 6-09-15-93-74. Тетраэтиленпентамин, ТУ 6-09-05-804-78. Этилацетат хч, [ГОСТ 22300-76](https://bukva.ai/docs/gost-22300-76). Натрий лимоннокислый чда, [ГОСТ 22280-78](https://bukva.ai/docs/standart-gost-22280-76), 5% раствор. Подвижные фазы: I хроматографирование: N 1 - бензол - этилацетат - ацетон (60:15:25), N 2 - гексан - ацетон - хлороформ (1:1:3) и N 3 - бензол - этилацетат - уксусная кислота (50:25:25:2). II подвижная фаза: ацетон - вода - этилацетат (4:6:2). Проявляющие реагенты: N 1 - 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, 0,5-процентный раствор в н-гексане; N 2 - а) 4-(п-нитробензил)пиридин, 2-процентный раствор в ацетоне, б) тетраэтиленпентамин, 10-процентный раствор в ацетона. Стандартные растворы исследуемых метаболитов и фосфамида в хлороформе или этилацетате с содержанием вещества 100 мкг/мл. Если стандартный раствор фосфамида готовят из препаративной формы пестицида, то учитывают его процентное содержание в препарате. Срок хранения стандартных растворов до 1 месяца в холодильнике. ### 2.3. Приборы, аппаратура, посуда Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М с набором колб, ТУ 25-11-917-76, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей. Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73 или аналогичный. Колбы мерные, цилиндры, [ГОСТ 1770-74](https://bukva.ai/docs/gost-1770-74). Термостат. Пипетки, микропипетки, [ГОСТ 20292-74](https://bukva.ai/docs/standart-gost-20292-74). Стаканы, склянки химические емкостью 50 - 100 мл, ГОСТ 25336-82. Воронки химические, ГОСТ 25336-82. Воронки делительные, ГОСТ 25336-82. Колбы грушевидные, ГОСТ 25336-82 (для отгонки растворителей). Камера для хроматографирования, ГОСТ 25336-82. Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 25336-82. Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 25336-82. Баня водяная, ТУ 64-12350-76. Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки. Хроматографические пластинки "Силуфол" размером 15 x 15 или 20 x 20 см. Линейка, планиметр, миллиметровая бумага.
Измельчитель тканей, МРТУ 42-1505-63 или аналогичный.
### 2.4. Проведение определения ##### 2.4.1 Экстракция и очистка экстрактов Ткани внутренних органов (печень, почки, легкие, селезенка, сердце) Измельченную пробу тканей внутренних органов массой 2 г помещают в склянку с притертой пробкой и приливают 10 мл охлажденного ацетона или этилацетата и встряхивают на холоде в течение 30 - 40 минут. Затем растворитель отделяют от пробы, фильтруя его через безводный сернокислый натрий (2 - 3 г) в колбу для отгонки растворителей. Экстракцию повторяют еще дважды, используя свежие порции растворителя. Объединенный экстракт отгоняют при температуре 40 - 50 °C до объема раствора примерно 0,5 мл. Остаток раствора подсушивают безводным сернокислым натрием. Кровь. Пробу крови 0,5 - 1 мл вносили в пробирку, смоченную раствором лимоннокислого натрия, и приливали 10 мл хлороформа. Экстрагировали на холоде в течение 30 мин. Хлороформ отделяли от пробы, фильтровали через безводный сернокислый натрий (1 - 2). Экстракцию повторяли еще дважды, используя по 5 мл хлороформа, в течение 10 и 5 минут. Объединенные экстракты вносили в колбу для отгонки растворителей. Пробу крови можно поместить в ступку, куда насыпается 10 г безводного сернокислого натрия и растирается в течение 5 минут. Приливается 15 мл этилацетата и перемешивается содержимое ступки 20 минут. Этилацетат отделяется от массы и фильтруется через фильтр в колбу для отгонки растворителей. Сюда же фильтруются вторая и третья порции экстрагента (по 10 мл, экстракция по 5 минут). Растворитель отгоняется на ротационном испарителе при температуре 45 - 50 °C до остатка примерно 0,5 мл. Если остаток получился мутным, то его подсушивают безводным сернокислым натрием. Затем количественно переносят на хроматографическую пластинку. Моча. 25 мл исследуемой мочи помещают в колбу с притертой пробкой, приливают 2 - 5 мл