Временные методические указания по определению остаточных количеств азовита в зерне злаковых, зеленой массе растений, сахарной свекле, яблоках, почве и воде газожидкостной и тонкослойной хроматографией

(утв. Минздравом СССР 27.07.1991 № 5371-91)

ВРЕМЕННЫЕ МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ОПРЕДЕЛЕНИЮ ОСТАТОЧНЫХ КОЛИЧЕСТВ АЗОВИТА В ЗЕРНЕ ЗЛАКОВЫХ, ЗЕЛЕНОЙ МАССЕ РАСТЕНИЙ, САХАРНОЙ СВЕКЛЕ, ЯБЛОКАХ, ПОЧВЕ И ВОДЕ ГАЗОЖИДКОСТНОЙ И ТОНКОСЛОЙНОЙ ХРОМАТОГРАФИЕЙ

Настоящие Методические указания предназначены для санитарно-эпидемиологических станций и научно-исследовательских учреждений Минздрава РФ, а также ветеринарных, агрохимических, контрольно-токсикологических лабораторий Минсельхоза РФ и лабораторий других ведомств, занимающихся определением остаточных количеств пестицидов, регуляторов роста растений и биопрепаратов в продуктах питания, кормах и внешней среде.

Методические указания апробированы и рекомендованы в качестве официальных Группой экспертов при Госхимкомиссии по химическим средствам борьбы с вредителями, болезнями растений и сорняками.

1. Краткая характеристика препарата

Азовит — системный фунгицид, эффективен против широкого спектра грибковых заболеваний зерновых культур.

Действующее начало препарата: 1-(2,4-дихлорфенокси)-3,3-диметил-1-(1,2,4-триазол-1-ил)бутан-2-он.

                //\
               //  \

<pre class="legal-pre">    (CH ) C-C-CH-O-│   ││                        C  H  Cl N O .
       3 3    │    \\  / Cl                       14 15  2 3 2
             N┴N  Cl\\/
             │ ││                                Мол. масса 328,2.</pre>

         \ /
          N

В чистом виде — бесцветный порошок с Т. пл. 70 — 73 °C. -7 Упругость пара при 20 °C 5 x 10 мм рт. ст. Хорошо растворим в большинстве органических растворителей.

Препарат малотоксичен.

МДУ азовита в продуктах питания и ПДК в воде и почве еще не установлены.

2. Методика определения азовита в зерне, зеленой массе растений, сахарной свекле, яблоках, воде и почве хроматографическими методами

2.1. Основные положения

2.1.1 Принцип метода

Метод основан на извлечении азовита из анализируемого объекта этилацетатом, а из воды — хлороформом, очистке на колонке с оксидом алюминия и определении тонкослойной и газожидкостной хроматографией.

2.1.2 Метрологическая характеристика метода

Метрологическая характеристика метода представлена в таблице 1.

Таблица 1

МЕТРОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА МЕТОДА

Анализируемый объект	Нижний предел обнаружения в пробе, нг (ГЖХ)	Нижний предел определения, мг/кг, мг/л	Диапазон измеряемых концентраций, мг/кг, мг/л	Среднее значение определения с при n = 20, %	Стандартное отклонение S при n = 20, +/- %	Доверительный интервал среднего определения при n = 5	Размах варьирования R, %
Газожидкостная хроматография
Зерно	2	0,025	0,025 — 1,75	91,3	7,5	91,3 +/- 9,3	82,5 — 110
Зеленая масса	2	0,05	0,05 — 3,5	88,1	4,7	88,1 +/- 5,9	71 — 88
Сахарная	2	0,02	0,02 — 0,8	86,7	9,1	86,7 +/- 11,3	75,0 -
свекла Яблоки	2	0,02	0,02 — 0,8	86,9	8,4	86,9 +/- 10,5	99,4 75,0 — 89,1
Почва	2	0,025	0,025 — 1,75	84,3	9,6	84,3 +/- 13,3	70,3 — 99,0
Вода	2	0,001	0,001 — 0,07	89,1	7,8	89,1 +/- 10,9	79,5 — 105,0
Тонкослойная хроматография
Зерно	0,1	0,2	0,2 — 2,0	80	5,0	80 +/- 6	79,1 — 95,0
Зеленая масса	0,1	0,4	0,4 — 4,0	83	5,0	83 +/- 6	75 — 90
Сахарная свекла	2	0,04	0,04 — 0,8	89	11,0	89 +/- 14	75 — 100
Яблоки	2	0,04	0,04 — 0,8	88	8,0	88 +/- 10	75 — 100
Почва	0,1	0,2	0,2 — 2,0	81	9,0	81 +/- 13	70 — 90
Вода	0,1	0,004	0,004 — 0,04	88	6,0	88 +/- 8	80 — 90

2.1.3 Избирательность метода

Прочие пестициды определению не мешают. Избирательность метода обеспечивается сочетанием колонок (при ГЖХ) и системы подвижных растворителей (при ТСХ) различной полярности.

