Методические указания по хроматографическому измерению содержания фосфамида на коже
(утв. Минздравом СССР 28.09.1989 № 5137-89)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32).
Утверждаю
Заместитель Главного
государственного
санитарного врача СССР
В. И. Чибураев
28 сентября 1989 г. № 5137-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМУ ИЗМЕРЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ ФОСФАМИДА НА КОЖЕ
S
(CH O) PSCH CONHCH М.м. 229,2 3 2 2 3
0,0-Диметил-S-(N-метилкарбамоилметил) дитиофосфат.
Товарное название: фосфамид, диметоат, рогор, БИ-58. Химически чистый фосфамид — белое кристаллическое вещество с Т. пл. -8 49,9 — 50,9 °C. Давление насыщенных паров при 20 °C 8,5 х 10 мм рт. ст. -3
(1,2 х 10 Па). Хорошо растворим в воде - 3,9%, в ацетоне, хлороформе, метаноле, плохо в алкановых углеводородах. При нагревании изомеризуется.
Достаточно быстро гидролизуется в щелочной среде, более устойчив в кислой.
1. Характеристика методики
Методика основана на экстракции фосфамида из пробы органическим растворителем, очистке и последующем определении методами газожидкостной или тонкослойной хроматографии.
В качестве смывающей жидкости используется дистиллированная вода.
Диапазон измеряемого содержания — 0,008 — 0,4 мг/кв. см.
Определению не мешают диазинон, циклоат, эптам, метоксихлор, линдан.
Граница суммарной погрешности не превышает +/- 20%.
ПДУ фосфамида на коже 0,02 мг/кв. см.
2. Реактивы и растворы
Стандартный раствор № 1 с содержанием 1 мг/мл готовят растворением 100 мг фосфамида в мерной колбе на 100 мл. Соответствующим разведением в гексане готовят стандартный раствор № 2 с содержанием фосфамида 0,1 мг/мл. Растворы устойчивы 1 месяц.
Азот, водород в баллонах с редукторами.
Азот ОСЧ, ГОСТ 9293-74, содержание кислорода не более 0,003% (для работы на ЭЗД или ДПР).
Насадка хроматографической колонки:
Для ТИД хроматон N-AW-DMCS с 5% SE-30, для ЭЗД (или ДПР) хроматон N-AW-DMCS с 5% ХЕ-60, зернение носителей 0,16 — 0,2 мм.
Хлороформ, х.ч., ТУ 6-09-4263-76.
Лимонная кислота, х.ч., ГОСТ 3652-69, 2-процентный раствор.
Соляная кислота, х.ч., ГОСТ 3118-77,0,1 н раствор.
Бромфеноловый синий, чда, ТУ 6-09-1058-76.
Гидроксид натрия, х.ч., ГОСТ 4328-77, 20-процентный раствор.
Натрий сернокислый безводный, чда, ГОСТ 4166-76.
Серебро азотнокислое, х.ч., ГОСТ 1277-75, 0,5-процентный водноацетоновый раствор (1 часть воды + 3 части ацетона).
Хлористый палладий, ч., МРТУ 6-09-1964-72.
ПР № 1 — бромфеноловый синий. Взвешивают 50 мг бромфенолового синего, растворяют в 10 мл ацетона и затем разбавляют до 100 мл раствором азотнокислого серебра. Срок хранения в холодильнике до 1 месяца.
ПР № 2 — хлористый палладий. Взвешивают 0,2 г хлористого палладия, вносят в колбочку вместимостью 100 мл, приливают 2 капли концентрированной соляной кислоты, помещают колбу в водяную баню при 60 — 70 °C на 10 — 15 мин. Периодически встряхивают до полного растворения содержимого колбы. Доводят объем раствора до 100 мл водой. Срок хранения в холодильнике до 1 месяца.
ПР № 3 — 2,6-дибром-N-хлорхинонимин, х.ч., 0,5-процентный раствор в гексане.
ПР № 4 — азотнокислое серебро. Взвешивают 1 г азотнокислого серебра и растворяют в 99 мл воды. Опрыскивают пластинки после гидролиза 20-процентным раствором гидроксида натрия. Хранят реактив в холодильнике до 2 недель.
