Методические указания по хроматографическому измерению содержания тестостерона и эфиров тестостерона — пропионата, фенилпропионата, изокапроната, каприната и энантата на коже

(утв. Минздравом СССР 28.09.1989 № 5132-89)

МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМУ ИЗМЕРЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ ТЕСТОСТЕРОНА И ЭФИРОВ ТЕСТОСТЕРОНА — ПРОПИОНАТА, ФЕНИЛПРОПИОНАТА,

Таблица 20

Наименование вещества	Структурная формула							М.м.	Т.пл., °C	Агрегатное состояние
Тестостерон (Т)	// O	/ \ \ /	/ \	/ \ / R	\ /	s__ \ /	| OH| | | | | | >|	288,41	151 — 152	Белый мелкокристаллический порошок
Тестостерона	R-CO-CH -CH							344,47	118 — 119	-«-»
пропионат (ТП)	2 3
Тестостерона фенилпропионат	R-CO-(CH ) -C H 2 2 6 5							420,57	112 — 113	-«-»
(ТФП)
Тестостерона изокапронат (ТИК)	CH / 3 R-CO-(CH ) -CH 2 2 \ CH 3							386,56	79 — 80	-«-»
Тестостерона капринат (ТК)	R-CO-(CH ) -CH 2 3 3							442,66	53 — 54	-«-»
Тестостерона энантат (ТЭ)	R-CO-(CH ) -CH 2 5 3							400,59	35 — 37,5	Парафинообразная масса

1. Характеристика методики

Определение основано на хроматографировании анализируемых веществ в тонком слое сорбента с последующим проявлением зон локализации раствором фосфорномолибденовой кислоты и денситометрировании окрашенных зон.

В качестве смывающей жидкости используется этиловый спирт.

Определение избирательно на стадиях сушки, просеивания и фасовки.

Диапазон измеряемого содержания Т 0,0001 — 0,01 мг/кв. см, ТП, ТФП, ТИК, ТКиТЭ — 0,0004 — 0,01 мг/кв. см.

Граница суммарной погрешности измерения не превышает +/- 25%.

Рекомендуемый предельно допустимый уровень (ПДУ) загрязнения кожи: Т — 0,0003 мг/кв. см; ТП, ТФП, ТИК, ТК и ТЭ — 0,001 мг/кв. см.

2. Реактивы и растворы

Т — перекристаллизованный из изопропилового спирта.

ТП — ФС 42-1119-77.

ТФП — ВФС 42-0563-76.

ТИК — ВФС 42-0562-76.

ТК — ВФС 42-0561-76.

ТЭ — ФС 42-1545-80.

Спирт этиловый ректификат, ГОСТ 5963-67.

Ацетон, х.ч., ГОСТ 2603-79.

Хлороформ, х.ч., ГОСТ 20015-74.

Система растворителей: смесь хлороформа с ацетоном в соотношении 9:1 (по объему).

Проявляющий раствор — 10% раствор фосфорно-молибденовой кислоты в ацетоне.

Основные растворы Т, ТП, ТФП, ТИК, ТК и ТЭ, содержащие 2,5 мг/мл, готовят растворением 0,2500 г каждого вещества в этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл.

Стандартные растворы тестостеронов с содержанием 1 мг/мл готовят соответствующим разбавлением основного раствора этиловым спиртом.

Марлевые тампоны.

3. Приборы и посуда

Камера хроматографическая.

Пластинки силуфол размером (7,5 х 15,0) см.

Пульверизатор стеклянный.

Пипетки вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл с делениями, ГОСТ 20292-74.

Микропипетки вместимостью 0,1 мл с оттянутым на капилляр концом.

Стаканы лабораторные стеклянные вместимостью 25 мл, ГОСТ 10394-72.

Колбы мерные вместимостью 25, 50 и 100 мл, ГОСТ 1770-74.

Пробирки с притертыми пробками вместимостью 10 мл.

Остродонные колбы вместимостью 25 мл с нормальным шлифом.

Вакуумная установка.

Баня водяная.

Сушильный шкаф.

Пинцет медицинский.

Денситометр.

4. Проведение измерения

Трафарет размером (5 х 5) см накладывают на исследуемый участок кожного покрова работающего. Двумя марлевыми тампонами, смоченными в спирте, проводят смыв, затем сухим тампоном промокают смываемый участок кожи.

Все тампоны складывают в пробирку или стакан. Одновременно проводят контрольный смыв с кожи у работающих, не контактирующих с тестостеронами.

Тампоны тщательно промывают двумя порциями спирта по 5 мл каждая, сливают полученный раствор в остродонную колбу и упаривают под вакуумом при температуре 60 — 70 °C. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл спирта и используют для анализа.

При хроматографировании смыва с чистой кожи на пластинке силуфол образуется слабо окрашенная полоса. С целью исключения влияния «фона» на результаты анализа, для приготовления шкалы стандартов используют спирт, полученный после смыва с чистой кожи.

Для очистки сорбента пластинку помещают в камеру для хроматографирования с системой растворителей хлороформ-ацетон (9:1) и закрывают крышкой. Для насыщения камеры парами подвижной фазы достаточно 10 минут. Край пластинки погружают в растворитель подвижной фазы не более чем на 0,5 см. После того как подвижная фаза дойдет до конца пластинки, последнюю вынимают из камеры и сушат на воздухе 3 — 5 минут. На подготовленную таким образом пластинку, на линию старта (от края 1 см), наносят при помощи микропипетки по 0,05 мл растворов пробы и шкалы стандартов (размер пятен не должен превышать 0,5 см). Пластинку высушивают на воздухе в течение 3 минут и помещают в ту же камеру с системой растворителей. После поднятия подвижной фазы на высоту 10 см от стартовой линии пластинку из камеры извлекают и оставляют на воздухе под вытяжным шкафом до полного испарения растворителей (3 — 5 минут). Затем пластинку опрыскивают проявляющим раствором и помещают в сушильный шкаф на 5 минут при температуре 80 °C. Анализируемые вещества проявляются в виде синих пятен на желтом фоне. Окраска пятен устойчива в течение суток.

    Количественное   определение  анализируемых  веществ  на  хроматограмме
оценивают  денситометрически  сравнением  пятен проб и шкалы стандартов. R

                                                                      f

тестостерона составляет 0,2; ТП — 0,57; ТФП — 0,55; ТИК — 0,57; ТК — 0,57 и ТЭ — 0,63.

Шкалу стандартов с содержанием Т 5-25-50-100-300-500 мкг/мл и ТП, ТФП, ТИК, ТК и ТЭ 25-50-100-300-500 мкг/мл готовят соответствующим разведением стандартного раствора № 1, это соответствует содержанию Т 0,25 мкг, 1,25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг, 25 мкг, ТП, ТФП, ТИК, ТК и ТЭ 1,25 мкг, 2,5 мкг, 5 мкг, 25 мкг.

Содержание анализируемых веществ в мг/кв. см кожи (C) вычисляют по формуле:

                               Q

C = -, S

где Q — количество вещества во всей пробе, мг;

S — площадь исследуемой части тела, кв. см.

---