2.2. Реактивы и растворы

Ацетон, хч, ГОСТ 2603-79.

Гексан, чда, ТУ 6-09-3375-78.

Бензол, чда, ГОСТ 5955-75.

Хлороформ, чда, ГОСТ 20015-74, свежеперегнанный.

Этилацетат, хч, ГОСТ 22300-76, свежеперегнанный.

Четыреххлористый углерод, чда, ГОСТ 20288-74.

Сульфат натрия, хч, ГОСТ 4166-76, безводный.

Хлорид натрия, хч, ГОСТ 4333-77.

Уксусная кислота, чда, ГОСТ 61-75, ледяная.

Азотнокислое серебро, чда, ГОСТ 1277-75.

Бромфеноловый синий, чда, ТУ 6-09-1058-76.

Проявляющий реактив: смешать перед определением в равных объемах 0,4-процентный ацетоновый раствор бромфенолового синего с 2-процентным водным раствором азотнокислого серебра. Раствор хранят в темной склянке. Пригоден к употреблению в течение длительного времени. На каждое определение расходуется 3 — 5 мл раствора.

Оксид алюминия, II степени активности по Брокману, нейтральный, фирмы Лахема, ЧССР, или отечественный для хроматографии, МРТУ 6-09-5296-68.

Хроматон N-супер с 3% SE-30 (0,16 — 0,20 мм), готовый товарный носитель фирмы Хемапол, ЧССР.

Хроматон N-AW-DMCS (0,20 — 0,25 мм) с 5% XE-60, готовый товарный носитель фирмы Хемапол, ЧССР.

Газообразный азот из баллона, осч, ГОСТ 9293-74, с редуктором.

Водород, получаемый из генератора водорода или из баллона с водородом, ГОСТ 3022-80, с редуктором.

Воздух из баллона с редуктором или нагнетаемый компрессором.

Стандартные растворы азовита с содержанием 100 и 10 мкг/мл в ацетоне. Стандартные растворы стабильны при хранении в холодильнике в течение 6 месяцев.

Пластинки «Силуфол» производства ЧССР.

2.3. Приборы, аппаратура и посуда

Хроматограф «Цвет-106» или аналогичный прибор с термоионным детектором.

Хроматографические колонки стеклянные, длиной 110 и 150 см, внутренним диаметром 3 мм.

Хроматографические камеры с пришлифованными крышками, ГОСТ 25336-82, или аналогичные.

Ротационный вакуумный испаритель ИР-1М, ТУ 25-11-917-76, с набором колб.

Колбы круглодонные, ГОСТ 25336-82, вместимостью 500 и 50 мл.

Колбы плоскодонные, ГОСТ 25336-82, вместимостью 100 и 250 мл.

Колбы мерные, ГОСТ 1770-74У, вместимостью 100 мл.

Делительные воронки, ГОСТ 25336-82Е, вместимостью 1 л.

Цилиндры мерные, ГОСТ 1770-74.

Колбы грушевидные, ГОСТ 25336-82, вместимостью 50 мл.

Пипетки, ГОСТ 20292-74Е, вместимостью 10 и 1 мл с делениями.

Воронки химические, ГОСТ 25336-82Е.

Пульверизаторы стеклянные, ГОСТ 25336-82Е.

Стеклянная хроматографическая колонка с краном и оттянутым носиком, длиной 10 см, внутренним диаметром 1 см.

Аппарат для встряхивания, ТУ 64-1-1081-73.

Микрошприц на 10 мкл, ТУ 2-833-106-80, или аналогичный.

Микрошприц на 100 мкл или микропипетка на 0,1 мл, ГОСТ 20292-74.

Кофейная мельница для измельчения зерна.

Почвенное сито.

2.4. Подготовка к определению

Хроматографическую камеру заполняют системой подвижных растворителей бензол:этилацетат (9:1), гексан:ацетон (72:28) и бензол:ацетон (7:2) за 1 час до начала хроматографирования. Объем подвижного растворителя в камере должен находиться не выше чем 0,7 — 1,0 см над уровнем дна.