Подвижная фаза: хлороформ-ацетон-гексан (3:1:1), гексан-ацетон (3:2) и хлороформ.
Натрий хлористый, х. ч., ГОСТ 4233-77, 10-процентный раствор.
Вата гигроскопическая, обезжиренная кипячением в дистиллированной воде в течение 30 мин. и высушенная.
Алюминия оксид, II степени активности для хроматографии, ТУ 6-09-3916-75.
Кальций сернокислый безводный, чда, ГОСТ 3210-74.
Хроматографические пластинки «Силуфол», 15 х 15 см.
3. Приборы и посуда
Газовый хроматограф с термоионным (ТИД) или электроннозахватным (ЭЗД) (или детектором постоянной скорости рекомбинации (ДПР)) детектором.
Ротационный вакуумный испаритель ИР-IM с набором колб, ТУ 2811-917-74, или аналогичный аппарат для отгонки растворителей.
Колбы мерные, цилиндры, ГОСТ 1770-74.
Пипетки, микропипетки, ГОСТ 20292-74.
Склянки химические вместимостью 50 — 100 мл, ГОСТ 13394-72.
Воронки химические, ГОСТ 8613-75.
Воронки делительные, ГОСТ 8613-75.
Колбы грушевидные (для отгонки растворителей), ГОСТ 10394-72.
Хроматографическая камера, ГОСТ 10565-75.
Камера для опрыскивания пластинок, ГОСТ 10565-75.
Пульверизатор стеклянный, ГОСТ 10391-74.
Стеклянные капилляры для нанесения проб на хроматографические пластинки.
Стеклянные пластинки, размер 9 x 12 или 12 х 15 см.
Колонки стеклянные хроматографические длиной 1 м и внутренним диаметром 3 мм.
4. Проведение измерения
Условия проведения смыва
Смыв с кожных покровов (5 x 5) см проводят способом обмыва. Для этого в фарфоровую чашку наливают 20 мл воды. Ватным тампоном 0,3 г, смоченным в воде, обмывают участок поверхности кожи (5 x 5) см сверху вниз. При этом тампон несколько раз опускают в чашку с водой. Одновременно проводят смыв с кожи у рабочих, не контактирующих с фосфамидом.
Условия анализа
Ватный тампон тщательно отжимают стеклянной палочкой, переносят на воронку с фильтром и промывают дважды по 20 мл дистиллированной водой. Растворы объединяют, фильтруют, подкисляют 0,1 и раствором HCl до pH 4 — 5, раствор перемешивают, приливают 30 мл 10% раствора хлористого натрия и дважды экстрагируют в делительной воронке 20 мл хлороформа в течение 30 — 40 мин. Хлороформ отделяют. Хлороформные экстракты объединяют, пропускают через безводный сернокислый натрий, фильтруют. Отгоняют растворитель примерно до 0,2 — 0,5 мл. Остаток испаряют при комнатной температуре досуха. К сухому остатку приливают 1 мл гексана.
Газохроматографический анализ
Определение фосфамида проводят с использованием термоионного детектора или детектора постоянной скорости рекомбинации. В случае применения термоионного детектора стеклянную хроматографическую колонку заполняют хроматоном N-AW-DMCS с 5% жидкой фазы SE-30. При анализе фосфамида с использованием детектора постоянной скорости рекомбинации применяют хроматон N-AW-DMCS с 5% ХЕ-60.
Кондиционирование колонки проводят в течение 12 часов при температуре термостата 200 °C при отключенном детекторе.
Для анализа берут 1 — 2 мкл пробы. Для количественного определения используют метод абсолютной калибровки. Для этого готовят градуировочные растворы с содержанием 0,2 мкг/мл, 0,4 мкг/мл, 0,8 мкг/мл, 2 мкг/мл, 10 мкг/мл фосфамида соответствующим разведением стандартного раствора № 2. Срок хранения градуировочных растворов 2 дня.
На основании полученных данных строят градуировочный график зависимости площади пика от заданной концентрации. Площадь пика измеряют умножением высоты на ширину, измеренную на половине высоты, полученной из пяти параллельных определений.
Условия калибровки и анализа должны быть идентичны.