хлористого натрия и 10 мл хлороформа или этилацетата. Осторожно встряхивают в течение 30 минут (1 экстракция), 10 минут (2 и 3 экстракции). Органический растворитель отделяют от пробы, объединяют и пропускают через слой безводного сернокислого натрия (до 10 г). Переносят растворитель в колбу для отгона растворителей и отгоняют его до объема 0,5 мл при температуре 70 °C (50 °C). Если необходимо, остаток подсушивают безводным сернокислым натрием. Количественно переносят на хроматографическую пластинку. ##### 2.4.2 Хроматографирование Пробу 0,5 мл количественно переносят на хроматографическую пластинку, нанося ее на высоте 5 см от нижнего края пластинки. Слева и справа от пробы наносят смеси стандартных растворов фосфамида и его метаболитов N 1 - 5, содержащие по 1, 2, 5 и 10 мкг каждого вещества. Помещают пластинку в камеру для хроматографирования, куда за 30 - 50 минут наливают одну из трех подвижных фаз для I хроматографирования. После окончания хроматографирования (высота подъема растворителей подвижной фазы 9 - 10 см) и после улетучивания следов растворителей на расстоянии 1,5 см от линии старта (по высоте) проводят горизонтальную линию, параллельную линии старта, и отрезают верхнюю часть пластинки. Обрабатывают ее одним из проявляющих реагентов, N 1 или 2. Если применяют ПР N 1, то после опрыскивания пластинку помещают в термостат при температуре 110 - 120 °C на 2 - 3 минуты. Фосфамид и метаболиты N 1 и N 5 проявляются в виде красно-кирпичного цвета пятен, метаболиты N 2, 3, 4 остались на нижней части пластинки. Если используют ПР N 2, то сначала обрабатывают пластинку раствором 4-(п-нитробензил)пиридина, помещают на 10 минут в термостат при 110 °C, а затем опрыскивают раствором тетраэтиленпентамина. Исследуемые вещества проявляются в виде синих пятен. Фосфамид и метаболиты N 1 и N 5 в подвижной фазе N 1 имеют R , равное 0,44, 0,51, 0,96 соответственно, в подвижной фазе f N 2 - 0,39, 0,28, 0,92, в подвижной фазе N 3 - 0,54, 0,66, и 0,92 соответственно. Нижнюю часть пластинки поворачивают на 90 °C и наносят справа от пробы 2 или три стандартных раствора метаболитов N 2, N 3, N 4. Проводят II хроматографирование в подвижной фазе ацетон - вода - этилацетат (4:6:2). После поднятия фронта растворителя на 10 см и улетучивания следов подвижной фазы обрабатывают одним из двух проявляющих реагентов, как описано выше. Величина R метаболитов f N 2, N 3, N 4 равна 0:0,50 и 0,50. Если метаболиты N 3 и N 4 находятся одновременно в пробе, то они будут определяться суммарно, если же они не присутствуют одновременно, то их можно идентифицировать по окраске пятна: метаболит N 3 имеет желтого
цвета пятна, а N 4 - кирпично-коричневого.
### 2.5. Обработка результатов анализа Содержание метаболитов и фосфамида на хроматограммах проб определяют путем сравнения интенсивности окрашивания пятен и их площади на хроматограммах проб и стандартных растворов. Площадь пятен измеряют с помощью планиметра или промасленной миллиметровой бумаги. Содержание вещества на хроматограмме может быть определено с помощью денситометра. Для расчета содержания исследуемых веществ в биопробе используют формулу, в которую вносят площадь пятна на хроматограмме стандарта, наиболее близкую по размерам к площади пятна на хроматограмме пробы. Расчет концентрации исследуемого вещества в биопробе проводят по формуле: C x S x V ст пр 2 X = --------------, S x V x P ст 1 где: X - концентрация исследуемого вещества в пробе, мкг/мл, мкг/г; C - концентрация вещества на хроматограмме стандарта, мкг; ст S - площадь пятна на хроматограмме стандарта, кв. мм; ст S - площадь пятна на хроматограмме пробы, кв. мм; пр V - хроматографический объем пробы, мл; 1 V - общий объем пробы, мл; 2
P - навеска пробы, г (или объем, мл).
## 3. Требования безопасности Необходимо соблюдать все требования безопасности при работе в химической лаборатории с ядовитыми веществами и электронагревательными приборами. ---