В стеклянную хроматографическую колонку помещают ватный тампон, затем вливают суспензию оксида алюминия в четыреххлористом углероде (при открытом кране). Когда сорбент заполнит всю колонку, дают стечь избытку растворителя, оставляя маленький слой его (0,2 — 0,3 см) на поверхности оксида алюминия. Кран закрывают. Колонка готова к работе.

2.5. Отбор проб

Отбор проб для анализа проводят в соответствии с «Унифицированными правилами отбора сельскохозяйственной продукции, продуктов питания и объектов окружающей среды для определения микроколичеств пестицидов», утвержденными Минздравом СССР 21 августа 1979 г., № 2051-79.

2.6. Подготовка проб к анализу

Зеленую массу растений измельчают ножницами на полоски длиной 0,5 — 0,7 см, подготавливают навеску массой 10 г. Зерно измельчают на кофейной мельнице до консистенции муки грубого помола и отбирают навеску массой 20 г. Сахарную свеклу трут на крупной терке и отбирают навеску массой 25 г, яблоки режут на небольшие кубики с величиной грани около 0,5 см и отбирают навеску с массой 25 г, почву просеивают через почвенное сито и отбирают навеску массой 20 г.

2.7. Проведение определения

    Зерно.  Навеску  размолотого на кофейной мельнице зерна (20 г)
помещают  в  плоскодонную  колбу  вместимостью  500  мл и проводят
экстракцию  азонита  этилацетатом  порциями  по  100 мл трижды при
помощи  механического  встряхивания  колбы  в  течение  30  минут.
Экстракт  фильтруют  в круглодонную колбу для отгона растворителей
вместимостью  500  мл  и  удаляют  этилацетат полностью при помощи

ротационного вакуумного испарителя. К сухому остатку добавляют 2 — 3 мл CCl и полученный раствор переносят на колонку с оксидом 4 алюминия, приготовленную к работе, как описано в пункте 2.4.

Открывают  кран  колонки  и  дают  раствору  полностью впитаться в
сорбент.   Колонку   промывают   15   мл   смеси  четыреххлористый
углерод - бензол - гексан  (1:1:1)   со  скоростью   1   кап./сек.
Равномерность   потока   растворителя   обеспечивается   вакуумом,
регулируемым  водоструйным  насосом.  Поменяв  приемную  колбу  на
грушевидную,   вместимостью   20   мл,   элюируют   азовит  20  мл
этилацетата.   С   помощью   ротационного   вакуумного  испарителя
полностью   удаляют   растворитель.   К  сухому  остатку  пипеткой
добавляют  1  мл  ацетона,  закрывают  колбу  пробкой  и тщательно
обмывают  растворителем  ее  стенки.  Далее  проводят  определение

азовита газожидкостной или тонкослойной хроматографией.

Зеленая масса растений. К 10 г измельченной ножницами зелени приливают 100 мл этилацетата. Экстракцию и остальные операции проводят, как при анализе зерна.

Сахарная свекла. Навеску измельченной сахарной свеклы (25 г) помещают в плоскодонную колбу вместимостью 500 мл и проводят экстракцию этилацетатом порциями по 75 мл при помощи механического встряхивания колбы в течение 30 минут. Все остальные операции проводят, как при анализе зерна.

Яблоки. К навеске измельченных яблок (25 г) добавляют 2 — 3 капли концентрированной HCl, массу перемешивают, экстрагируют азовит трижды этилацетатом порциями по 75 мл. Все остальные операции проводят, как описано выше.

Почва. Навеску подготовленной почвы (20 г) помещают в коническую колбу вместимостью 500 мл и тщательно увлажняют почву 10 мл дистиллированной воды. Экстракцию азовита проводят этилацетатом и остальные операции проводят, как при анализе зерна.

Вода. Воду (500 мл) помещают в делительную воронку вместимостью 1 л, добавляют 5 — 7 г (1 чайную ложку) хлорида натрия и 50 мл хлороформа. Смесь несколько минут энергично встряхивают. После разделения слоев нижний хлороформный слой сливают в плоскодонную колбу вместимостью 250 мл. Экстракцию азовита проводят еще два раза тем же количеством хлороформа. Объединенный хлороформный экстракт сушат над безводным сульфатом натрия (10 г). Раствор порциями фильтруют в грушевидную колбу вместимостью 50 мл. Каждую порцию фильтрата концентрируют с помощью ротационного вакуумного испарителя до объема 1 — 2 мл. Сульфат натрия промывают несколько раз небольшими порциями хлороформа, общим объемом 10 — 12 мл, и фильтрат также переносят в грушевидную колбочку. Из последней порции фильтрата растворитель удаляют полностью. К сухому остатку пипеткой добавляют 1 мл ацетона. Колбочку закрывают пробкой на шлифе и ее стенки тщательно обмывают растворителем. Далее проводят определение ГЖХ или ТСХ.

