Методические указания по хроматографическому измерению содержания метилтестостерона и метандростенолона на коже
(утв. Минздравом СССР 28.09.1989 № 5122-89)
Примечание
Документ включен в Перечень основных действующих нормативно-методических документов по методам лабораторного и инструментального контроля в системе государственного санитарно-эпидемиологического нормирования (Письмо Роспотребнадзора от 02.12.2008 № 01/14262-8-32).
28 сентября 1989 г. № 5122-89
МЕТОДИЧЕСКИЕ УКАЗАНИЯ ПО ХРОМАТОГРАФИЧЕСКОМУ ИЗМЕРЕНИЮ СОДЕРЖАНИЯ МЕТИЛТЕСТОСТЕРОНА И МЕТАНДРОСТЕНОЛОНА НА КОЖЕ
CH CH
/ \ 3 | 3
| H C | / \ | _____ | |_ OH |
|---|
/ \ 3 /|\ H /|\ /
| / \ | / | \ H | / | \ / H |
|---|
//\ //\ /
O \ // \ /
C H O М.м. 302,5
20 30 2
17альфа-Метиландростен-4-ол-17бета-он-3 (метилтестостерон)
CH CH
/ \ 3 | 3
| H C | / \ | _____ | |_ OH |
|---|
// \ 3 /|\ H /|\ /
| // \ | / | \ H | / | \ / H |
|---|
//\ //\ /
O \ // \ /
C H O М.м. 300,4
20 28 2
17альфа-Метиландростадиен-1,4-ол-17бета-он-3 (метандростенолон)
| Наименование вещества | Агрегатное состояние | Т. пл., °C | Растворимость |
|---|---|---|---|
| Метилтестостерон (МТ) Метандростенолон (МАС) | Белый кристаллический порошок Белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок | 162 — 168° 162 — 170° | Практически нерастворим в воде, легко растворим в 95% этаноле Очень мало растворим в воде, легко растворим в 95% этаноле |
1. Характеристика методики
Определение основано на хроматографическом выделении анализируемых веществ в тонком слое сорбента с последующим проявлением хроматограмм раствором фосфорномолибденовой кислоты и денситометрировании окрашенных зон.
В качестве смывающей жидкости используется этиловый спирт.
Диапазон измеряемого содержания в смыве МТ 0,00014 мг/кв. см — 0,0014 мг/кв. см; МАС от 0,006 до 0,06 мг/кв. см.
Определение избирательно на стадиях сушки, просеивания и фасовки.
Граница суммарной погрешности измерения не превышает +/- 25%.
ПДУ концентраций МТ на коже 0,0003 мг/кв. см; МАС — 0,002 мг/кв. см.
2. Реактивы и растворы
Углерод четыреххлористый, ГОСТ 20228-74, х.ч.
Фосфорномолибденовая кислота, ТУ 6-09-3540-78, ч.д.а., 10-процентный раствор.
Кислота серная, ГОСТ 4204-77, х.ч.
Система растворителей: смесь четыреххлористого углерода с ацетоном в соотношении 4:1 (по объему).
Проявляющий реактив: готовят перед употреблением, смешивая 10 мл 10-процентного раствора фосфорномолибденовой кислоты с 0,1 мл концентрированной серной кислоты.
Основные стандартные растворы МТ и МАС с концентрацией 1 мг/мл готовят растворением 0,1 г каждого вещества в этиловом спирте в мерной колбе вместимостью 100 мл. Растворы устойчивы в течение месяца.
Стандартные растворы с концентрациями МТ 10 — 20 — 40 — 60 — 80 — 100 мкг/мл, МАС — 50 — 100 — 200 — 300 — 400 — 500 мкг/мл готовят путем соответствующего разбавления 95% этанолом исходных стандартных растворов. Растворы устойчивы в течение 7 дней.
3. Приборы, аппаратура, посуда
Камера для хроматографирования, ГОСТ 10565-75, размером 95 x 165 мм.
Хроматографические пластинки «Силуфол» UV-254, размером 75 x 150 мм.
Микропипетки, ГОСТ 1770-74, вместимостью 0,1 мл.
Пипетки, ГОСТ 1770-74, вместимостью 1, 2, 5 и 10 мл с делениями.
Стаканы лабораторные стеклянные, ГОСТ 10394-74, вместимостью 25 мл.
Колбы мерные, ГОСТ 1770-74, вместимостью 25 и 100 мл.
Пробирки градуированные с пришлифованными пробками, ГОСТ 10515-75, вместимостью 15 мл.
Колбы грушевидные, ГОСТ 10394-72, вместимостью 25 мл.
4. Проведение измерения
Трафарет размером 36 кв. см накладывают на исследуемый участок кожного покрова работающего двумя марлевыми тампонами, смоченными в спирте, проводят смыв, затем сухим тампоном промокают смываемый участок кожи. Все тампоны складывают в пробирку или стакан. Одновременно проводят контрольный смыв с кожи у работающих, не контактирующих с МТ и МАС.
Тампоны тщательно промывают двумя порциями спирта по 5 мл каждая, сливают полученный раствор в грушевидную колбу и упаривают под вакуумом при температуре 60 — 70 °С. Сухой остаток растворяют в 0,5 мл спирта и используют для анализа.
При хроматографировании смыва с чистой кожи на пластинке «Силуфол» образуется слабо окрашенная полоса. С целью исключения влияния «фона» на результаты анализа для приготовления шкалы стандартов используют спирт, полученный после смыва с чистой кожи.
Для очистки сорбента пластинку помещают в камеру для хроматографирования с системы растворителей четыреххлористый углерод-ацетон (4:1) и закрывают крышкой. Край пластинки погружают в растворитель подвижной фазы не более чем на 0,5 см. После того как подвижная фаза дойдет
до конца пластинки, последнюю вынимают из камеры и сушат на воздухе 3 - 5
мин. На подготовленную таким образом пластинку, на линию старта (от края 1
см), наносят при помощи микропипетки по 0,05 мл растворов пробы шкалы
стандартов (размер пятен не должен превышать 0,5 см). Пластинку высушивают
на воздухе в течение 3 мин. и помещают в ту же камеру с системой
растворителей. После поднятия подвижной фазы на высоту 10 см от стартовой
линии пластинку из камеры вынимают и оставляют на воздухе под вытяжным
шкафом до полного испарения растворителей (3 - 5 мин.). Затем пластинку
опрыскивают проявляющим реактивом помещают в сушильный шкаф на 2 мин. при
температуре 100 °С. Анализируемые вещества проявляются на хроматограмме в
виде синих пятен на желтом фоне с R МТ = 0,38 +/- 0,02; R МАС =
f f
0,28 +/- 0,02.
Количественное измерение содержания МТ и МАС в анализируемом объеме проводят по отношению интегральных значений содержаний вещества в пробах и «свидетелях» с помощью денситометра «БИАН-170».
Содержание МТ и МАС в мг/кв. см (C) вычисляют по формуле:
Q
где Q — количество вещества во всей пробе, мг;
S — площадь исследуемой части тела, кв. см.