ТИД ЭЗД или ДПР Температура термостата колонок 180 °C 180 °C Температура испарителя 230 °C 230 °C Температура термостата детектора - 190 °C Скорость потока газа-носителя, мл/мин. 20 - 25 40 - 60 Скорость потока водорода, мл/мин. 20 - воздуха, мл/мин. 240 240 Скорость движения диаграммной ленты 240 мм/ч 240 мм/ч Время удерживания фосфамида, мин. 2,1 4,8 P = 0 аналога (метаболит) 1,6 мин. 5,9 мин. Время выхода растворителей, мин. 0,3 0,3 - 0,5.
Анализ методом тонкослойной хроматографии
Готовят хроматографические пластинки с оксидом алюминия. Взвешивают 50 г оксида алюминия, просеянного через сито 100 меш., прибавляют 5 г безводного сернокислого кальция и 75 мл воды. Встряхивают в колбе до образования однородной массы. Наливают тонким слоем на 10 стеклянных пластинок размером (9 x 12) см или 8 пластинок (12 x 15) см. Сушат на воздухе около 10 — 12 ч. Хранят в эксикаторе. 0,1 мл анализируемой пробы наносят на хроматографическую пластинку на линию старта. Из стандартного раствора № 2 готовят градуировочные растворы с содержанием фосфамида 5 мкг/мл, 10 мкг/мл, 20 мкг/мл, 40 мкг/мл, 80 мкг/мл, 100 мкг/мл. Слева и справа от пробы наносят 0,1 мл градуировочных растворов, что соответствует содержанию 0,5 мкг, 1 мкг, 2 мкг, 4 мкг, 8 мкг, 10 мкг фосфамида. Диаметр пятна не должен превышать 5 мм. Пластинку помещают в хроматографическую камеру, куда предварительно за 15 — 20 мин. наливают одну из подвижных фаз хлороформ-ацетон-гексан (3:1:1), гексан-ацетон (3:2), хлороформ. После поднятия фронта растворителя на высоту 10 — 12 см пластинку извлекают из камеры, оставляют до улетучивания растворителей, а затем применяют один из проявляющих реагентов.
Если хроматографирование проводят на пластинках "Силуфол", то используют проявляющие реагенты N 1 или 2; или 3. После опрыскивания пластинки ПР N 1, через 15 - 20 мин. опрыскивают 2% раствором лимонной
кислоты. Фосфамид и его метаболит P = 0 аналог окрашиваются в синий цвет на
светло-желтом фоне пластинки. Если применяют ПР N 2, то сразу же после
опрыскивания фосфамид окрашивается в светло-коричневый цвет (иногда с
желтоватой серединой). После опрыскивания ПР N 3 пластинку следует
поместить в сушильный шкаф при 110 - 115 °C на 2 - 3 мин. На светлом фоне
пластинки зона локализации фосфамида окрашивается в ярко-красный цвет, а
P = 0 аналога - в рябиново-желтый. Величина R фосфамида = 0,55 - 0,6, R
f f
P = 0 аналога = 0,2 — 0,25.
Если хроматографирование проводили на пластинках с оксидом алюминия в подвижной фазе — хлороформ, то используют проявляющий реагент ПР № 4. После улетучивания следов хлороформа пластинку опрыскивают 2-процентным раствором гидроксида натрия, а после подсушивания слоя — ПР № 4. Помещают в сушильный
шкаф при 105 - 110 °C на 5 минут. Зона локализации фосфамида и некоторых его метаболитов окрашивается в серо-черный цвет. Величина R фосфамида =
f
0,4, карбметоксиметилдитиофосфата = 0,5, диметилдитиофосфорной кислоты = 0,3, R P = 0 аналога = 0,15 - 0,2.
f
Для количественной оценки с помощью промасленной миллиметровой бумаги измеряют размеры и вычисляют площадь пятна фосфамида на хроматограмме пробы и стандарта, наиболее близкого по размерам к пятну пробы.
Расчет концентрации
Концентрацию фосфамида в мг/кв. см (C) рассчитывают по формуле:
Q
где Q — количество фосфамида во всей пробе, мг;
S — площадь исследуемой части тела, кв. см.