2.7.1 Определение газожидкостной хроматографией

При определении азовита ГЖХ из экстракта, полученного по п. 2.7, в хроматограф вводят 2 — 5 мкл полученного раствора.

Условия хроматографирования

                                  I колонка         II колонка

Хроматограф "Цвет 106" c ТИД     3% SE-30 на       5% XE-60 на
                                 хроматоне         хроматоне
                                 N-супер           N-AW-DMCS
                                 (0,16 - 0,20 мм)  (0,2 - 0,35 мм)
Длина и внутренний диаметр       150 x 3           110 x 3

колонки, см x мм

                                       -10               -10
Рабочая шкала электрометра       2 x 10    А       2 x 10    А
Скорость протяжки ленты          0,4 см/мин.       0,4 см/мин.

самописца

Скорость потока азота            60 мл/мин.        70 мл/мин.
Скорость потока воздуха          400 мл/мин.       400 мл/мин.
Скорость потока водорода         14 - 15 мл/мин.   14 - 15 мл/мин.
Температура колонки, °C          220               230
Температура испарителя, °C       220               230
Объем вводимой пробы             2 - 5 мкл         2 - 5 мкл
Время удерживания азовита        3 мин. 50 с       2 мин. 50 с
Линейный диапазон определения    2 - 70 нг         5 - 100 нг

Количественное определение проводят методом соотношения со стандартом по высоте пика. Серию стандартов готовят следующим образом: из стандартного раствора азовита с содержанием 10 мкг/мл в градуированные пробирки пипеткой вносят 0,55; 1,0; 1,5; 2,0 и 3,0 мл раствора, что соответствует 5, 10, 15, 20 и 30 мкг, а из стандартного раствора с содержанием 100 мкг/мл отбирают 0,65 и 0,7 мл, что соответствует 50 и 70 мкг. Доводят растворы ацетоном до 10 мл. Пробирки закрывают пробками и тщательно перемешивают растворы. В хроматограф вводят по 2 — 5 мкл полученных растворов. Расчет проводят по стандартному раствору, высота пика которого наиболее близка высоте пика рабочей пробы.

2.7.2 Определение тонкослойной хроматографией

    Зерно.   При   определении   азовита  в  зерне  ТСХ  требуется
дополнительная  очистка  двухмерной хроматографией. На пластинку в
левом  нижнем  углу (1,5 - 2 см от края) наносят 25 мкл очищенного
на  колонке  экстракта.  Пластинку  помещают  в  камеру с системой
подвижных   растворителей  бензол - этилацетат  (9:1).   Развивают
хроматограмму  на  высоте  10  см.  Пластинку вынимают из камеры и
высушивают на  воздухе. Повернув пластинку на 90 градусов, в левом
нижнем  углу  (отступив  от  краев  на  1,5  -  2,0 см) наносят  3
стандарта  (0,1;  0,3  и  0,5  мкг). Погружают пластинку в систему
гексан - ацетон (72:28) и  дают  фронту  растворителя подняться на
высоту  10  см.  Хроматограмму  сушат  на  воздухе  и  опрыскивают
проявляющим  реагентом  до  появления  синего  фона.  Фон  снимают

опрыскиванием пластинки 0,5-процентным раствором лимонной кислоты.

Азовит  проявляется  на  хроматограмме в виде темно-синих пятен на
лимонно-желтом  фоне  с  R   =  0,3  +/-  0,02.  Линейный диапазон

                      f

определения 0,1 — 1,0 мкг. Пятна стабильны в течение длительного времени.

    Зеленая  масса. Для зеленой массы растений определение азовита
методом  тонкослойной  хроматографии  проводят  обычным  путем. На
пластинку "Силуфол" наносят  50  мкл (0,025 мл)  полученного по п.

2.7 раствора. Рядом наносят ряд стандартов с содержанием 0,1;

0,3;    0,5...1,0    мкг    азовита.    Пластинку    помещают    в
хроматографическую  камеру  с  системой  подвижных   растворителей
бензол - этилацетат  (9:1)  или  гексан - ацетон   (72:28).  После
окончания хроматографирования  пластинку  сушат на воздухе и затем
опрыскивают проявляющим реагентом до появления  синего  фона.  Фон
снимают 0,5-процентным раствором лимонной кислоты. На  желтом фоне
появляются  темные  пятна  азовита  с  R   0,33 +/- 0,05  в первой

                                    f

системе и R 0,30 +/- 0,02 — во второй. Пятна стабильны в течение f длительного времени. Линейность определения сохраняется в пределах 0,1 — 1,0 мкг. При более высокой концентрации хроматографируют Меньшую аликвотную часть раствора.

Сахарная свекла, яблоки. На пластинку «Силуфол» наносят 0,1 мкл экстракта, полученного по п. 2.7. Рядом наносят серию

стандартов  с  содержанием  0,1;   0,3;   0,5...1,0  мкг  азовита.
Хроматограмму развивают  в  системе  бензол - этилацетат (9:1) или
гексан - ацетон  (72:28).  Проявляют  хроматограмму,  как  описано

выше.

Почва. Для определения азовита в почве ТСХ требуется очистка экстракта, полученного по п. 2.7 методом двухмерной

хроматографии.  На  пластинку  в  левом нажнем углу (1,5 - 2 см от
края)    наносят   50   мл   экстракта.   Пластинку   помещают   в
хроматографическую   камеру  с  системой  подвижных  растворителей
гексан:ацетон  (72:28).  Развивают  хроматограмму на высоту 10 см.
Пластинку  вынимают  из  камеры  и высушивают на воздухе. Повернув
пластинку на 90 градусов, в  левом нижнем  углу (отступив от краев
на  1,5  - 2,0 см)  наносят  3  стандарта  (0,1; 0,5 и  0,3  мкг).
Погружают  пластинку  в  систему  бензол:этилацетат  (9:1)  и дают

фронту растворителя подняться на высоту 10 см. Хроматограмму сушат

на  воздухе  и  опрыскивают проявляющим реагентом, как описано для
зерна и  зеленой массы,  азовит проявляется синим пятном на желтом
фоне с R  0,35 +/- 0,05.

    f

Вода. Из подготовленного по п. 2.7 экстракта на

хроматографическую  пластинку "Силуфол" микрошприцем  на  100  мкл
наносят  аликвотную часть раствора 50 - 100 мкл (0,05 - 0,1 мл при

нанесении пипеткой). Справа и слева от рабочей пробы наносят серию

стандартов  с  содержанием  0,1;  0,2;  0,3...1 мкг. Хроматограмму
развивают    в    одной    из   систем   подвижных   растворителей
бензол:этилацетат  (9:1),  гексан:ацетон (72:28) или бензол:ацетон
(7:2).  После  высушивания  хроматограмму обрабатывают проявляющим
реактивом,  как описано выше. Азовит проявляется на хроматограммах
с  R  0,33 +/- 0,05 в первой системе подвижных растворителей; 0,30

f

2.8. Обработка результатов анализа

2.8.1 При газохроматографическом определении содержание азовита в анализируемой пробе (X) в мг/кг вычисляют по формуле:

                         C   x H   x V
                          ст    рп

X = ------------- мг/кг,

                         H   x V  x A
                          ст    а

где:

C — количество стандарта, вводимого в хроматограф, нг; ст

H — высота пика рабочей пробы, мм; рп

H — высота пика стандарта, мм; ст

V — общий объем рабочего раствора, мл;

V — объем аликвоты, вводимой в хроматограф, мкл; а

A — навеска анализируемого образца, г.

Если при введении в хроматограф получаются слишком большие пики, к рабочему раствору пипеткой добавляют известное количество ацетона и анализируют более разбавленный раствор.

2.8.2 При определении тонкослойной хроматографией

Количественное определение азовита в пробе проводят путем сравнения площади и интенсивности окраски пятен рабочей пробы и серии стандартов. При большом количестве азовита на пластинку наносят меньшую аликвотную часть раствора.

Содержание азовита в анализируемой пробе (X) в мг/кг вычисляют по формуле:

                        C x V

X = ------ мг/кг, V x A а

где:

C — количество азовита, найденное в хроматографируемой пробе, мкг;

V — общий объем раствора, мл;

V — объем аликвоты, нанесенной на хроматографическую a пластинку, мл (при нанесении всей пробы V = V ); a

3. Требования безопасности

Соблюдать требования безопасности, принятые для работы с легковоспламеняющимися жидкостями и пестицидами.

---